1、第四章第四章 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定數(shù)年后，美國(guó)科學(xué)家數(shù)年后，美國(guó)科學(xué)家 Moore和和 Stein 改進(jìn)了改進(jìn)了Sanger 的方法，完成了第一個(gè)酶蛋白的方法，完成了第一個(gè)酶蛋白核核糖核酸酶的序列分析。糖核酸酶的序列分析。1955年英國(guó)科學(xué)家年英國(guó)科學(xué)家FSanger發(fā)表了胰島素發(fā)表了胰島素的全部氨基酸排列順序，開創(chuàng)了研究蛋白質(zhì)的全部氨基酸排列順序，開創(chuàng)了研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的新紀(jì)元。這是分子生物學(xué)發(fā)展進(jìn)一級(jí)結(jié)構(gòu)的新紀(jì)元。這是分子生物學(xué)發(fā)展進(jìn)程中的一個(gè)重要突破。程中的一個(gè)重要突破。第第四四章章 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)序列測(cè)定的基本策略和步驟蛋白質(zhì)序列測(cè)

2、定的基本策略和步驟第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析 第三節(jié)第三節(jié) 末端氨基酸的測(cè)定末端氨基酸的測(cè)定 第四節(jié)第四節(jié) 肽鏈的專一性水解和肽段的分離純化肽鏈的專一性水解和肽段的分離純化 第五節(jié)第五節(jié) 肽段的序列測(cè)定肽段的序列測(cè)定 第六節(jié)第六節(jié) 由已知序列肽段建立蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)由已知序列肽段建立蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)第七節(jié)第七節(jié) 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)序列測(cè)定的基本蛋白質(zhì)序列測(cè)定的基本策略和步驟策略和步驟 一、序列測(cè)定的基本策略一、序列測(cè)定的基本策略二、序列測(cè)定前的準(zhǔn)備工作二、序列測(cè)定前的準(zhǔn)備工作三、序列測(cè)定的一般步驟三、序列測(cè)定的一

3、般步驟一、序列測(cè)定的基本策略一、序列測(cè)定的基本策略1. 兩種或兩種以上的特異性裂解法兩種或兩種以上的特異性裂解法 2. 逐級(jí)特異性裂解逐級(jí)特異性裂解戰(zhàn)略考慮關(guān)鍵戰(zhàn)略考慮關(guān)鍵一是多肽鏈片斷裂解一是多肽鏈片斷裂解方法的選擇；方法的選擇；二是裂解后肽段的分二是裂解后肽段的分離純化；離純化；三是要尋找接頭肽段。三是要尋找接頭肽段。 二、序列測(cè)定前的準(zhǔn)備工作二、序列測(cè)定前的準(zhǔn)備工作（一）（一）樣品的純度要求樣品的純度要求 （二）（二）蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定（三）（三）構(gòu)成蛋白質(zhì)的多肽鏈的數(shù)目和大小構(gòu)成蛋白質(zhì)的多肽鏈的數(shù)目和大小（四）蛋白質(zhì)的氨基酸組成（四）蛋白質(zhì)的氨基酸組成 （五）蛋白質(zhì)的

4、配基（五）蛋白質(zhì)的配基 （六）蛋白質(zhì)的末端分析（六）蛋白質(zhì)的末端分析 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定(重點(diǎn)重點(diǎn))指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序以及二硫鍵的位置指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序以及二硫鍵的位置。測(cè)定的基本步驟：測(cè)定的基本步驟：（一）測(cè)定蛋白質(zhì)純度、分子量和濃度（一）測(cè)定蛋白質(zhì)純度、分子量和濃度 （二）進(jìn)行末端分析，確定蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目及（二）進(jìn)行末端分析，確定蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目及N-N-端和端和C-C-端氨基酸的種類端氨基酸的種類（三）拆開二硫鍵并分離出每條多肽鏈（三）拆開二硫鍵并分離出每條多肽鏈（四）分析每條多肽鏈的（四）分析每條多肽鏈的N-N-末端和末端和C-C-末端殘

5、基組成和摩末端殘基組成和摩爾數(shù)爾數(shù)（五）用兩種不同方法將肽鏈專一性地水解成兩套肽段（五）用兩種不同方法將肽鏈專一性地水解成兩套肽段并進(jìn)行分離，以獲得單一的碎片并進(jìn)行分離，以獲得單一的碎片（六）比較各個(gè)肽段的氨基酸排列順序并拼湊出完整肽（六）比較各個(gè)肽段的氨基酸排列順序并拼湊出完整肽鏈的氨基酸排列順序鏈的氨基酸排列順序（七）二硫鍵和酰胺基位置的確定（七）二硫鍵和酰胺基位置的確定（一）樣品的純度要求（一）樣品的純度要求 一般要求純度在一般要求純度在97以上，雜蛋白含量超過以上，雜蛋白含量超過5時(shí)便很難測(cè)定序列時(shí)便很難測(cè)定序列 。 常用來檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品均一性的方法有：常用來檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品均一性的方法

6、有： 雙向分析電泳；雙向分析電泳； 變性聚丙烯酰氨凝膠電泳；變性聚丙烯酰氨凝膠電泳； 離子交換層析；離子交換層析； N 末端氨基酸的測(cè)定；末端氨基酸的測(cè)定； 親和層析；親和層析； 純化至恒定比活；純化至恒定比活； 肽（酶）譜分析；肽（酶）譜分析； Western 印漬法等。印漬法等。（一）測(cè)定蛋白質(zhì)純度、分子量和氨基酸組成（一）測(cè)定蛋白質(zhì)純度、分子量和氨基酸組成1、 樣品的純度與分子量樣品的純度與分子量純度純度97%；測(cè)定方法：測(cè)定方法：（1） SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠知識(shí)

7、凝膠知識(shí)丙烯酰胺丙烯酰胺（acrylamide），），甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺（methylenebisacrylamide）聚合而成；聚合而成； 凝膠孔徑：凝膠孔徑：選擇丙烯酰胺濃度，甲叉雙丙烯酰胺膠聯(lián)劑的選擇丙烯酰胺濃度，甲叉雙丙烯酰胺膠聯(lián)劑的濃度；濃度； 凝膠有分子篩效應(yīng)。凝膠有分子篩效應(yīng)。SDS-PAGESDS（sodium dodecyl sulfate）陰離子洗滌劑，幾乎能破壞天然蛋白質(zhì)中所有的非共陰離子洗滌劑，幾乎能破壞天然蛋白質(zhì)中所有的非共價(jià)鍵，從而使多亞基蛋白質(zhì)解聚，并使多肽鏈呈伸價(jià)鍵，從而使多亞基蛋白質(zhì)解聚，并使多肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，消除了蛋白質(zhì)形狀對(duì)遷移率展?fàn)顟B(tài)，消除了蛋

8、白質(zhì)形狀對(duì)遷移率（migration rate）的影響；的影響；SDS 以以 1:2 1:2 的比例與肽鏈中的氨基酸殘基結(jié)合，使的比例與肽鏈中的氨基酸殘基結(jié)合，使變性蛋白質(zhì)帶上大量的凈負(fù)電荷，而且電荷量與蛋變性蛋白質(zhì)帶上大量的凈負(fù)電荷，而且電荷量與蛋白質(zhì)分子量（即肽鏈長(zhǎng)度）成正比。所以白質(zhì)分子量（即肽鏈長(zhǎng)度）成正比。所以分子量成分子量成為決定蛋白質(zhì)遷移率的唯一因素。為決定蛋白質(zhì)遷移率的唯一因素。SDS -PAGE SDS-PAGE 分離的蛋白分離的蛋白質(zhì)可以用質(zhì)可以用 Coomassie blue 染色，也可銀染染色，也可銀染（silver stain） SDS-PAGE 能分離分能分離分子量

9、差異小于子量差異小于 10% 的的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 用于蛋白質(zhì)純化和分子用于蛋白質(zhì)純化和分子量近似值測(cè)定量近似值測(cè)定（2）等電聚焦等電聚焦（isoelectric focusing ，IEF ）在凝膠上加入一種兩性電解質(zhì)在凝膠上加入一種兩性電解質(zhì)（ampholyte），），電泳時(shí)會(huì)電泳時(shí)會(huì)形成連續(xù)的形成連續(xù)的 pH pH 梯度梯度電泳后，各種電泳后，各種蛋白質(zhì)停留在與其等電點(diǎn)蛋白質(zhì)停留在與其等電點(diǎn)（pI）相同的位相同的位置置IEF 能分離能分離 pI 值僅相差值僅相差 0.01 0.01 的蛋白質(zhì)（即一個(gè)凈電的蛋白質(zhì)（即一個(gè)凈電單位）單位）不連續(xù)不連續(xù)電泳的電泳的三種效應(yīng)三種效應(yīng)： 濃縮效應(yīng)，濃縮

10、效應(yīng)， 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)（3）雙向電泳）雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis）雙向電泳雙向電泳 = = IEF + SDS-PAGE 第一向：第一向：根據(jù)電荷差異用根據(jù)電荷差異用 IEF 分離分離 第二向：第二向：根據(jù)分子量差異用根據(jù)分子量差異用 SDS- PAGE 分離分離IEFSDS-PAGE每一個(gè)點(diǎn)代表一條多肽鏈，每一條多肽鏈有自己的等電每一個(gè)點(diǎn)代表一條多肽鏈，每一條多肽鏈有自己的等電點(diǎn)和分子量。多肽鏈可以用染色法或放射自顯影進(jìn)行檢點(diǎn)和分子量。多肽鏈可以用染色法或放射自顯影進(jìn)行檢測(cè)測(cè)（4）其它方法）其它方法 離子交換層析離

11、子交換層析（根據(jù)物質(zhì)所帶電荷進(jìn)行分離）（根據(jù)物質(zhì)所帶電荷進(jìn)行分離） 親和層析親和層析（利用蛋白質(zhì)與與其他分子的結(jié)合特異性）（利用蛋白質(zhì)與與其他分子的結(jié)合特異性） 末端氨基酸測(cè)定末端氨基酸測(cè)定 純化至恒定比活純化至恒定比活 肽（酶）譜分析肽（酶）譜分析 Western 印跡法印跡法（由蛋白質(zhì)的（由蛋白質(zhì)的SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)及雜、電轉(zhuǎn)及雜交幾部分組成）交幾部分組成）2、濃度測(cè)定、濃度測(cè)定紫外吸收法紫外吸收法蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（ ug/ ml ）（）（ 1.45A 280 一一 0.74A 260 ） X 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)顯色法顯色法雙縮脲法：雙縮脲法：Cu2+Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)

12、合，形成與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍(lán)紫藍(lán)色色絡(luò)合物，此物在絡(luò)合物，此物在540nm540nm波長(zhǎng)處有最大吸收。雙縮脲法常用于波長(zhǎng)處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L10g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測(cè)定。含量的蛋白質(zhì)溶液測(cè)定。干擾物干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如Tris、Good緩沖液等緩沖液等。可用沉淀法除去干擾物，即用等體積。可用沉淀法除去干擾物，即用等體積10%10%冷的三氯醋酸沉淀蛋冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的1m NaOH1m NaOH溶解沉淀的蛋溶解沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量

13、測(cè)定白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定Lowry法法 即即Cu2+與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物（與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)），然后這個(gè)絡(luò)合物還原磷鉬磷，然后這個(gè)絡(luò)合物還原磷鉬磷- -磷鎢酸試劑（福林磷鎢酸試劑（福林- -酚酚試劑），結(jié)果得到深藍(lán)色物，于試劑），結(jié)果得到深藍(lán)色物，于nmnm下達(dá)到最大下達(dá)到最大吸收峰。吸收峰。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測(cè)定此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測(cè)定20mg/L20mg/L400mg/L400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液。含量的蛋白質(zhì)溶液。干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大 考馬斯（考馬斯（Co

14、messie)Comessie)亮藍(lán)結(jié)合法亮藍(lán)結(jié)合法 原理：考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種原理：考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性，考馬斯亮蘭結(jié)合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G-250 的最大光吸收的最大光吸收峰在峰在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，其最，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，其最大吸收峰改變?yōu)榇笪辗甯淖優(yōu)?95nm。 微量法測(cè)定蛋白含量范圍為微量法測(cè)定蛋白含量范圍為1-10g1-10g；常量法測(cè)以檢測(cè)范；常量法測(cè)以檢測(cè)范圍圍10-10010-100gg為宜為宜 干擾物質(zhì)較少干擾物質(zhì)較少（二）蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定（二）蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定 常用的

15、測(cè)定方法有：常用的測(cè)定方法有：1. 滲透壓（滲透壓（osmotic pressure）2. 沉降平衡（沉降平衡（sedimentation equilibrium）3.凝膠過濾法；凝膠過濾法；4. SDS 聚丙烯酸胺凝膠電泳法聚丙烯酸胺凝膠電泳法5. 激光解吸電離飛行質(zhì)譜法激光解吸電離飛行質(zhì)譜法分子量測(cè)定分子量測(cè)定公式：公式：/ c = RT / M + K c. . 滲透壓滲透壓（osmotic pressure）：滲透壓：滲透壓 c：溶質(zhì)濃度：溶質(zhì)濃度 R：氣體常數(shù)：氣體常數(shù) T：絕對(duì)溫度：絕對(duì)溫度 M：分子量：分子量 同時(shí)測(cè)定幾個(gè)不同濃度的滲透壓，以同時(shí)測(cè)定幾個(gè)不同濃度的滲透壓，以/ c

16、 / c 對(duì)對(duì) c c 作圖并外作圖并外推到蛋白質(zhì)濃度為零，得截距，從而求出推到蛋白質(zhì)濃度為零，得截距，從而求出 M M。 為避免為避免 pH pH 值的影響，在溶解度允許的范圍內(nèi)，值的影響，在溶解度允許的范圍內(nèi)，盡量采用等盡量采用等電點(diǎn)或接近等電點(diǎn)的緩沖液電點(diǎn)或接近等電點(diǎn)的緩沖液，并增加溶液中無(wú)機(jī)鹽的濃度。，并增加溶液中無(wú)機(jī)鹽的濃度。 可以測(cè)分子量在可以測(cè)分子量在 1 11010萬(wàn)范圍的蛋白質(zhì)。萬(wàn)范圍的蛋白質(zhì)。 實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高。但實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高。但不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是否均一。否均一。. . 沉降平衡沉降平衡（sedimentationequil

17、ibrium）公式：公式：M =2RT ln(c2/c1)(1-v ) 2 (x22-x12)x：蛋白質(zhì)界面到旋轉(zhuǎn)中蛋白質(zhì)界面到旋轉(zhuǎn)中 心的距離心的距離 c： x 處的蛋白質(zhì)濃度處的蛋白質(zhì)濃度 ：溶劑的密度溶劑的密度 ：角速度角速度v：蛋白質(zhì)的偏微比容蛋白質(zhì)的偏微比容 用較低的速度離心用較低的速度離心（8,00020,000 r/min） 離心開始后，顆粒發(fā)生沉降，造成濃度梯度，同時(shí)產(chǎn)生離心開始后，顆粒發(fā)生沉降，造成濃度梯度，同時(shí)產(chǎn)生擴(kuò)散作用。擴(kuò)散力與離心力作用方向相反，相互平衡擴(kuò)散作用。擴(kuò)散力與離心力作用方向相反，相互平衡1 11gM=A-BV1gM=A-BVe eB B為斜率，為斜率，A

18、A為截距。當(dāng)條件一定時(shí)，為截距。當(dāng)條件一定時(shí)，B B與與A A均均為常數(shù)為常數(shù)2 2A-BA-BB B為斜率，為斜率，A A為截距。當(dāng)條件一定時(shí)，為截距。當(dāng)條件一定時(shí)，B B與與A A均均為常數(shù)為常數(shù)3 3分子分子（三）構(gòu)成蛋白質(zhì)的多肽鏈的數(shù)目和大小（三）構(gòu)成蛋白質(zhì)的多肽鏈的數(shù)目和大小1. 若肽鏈之間非共價(jià)交聯(lián)，可用高濃度變?nèi)綦逆溨g非共價(jià)交聯(lián)，可用高濃度變性劑（如性劑（如8molL尿素或尿素或6molL鹽酸胍）鹽酸胍）變性拆離變性拆離2. 若肽鏈?zhǔn)怯啥蜴I共價(jià)交聯(lián)，可用過量若肽鏈?zhǔn)怯啥蜴I共價(jià)交聯(lián)，可用過量的巰基乙醇等斷裂二硫鍵，同時(shí)加變性的巰基乙醇等斷裂二硫鍵，同時(shí)加變性劑，并保護(hù)生成的巰

19、基劑，并保護(hù)生成的巰基拆開二硫鍵方法之一拆開二硫鍵方法之一過甲酸氧化法過甲酸氧化法 為避免副反應(yīng)，一般在為避免副反應(yīng)，一般在 10下進(jìn)行反應(yīng)，下進(jìn)行反應(yīng)，但但Trp仍被破壞，仍被破壞，Met氧化成亞砜。此法的氧化成亞砜。此法的優(yōu)點(diǎn)是，切斷二硫鍵后，不能重新形成二硫優(yōu)點(diǎn)是，切斷二硫鍵后，不能重新形成二硫鍵，便于肽鍵分離。鍵，便于肽鍵分離。 用得最多的還原劑是巰基乙醇、巰基乙酸、用得最多的還原劑是巰基乙醇、巰基乙酸、二硫蘇糖醇、連四硫酸鈉等。二硫蘇糖醇、連四硫酸鈉等。為使反應(yīng)完全，還原劑要過量，同時(shí)在反為使反應(yīng)完全，還原劑要過量，同時(shí)在反應(yīng)體系中加入變性劑（應(yīng)體系中加入變性劑（SDS、脲、胍等）。

20、、脲、胍等）。在烷基化之前，還原的巰基要用在烷基化之前，還原的巰基要用N2保護(hù)。保護(hù)。用碘乙酸（或其酰胺），環(huán)乙烯亞胺封閉用碘乙酸（或其酰胺），環(huán)乙烯亞胺封閉新生成的巰基，使巰基烷基化避免二硫鍵新生成的巰基，使巰基烷基化避免二硫鍵重新形成。重新形成。巰基保護(hù)巰基保護(hù) 還原還原-羧甲基化法羧甲基化法 (四四) 蛋白質(zhì)的氨基酸組成蛋白質(zhì)的氨基酸組成（五）蛋白質(zhì)的配基（五）蛋白質(zhì)的配基 （六）蛋白質(zhì)的端基分析（六）蛋白質(zhì)的端基分析三、序列測(cè)定的一般步驟三、序列測(cè)定的一般步驟 正常的序列測(cè)定包括以下步驟：正常的序列測(cè)定包括以下步驟：1. 先是根據(jù)肽段大小和氨基酸組成情況選擇合適的裂解肽段試劑，先是根據(jù)

21、肽段大小和氨基酸組成情況選擇合適的裂解肽段試劑， 將多肽鏈裂解成一系列小肽，并分離純化這些小肽段；然后測(cè)定將多肽鏈裂解成一系列小肽，并分離純化這些小肽段；然后測(cè)定 每一肽段的氨基酸序列；每一肽段的氨基酸序列；2. 另取一份樣品，用第二種方法裂解多肽鏈（切點(diǎn)位置與第一次不另取一份樣品，用第二種方法裂解多肽鏈（切點(diǎn)位置與第一次不同），分離純化各肽段后，測(cè)每一肽段的氨基酸序列；同），分離純化各肽段后，測(cè)每一肽段的氨基酸序列；3. 最后比較已測(cè)得的兩套肽段的序列，找出前后兩次斷裂點(diǎn)相重疊最后比較已測(cè)得的兩套肽段的序列，找出前后兩次斷裂點(diǎn)相重疊的部位，即接頭部位，即可排出多肽鏈完整的氨基酸排列順序。的部

22、位，即接頭部位，即可排出多肽鏈完整的氨基酸排列順序。 對(duì)于一次不能連續(xù)測(cè)出序列的大肽段，還需繼續(xù)裂解成小肽，對(duì)于一次不能連續(xù)測(cè)出序列的大肽段，還需繼續(xù)裂解成小肽，并分離純化，分別測(cè)出這些次級(jí)肽段的序列。若多肽鏈含有二硫并分離純化，分別測(cè)出這些次級(jí)肽段的序列。若多肽鏈含有二硫鍵或其它配基，如酰胺基時(shí)，還需分別確定它們?cè)谛蛄兄械倪B接鍵或其它配基，如酰胺基時(shí)，還需分別確定它們?cè)谛蛄兄械倪B接位置。位置。 第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析 一、蛋白質(zhì)的水解一、蛋白質(zhì)的水解 二、氨基酸的分離和定量測(cè)定二、氨基酸的分離和定量測(cè)定 三、特殊氨基酸的測(cè)定三、特殊氨基酸的測(cè)定 一

23、、蛋白質(zhì)的水解一、蛋白質(zhì)的水解 （一）（一）鹽酸水解法鹽酸水解法 （二）（二）磺酸水解法磺酸水解法 （三）（三）酶水解法酶水解法 能較滿意地得到除能較滿意地得到除TrpTrp和和CysCys以外的其以外的其它所有氨基酸它所有氨基酸（一）鹽酸水解法（一）鹽酸水解法 鹽酸水解是目前水解蛋白質(zhì)或多肽應(yīng)用鹽酸水解是目前水解蛋白質(zhì)或多肽應(yīng)用最廣泛的一種方法。用此法能較滿意地最廣泛的一種方法。用此法能較滿意地得到除得到除TrpTrp和和CysCys以外的其它所有氨基酸，以外的其它所有氨基酸，方法也較為簡(jiǎn)便。方法也較為簡(jiǎn)便。 存在的問題存在的問題使用重蒸使用重蒸 5.7 mol5.7 molL L恒沸點(diǎn)鹽酸

24、，在密封的水恒沸點(diǎn)鹽酸，在密封的水解管中，于解管中，于 105105110110進(jìn)行蛋白質(zhì)水解。水解進(jìn)行蛋白質(zhì)水解。水解時(shí)間一般在時(shí)間一般在24247272小時(shí)。結(jié)果，小時(shí)。結(jié)果，大部分氨基酸可大部分氨基酸可定量回收定量回收；但是，；但是，TrpTrp基本上全被破壞基本上全被破壞，必須用，必須用其它方法測(cè)定；其它方法測(cè)定；SerSer和和ThrThr緩慢分解，緩慢分解，要準(zhǔn)確測(cè)定，要準(zhǔn)確測(cè)定，需要做幾個(gè)水解時(shí)間實(shí)驗(yàn)；需要做幾個(gè)水解時(shí)間實(shí)驗(yàn)；含含ValVal和和IleIle的肽鍵，的肽鍵，由于支鏈的空間障礙而水解緩慢由于支鏈的空間障礙而水解緩慢，所以，定量測(cè)，所以，定量測(cè)定就要長(zhǎng)時(shí)間水解；定就要

25、長(zhǎng)時(shí)間水解；CysCys可被部分破壞和氧化可被部分破壞和氧化，所以最好在氧化成穩(wěn)定的磺基丙氨酸后測(cè)定；所以最好在氧化成穩(wěn)定的磺基丙氨酸后測(cè)定；GlnGln和和AsnAsn在酸水解時(shí)脫酰胺后全部變成在酸水解時(shí)脫酰胺后全部變成GluGlu和和AspAsp，水解時(shí)放出的氨量可用來測(cè)定水解時(shí)放出的氨量可用來測(cè)定AsnAsn和和GlnGln的總量，的總量，或者用不水解酰胺的方法水解肽鍵后直接測(cè)定。或者用不水解酰胺的方法水解肽鍵后直接測(cè)定。 鹽酸水解時(shí)，鹽酸水解時(shí)，MetMet易被氧化轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢蛞妆谎趸D(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼犴堪彼犴浚瑩p失約，損失約2020 左右，可以用這一數(shù)左右，可以用這一數(shù)值進(jìn)行校正，也可用保

26、護(hù)劑（在鹽酸中加值進(jìn)行校正，也可用保護(hù)劑（在鹽酸中加入入0.l0.l1.01.0巰基乙酸）來減少水解中巰基乙酸）來減少水解中 Met Met 的損失的損失; ; Tyr Tyr 的破壞率約為的破壞率約為 1010，如，如水解時(shí)加入水解時(shí)加入 0.l0.l1.01.0 巰基乙酸和巰基乙酸和 0.050.050.l0.l苯酚，能使苯酚，能使TyrTyr和和 SerSer回收率回收率明顯提高，這時(shí)明顯提高，這時(shí) MetMet也能免遭破壞。也能免遭破壞。 堿水解堿水解一般用一般用5mol/L5mol/L氫氧化鈉煮沸氫氧化鈉煮沸10-2010-20小時(shí)。小時(shí)。由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞

27、，產(chǎn)由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。該法的優(yōu)點(diǎn)是該法的優(yōu)點(diǎn)是色氨酸色氨酸在水解中不受破壞。在水解中不受破壞。（二）磺酸水解法（二）磺酸水解法 用用 4 mol4 molL L甲基磺酸，內(nèi)含甲基磺酸，內(nèi)含0.20.2 吲哚基乙胺（色胺）作水解劑，可使吲哚基乙胺（色胺）作水解劑，可使 TrpTrp的回收率達(dá)到的回收率達(dá)到9090以上，以上，SerSer和和ThrThr的的回收率接近定量值。其中回收率接近定量值。其中CysCys可用二硫蘇可用二硫蘇糖醇還原水解液中的胱氨酸及其衍生物，糖醇還原水解液中的胱氨酸及其衍生物

28、，然后用過量的連四硫酸鈉氧化，得到然后用過量的連四硫酸鈉氧化，得到 S S 磺基半胱氨酸而加以測(cè)定。磺基半胱氨酸而加以測(cè)定。 磺酸水解也有局限性磺酸水解也有局限性，當(dāng)水解液中存在，當(dāng)水解液中存在碳水化合物時(shí)，色氨酸容易破壞，因此碳水化合物時(shí)，色氨酸容易破壞，因此對(duì)含有較多碳水化合物的糖蛋白分子不對(duì)含有較多碳水化合物的糖蛋白分子不能用本方法測(cè)定色氨酸。本法的最大優(yōu)能用本方法測(cè)定色氨酸。本法的最大優(yōu)點(diǎn)是中性水解液可直接上機(jī)，色氨酸較點(diǎn)是中性水解液可直接上機(jī)，色氨酸較穩(wěn)定穩(wěn)定 （三）酶水解法（三）酶水解法 選用專一性低，水解酶選用專一性低，水解酶活力高的蛋白酶活力高的蛋白酶水解。水解。 主要缺點(diǎn)：不

29、易達(dá)到徹底水解，主要缺點(diǎn)：不易達(dá)到徹底水解，影響氨影響氨基酸的回收率；基酸的回收率；蛋白酶自溶產(chǎn)物蛋白酶自溶產(chǎn)物會(huì)污染會(huì)污染水解的氨基酸混合物。水解的氨基酸混合物。 目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶或稱蛋白目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶或稱蛋白酶（酶（proteinaseproteinase）已有十多種。應(yīng)用酶水解多肽）已有十多種。應(yīng)用酶水解多肽不會(huì)破壞氨基酸，也不會(huì)發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)不會(huì)破壞氨基酸，也不會(huì)發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)物為較小的肽段。物為較小的肽段。 二、氨基酸的分離和定量測(cè)定二、氨基酸的分離和定量測(cè)定 當(dāng)前使用最普遍、最有效的是當(dāng)前使用最普遍、最有效的是以離子交換層以離子交換

30、層析法為基礎(chǔ)研制的氨基酸自動(dòng)分析儀析法為基礎(chǔ)研制的氨基酸自動(dòng)分析儀，也有，也有用用HPLC的。使用的柱材料是磺酸型聚苯乙烯的。使用的柱材料是磺酸型聚苯乙烯陽(yáng)離子交換樹脂。在陽(yáng)離子交換樹脂。在pH2.0 的條件下，全部氨的條件下，全部氨基酸都能牢固地結(jié)合在樹脂上。提高洗脫液基酸都能牢固地結(jié)合在樹脂上。提高洗脫液的的pH和離子強(qiáng)度，可將氨基酸依次洗脫下來，和離子強(qiáng)度，可將氨基酸依次洗脫下來，從而達(dá)到分離的目的。從而達(dá)到分離的目的。洗下的氨基酸與茚三酮反應(yīng)形成紫色產(chǎn)物洗下的氨基酸與茚三酮反應(yīng)形成紫色產(chǎn)物Ruheman紫，可于紫，可于570nm比色測(cè)定。但比色測(cè)定。但Pro與與茚三酮反應(yīng)形成的產(chǎn)物為黃

31、色，于茚三酮反應(yīng)形成的產(chǎn)物為黃色，于440nm比比色測(cè)定。色測(cè)定。 分離分離定量定量測(cè)定測(cè)定1717種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液在日立種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液在日立 835 835 50 50 型氨型氨基酸自動(dòng)分析儀上的分析圖譜基酸自動(dòng)分析儀上的分析圖譜 三、特殊氨基酸的測(cè)定三、特殊氨基酸的測(cè)定 （一）（一）色氨酸（色氨酸（Trp）的測(cè)定）的測(cè)定 （二）（二）巰基測(cè)定巰基測(cè)定 （三）（三）二硫鍵的測(cè)定二硫鍵的測(cè)定（四）（四）氨基的測(cè)定氨基的測(cè)定 （一）色氨酸（一）色氨酸（Trp）的測(cè)定）的測(cè)定 1紫外吸收法紫外吸收法 2對(duì)對(duì) 二甲基氨基苯甲醛法二甲基氨基苯甲醛法 Trp在強(qiáng)酸條件下與醛反應(yīng)生成帶色產(chǎn)在強(qiáng)酸條件

32、下與醛反應(yīng)生成帶色產(chǎn)物。顏色的深淺與物。顏色的深淺與Trp含量成直線關(guān)系。該帶含量成直線關(guān)系。該帶色物質(zhì)的最大吸收峰位在色物質(zhì)的最大吸收峰位在590nm。該法已廣泛。該法已廣泛采用，結(jié)果較可靠。采用，結(jié)果較可靠。返回由于由于TrpTrp和和TyrTyr在在 280 nm 280 nm 和和 290 nm 290 nm 的紫外區(qū)有光的紫外區(qū)有光吸收，因此可用完整的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行吸收，因此可用完整的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行TrpTrp測(cè)定。先測(cè)定。先將蛋白質(zhì)樣品溶于將蛋白質(zhì)樣品溶于6mol6molL L鹽酸胍溶液中，然后分別鹽酸胍溶液中，然后分別在在280 nm280 nm和和 288 nm 288 nm

33、測(cè)量蛋白質(zhì)溶液的光吸收。測(cè)量蛋白質(zhì)溶液的光吸收。TrpTrp在在 288 nm 288 nm 和和 280nm 280nm 的摩爾消光系數(shù)分別是的摩爾消光系數(shù)分別是 4815 4815 和和56905690；而；而TyrTyr在在288nm 288nm 和和 280nm 280nm 的摩爾消光系數(shù)的摩爾消光系數(shù)分別是分別是385385和和 12801280。根據(jù)測(cè)定混合物中兩種物質(zhì)濃。根據(jù)測(cè)定混合物中兩種物質(zhì)濃度的比爾定律，可得兩個(gè)聯(lián)立方程，稍加整理，則度的比爾定律，可得兩個(gè)聯(lián)立方程，稍加整理，則可得到可得到TrpTrp與與TyrTyr之比：之比： 回上頁(yè)（二）巰基測(cè)定（二）巰基測(cè)定 測(cè)定巰基

34、的主要方法有形成硫醇鹽法，烷基化法測(cè)定巰基的主要方法有形成硫醇鹽法，烷基化法和比色法。比色法簡(jiǎn)單易行。這類方法是根據(jù)試和比色法。比色法簡(jiǎn)單易行。這類方法是根據(jù)試劑與巰基反應(yīng)后生成帶色產(chǎn)物來進(jìn)行測(cè)定的。劑與巰基反應(yīng)后生成帶色產(chǎn)物來進(jìn)行測(cè)定的。 1. 5.5 二硫代雙（二硫代雙（2 硝基苯甲酸）（硝基苯甲酸）（DTNB） 測(cè)定法測(cè)定法 反應(yīng)后產(chǎn)生反應(yīng)后產(chǎn)生 4硝基硝基3羥基硫酚，可用半胱氨羥基硫酚，可用半胱氨酸作標(biāo)準(zhǔn)樣品，在酸作標(biāo)準(zhǔn)樣品，在412nm處測(cè)定處測(cè)定2. 萘醌測(cè)定法萘醌測(cè)定法 萘醌與巰基有當(dāng)量加成關(guān)系，加成物在萘醌與巰基有當(dāng)量加成關(guān)系，加成物在420nm 左左右有吸收峰、標(biāo)準(zhǔn)物和未知物

35、在相同條件下測(cè)定。右有吸收峰、標(biāo)準(zhǔn)物和未知物在相同條件下測(cè)定。 返回（三）二硫鍵的測(cè)定（三）二硫鍵的測(cè)定 1Ellman 試劑法試劑法 當(dāng)有一游離巰基存在時(shí)，當(dāng)有一游離巰基存在時(shí)， Ellman 試劑（結(jié)構(gòu)類似于試劑（結(jié)構(gòu)類似于DTNB）可與）可與二硫鍵發(fā)生反應(yīng)二硫鍵發(fā)生反應(yīng) ，而進(jìn)行測(cè)定，而進(jìn)行測(cè)定22 硝基硝基 5 硫代苯磺酸法（硫代苯磺酸法（NTSB） 過量亞硫酸鈉與蛋白質(zhì)反應(yīng)可裂解蛋白過量亞硫酸鈉與蛋白質(zhì)反應(yīng)可裂解蛋白 質(zhì)中的二硫鍵，而進(jìn)行測(cè)定質(zhì)中的二硫鍵，而進(jìn)行測(cè)定 返回拆開拆開-S-S-S-S-的方法的方法 （1 1）二硫鍵的斷裂）二硫鍵的斷裂幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在幾

36、條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L8mol/L尿素尿素或或6mol/L6mol/L鹽酸胍鹽酸胍存在下，用過量的存在下，用過量的- -巰基乙醇巰基乙醇處理，使處理，使二硫鍵二硫鍵還原為巰基還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以基，以防止它重新被氧化防止它重新被氧化。（2 2）二硫鍵的切割與保護(hù)）二硫鍵的切割與保護(hù)切割切割 過甲酸過甲酸performic acidperformic acid 不可逆不可逆，還原氧化還原氧化 不可逆不可逆 巰基乙醇，巰基乙醇，DTT DTT 碘乙酸碘乙酸 S-CH2-COOHS-CH2-COOH亞硫酸分解亞硫酸分解S

37、ulfitolysisSulfitolysis 可逆可逆R1-S-S-R2 R1-S-S-R2 HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3 （四）氨基的測(cè)定（四）氨基的測(cè)定 1.常用常用2，4，6 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）進(jìn)行測(cè)定，）進(jìn)行測(cè)定，此法此法比較靈敏。在溫和條件下試劑即能與伯胺定量反應(yīng)，產(chǎn)比較靈敏。在溫和條件下試劑即能與伯胺定量反應(yīng)，產(chǎn)物可用分光光度法定量測(cè)定。物可用分光光度法定量測(cè)定。 2. 采用熒光胺測(cè)定氨基，采用熒光胺測(cè)定氨基，靈敏度大為提高，可測(cè)定靈敏度大為提高，可測(cè)定pmole數(shù)數(shù)量級(jí)的氨基。產(chǎn)生的熒光團(tuán)可在量

38、級(jí)的氨基。產(chǎn)生的熒光團(tuán)可在390nm 被激發(fā)，在被激發(fā)，在475nm 發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與伯胺濃度成正比。肽在發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與伯胺濃度成正比。肽在pH7能產(chǎn)生最大的熒光強(qiáng)度。熒光胺反應(yīng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是游能產(chǎn)生最大的熒光強(qiáng)度。熒光胺反應(yīng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是游離氨的干擾極微。離氨的干擾極微。3. 用鄰苯二醛用鄰苯二醛 2 - 巰基乙醇測(cè)定伯胺，巰基乙醇測(cè)定伯胺，比熒光胺的靈比熒光胺的靈敏度高敏度高510倍。試劑與伯胺生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物，可在倍。試劑與伯胺生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物，可在340nm 被激發(fā)，在被激發(fā)，在455nm 測(cè)量熒光。測(cè)量熒光。 返回第三節(jié)第三節(jié) 末端氨基酸的測(cè)定末端氨基酸的測(cè)定 一、一、N N 末端

39、的測(cè)定末端的測(cè)定二、二、C C 末端的測(cè)定末端的測(cè)定一、一、N 末端的測(cè)定末端的測(cè)定 N N 端測(cè)定法（除氨肽酶外）的共同特點(diǎn)是在端測(cè)定法（除氨肽酶外）的共同特點(diǎn)是在 N N 端引入具有一定基團(tuán)的標(biāo)記化合物。這種標(biāo)記端引入具有一定基團(tuán)的標(biāo)記化合物。這種標(biāo)記基團(tuán)有顏色，熒光，紫外吸收等性質(zhì)，然后分離基團(tuán)有顏色，熒光，紫外吸收等性質(zhì)，然后分離鑒定具有這種基團(tuán)的氨基酸衍生物。鑒定具有這種基團(tuán)的氨基酸衍生物。 （一）（一）二硝基氟苯法二硝基氟苯法 （二）（二）丹磺酰氯分析法丹磺酰氯分析法 （三）異硫氰酸苯酯法（三）異硫氰酸苯酯法 （四）（四）DABITC法法 （五）氨肽酶法（五）氨肽酶法 （六）（六）

40、封閉封閉 N 端的測(cè)定端的測(cè)定 1950 1950年提出的，也稱年提出的，也稱EdmanEdman降解法，其最大降解法，其最大優(yōu)點(diǎn)是可以連續(xù)降解，優(yōu)點(diǎn)是可以連續(xù)降解，見第五節(jié)見第五節(jié) 原理類似于原理類似于EdmanEdman降解反應(yīng)。檢降解反應(yīng)。檢出靈敏度可靠，見第五節(jié)出靈敏度可靠，見第五節(jié) （一）二硝基氟苯法（一）二硝基氟苯法黃色黃色DNPDNP氨基酸衍生物，可用乙醚抽提氨基酸衍生物，可用乙醚抽提DNP-DNP-氨基酸見光易分解，整個(gè)操作應(yīng)在暗處進(jìn)行氨基酸見光易分解，整個(gè)操作應(yīng)在暗處進(jìn)行檢測(cè)不出檢測(cè)不出DNP DNP 氨基酸的可能原因氨基酸的可能原因 被分析對(duì)象的被分析對(duì)象的 N N 端是封

41、閉的端是封閉的 因?yàn)橐驗(yàn)镈NPDNPProPro或或DNP DNP GlyGly在鹽酸水解條件在鹽酸水解條件下極不穩(wěn)定，回收率甚低。這時(shí)要縮短水解時(shí)間下極不穩(wěn)定，回收率甚低。這時(shí)要縮短水解時(shí)間 N N端為端為ProPro或或GlyGly 末端殘基很可能是末端殘基很可能是ValVal、IleIle 如焦谷氨酰基，乙酰基等如焦谷氨酰基，乙酰基等 它們所形成的肽鍵對(duì)酸水解的耐性強(qiáng)，酸水解它們所形成的肽鍵對(duì)酸水解的耐性強(qiáng)，酸水解后沒有產(chǎn)生游離的后沒有產(chǎn)生游離的DNP DNP 氨基酸，而生成氨基酸，而生成DNPDNP小肽，可通過延長(zhǎng)水解時(shí)間來解決這個(gè)問題小肽，可通過延長(zhǎng)水解時(shí)間來解決這個(gè)問題（二）丹磺酰

42、氯分析法（二）丹磺酰氯分析法 反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)物 DNSDNSAA AA 在紫外線下有強(qiáng)烈熒光，檢在紫外線下有強(qiáng)烈熒光，檢測(cè)靈敏度可達(dá)測(cè)靈敏度可達(dá)10109 910101010摩爾，比二硝基氟苯法高摩爾，比二硝基氟苯法高100100倍。倍。熒光試劑熒光試劑 該反應(yīng)依賴該反應(yīng)依賴 pHpH，并需過量，并需過量 DansylDansyl Cl Cl 試劑。試劑。HisHis的咪唑基、的咪唑基、CysCys的巰基、的巰基、TyrTyr的酚基和的酚基和 LysLys的的 氨基等也能和試劑反氨基等也能和試劑反應(yīng)，生成相應(yīng)的衍生物，但這些物質(zhì)不影應(yīng)，生成相應(yīng)的衍生物，但這些物質(zhì)不影響響 N N 端端 DNS

43、 DNS 氨基酸的測(cè)定。氨基酸的測(cè)定。（六）封閉（六）封閉 N 端的測(cè)定端的測(cè)定 N N端殘基受封閉的種類很多，例如端殘基受封閉的種類很多，例如乙酰化乙酰化（兔肌紅蛋白）、（兔肌紅蛋白）、甲酰化甲酰化（蜂毒素）、（蜂毒素）、焦谷氨酰環(huán)化焦谷氨酰環(huán)化（兔免疫球蛋白）、丙酰（兔免疫球蛋白）、丙酰氨環(huán)化及個(gè)別多肽形成的環(huán)狀分子（短氨環(huán)化及個(gè)別多肽形成的環(huán)狀分子（短桿菌酪肽桿菌酪肽 A A）等。前三種常見。）等。前三種常見。 除了自然界中許多蛋白質(zhì)或活性多肽以除了自然界中許多蛋白質(zhì)或活性多肽以 N N 端氨基封閉的形式存在以外。在一定端氨基封閉的形式存在以外。在一定條件下，條件下，GlnGln（無(wú)論是

44、游離的還是處在肽（無(wú)論是游離的還是處在肽鏈鏈 N N 端）會(huì)發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，形成端）會(huì)發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，形成焦谷氨焦谷氨酰基衍生物酰基衍生物： 目前降解目前降解 N N 末端焦谷氨酰殘基的方末端焦谷氨酰殘基的方法有法有酶解法酶解法和和化學(xué)降解法化學(xué)降解法兩種兩種！封閉端的測(cè)定！封閉端的測(cè)定種類種類、乙酰化（兔肌紅蛋白）；、乙酰化（兔肌紅蛋白）；、甲酰化（蜂毒素）；、甲酰化（蜂毒素）；、焦谷氨酰環(huán)化（兔免疫球蛋白）；、焦谷氨酰環(huán)化（兔免疫球蛋白）；、丙酰氨環(huán)化及個(gè)別多肽形成的環(huán)狀分子（短桿菌酪、丙酰氨環(huán)化及個(gè)別多肽形成的環(huán)狀分子（短桿菌酪肽）等肽）等 對(duì)于對(duì)于、，可采用溫和酸水解，對(duì)還可采取來自可采用

45、溫和酸水解，對(duì)還可采取來自大腸桿菌的脫甲酰酶除掉；大腸桿菌的脫甲酰酶除掉； 對(duì)可采取以下兩種方法對(duì)可采取以下兩種方法焦谷氨酰氨肽酶焦谷氨酰氨肽酶（可專一裂解焦谷氨酰末端）；（可專一裂解焦谷氨酰末端）；化學(xué)降解（化學(xué)降解（鹽酸甲醇試劑鹽酸甲醇試劑）酶解法酶解法 焦谷氨酰氨肽酶焦谷氨酰氨肽酶，此酶可專一裂解焦谷氨酰，此酶可專一裂解焦谷氨酰 N N 末端，末端，是裂解是裂解 N N 末端焦谷氨酰殘基肽的最有用末端焦谷氨酰殘基肽的最有用的辦法。此酶已有商品出售。的辦法。此酶已有商品出售。 化學(xué)降解化學(xué)降解 用鹽酸用鹽酸 甲醇試劑甲醇試劑。在溫和條件下，該試劑能。在溫和條件下，該試劑能打開焦谷氨酰殘基的

46、吡咯烷酮環(huán)，暴露其打開焦谷氨酰殘基的吡咯烷酮環(huán)，暴露其 氨基。氨基。暴露的暴露的 氨基則能被氨基則能被EdmanEdman試劑偶合，然后按正試劑偶合，然后按正常方法降解。用本法降解焦谷氨酰殘基，操作簡(jiǎn)便，常方法降解。用本法降解焦谷氨酰殘基，操作簡(jiǎn)便，效率較高，開環(huán)產(chǎn)率達(dá)效率較高，開環(huán)產(chǎn)率達(dá)9090，試劑便宜，是一條優(yōu)，試劑便宜，是一條優(yōu)于酶法降解的較好途徑。于酶法降解的較好途徑。 N N 端甲酰基端甲酰基可通過溫和酸水解法除去，而不致可通過溫和酸水解法除去，而不致引起肽鍵嚴(yán)重裂解，或者用來自大腸桿菌的脫甲引起肽鍵嚴(yán)重裂解，或者用來自大腸桿菌的脫甲酰基酶除掉。酰基酶除掉。 二、二、C 末端的測(cè)定

47、末端的測(cè)定 C末端殘基的測(cè)定比末端殘基的測(cè)定比 N 端殘基測(cè)定困難。可端殘基測(cè)定困難。可供選用的方法比較少。化學(xué)法中有肼解法、乙內(nèi)供選用的方法比較少。化學(xué)法中有肼解法、乙內(nèi)酰硫脲法、酰硫脲法、C末端選擇性氚標(biāo)記法，減數(shù)末端選擇性氚標(biāo)記法，減數(shù) C 末端末端測(cè)定法和還原法。酶法中有羧肽酶法。測(cè)定法和還原法。酶法中有羧肽酶法。 （一）（一）肼解法肼解法（二）（二）C 末端選擇性氚標(biāo)記法末端選擇性氚標(biāo)記法 （三）（三）減數(shù)減數(shù) C 末端測(cè)定末端測(cè)定 （四）（四）還原法還原法 （五）（五）羧肽酶法羧肽酶法 （一）肼解法（一）肼解法蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)無(wú)水無(wú)水肼肼100510 h+氨基酸的酰肼氨基酸的酰肼 肼解

48、下來的肼解下來的 C C 端氨基酸借助端氨基酸借助 DNFB DNFB 試劑及分級(jí)抽試劑及分級(jí)抽提等方法，再以層析技術(shù)可迅速鑒定出種類和數(shù)目。提等方法，再以層析技術(shù)可迅速鑒定出種類和數(shù)目。C C 端為半胱氨酸和胱氨酸的肽，不能用肼解法測(cè)定端為半胱氨酸和胱氨酸的肽，不能用肼解法測(cè)定，因?yàn)椋驗(yàn)檫@兩種氨基酸在肼解時(shí)分解，必須先氧化或烷基化后再這兩種氨基酸在肼解時(shí)分解，必須先氧化或烷基化后再肼解測(cè)定。肼解測(cè)定。第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步醋酸酐處理多肽，形成醋酸酐處理多肽，形成 C 端酮環(huán)端酮環(huán)打開噁唑酮環(huán)打開噁唑酮環(huán), C 端氨基端氨基酸的酸的 碳原子已被氚碳原子已被氚（3H）

49、標(biāo)記）標(biāo)記酸水解，分離鑒定氚酸水解，分離鑒定氚標(biāo)記的氨基酸標(biāo)記的氨基酸（二）（二）C 末端選擇性氚標(biāo)記法末端選擇性氚標(biāo)記法 堿催化噁唑環(huán)消旋反應(yīng)，堿催化噁唑環(huán)消旋反應(yīng)，將氚引入噁唑酮環(huán)將氚引入噁唑酮環(huán)注：注：不適于不適于C C端為端為 ProPro和和AspAsp（三）減數(shù)（三）減數(shù) C 末端測(cè)定末端測(cè)定 此法是先將肽樣品的此法是先將肽樣品的 N 端固定端固定在多孔玻璃球在多孔玻璃球上，然后用上，然后用二二 P 硝基苯磷酸酰迭氮化合物硝基苯磷酸酰迭氮化合物（di pnitro phenyl phosphorylazide）處理處理，使，使 C 端羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)為相應(yīng)的端羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)為相應(yīng)的酰迭氮化酰

50、迭氮化物物，隨后再將酰迭氮化物，隨后再將酰迭氮化物熱解成異氰鹽熱解成異氰鹽。產(chǎn)。產(chǎn)物經(jīng)物經(jīng)酸水解酸水解后，使后，使 C 末端殘基破壞末端殘基破壞。這樣可。這樣可通過測(cè)量反應(yīng)前后的氨基酸組成變化來確定通過測(cè)量反應(yīng)前后的氨基酸組成變化來確定 C 末端殘基。因此，它類似于減數(shù)末端殘基。因此，它類似于減數(shù)Edman降降解法，反應(yīng)式如下：解法，反應(yīng)式如下： 僅適用于小肽，且對(duì)樣品的消耗大，測(cè)一個(gè)僅適用于小肽，且對(duì)樣品的消耗大，測(cè)一個(gè)C C末端末端殘基約損耗殘基約損耗90%90%以上以上（四）還原法（四）還原法 用硼氫化鋰將用硼氫化鋰將C末端氨基酸末端氨基酸還原成相還原成相應(yīng)的應(yīng)的 氨基醇氨基醇。隨后將此

51、肽完全水解。隨后將此肽完全水解。水解物中將含有一個(gè)相當(dāng)于原來的水解物中將含有一個(gè)相當(dāng)于原來的 C 末端末端氨基酸的氨基酸的 氨基醇分子，可用色譜法鑒氨基醇分子，可用色譜法鑒別。別。Sanger早年就是用此法鑒定胰島素早年就是用此法鑒定胰島素A、B 鏈的鏈的 C 端。端。 （五）羧肽酶法（五）羧肽酶法 此法是有效方法也最常用。羧肽酶是一此法是有效方法也最常用。羧肽酶是一類外肽酸，能專一地從肽鏈的類外肽酸，能專一地從肽鏈的 C 末端開末端開始逐個(gè)降解，釋放出游離氨基酸，反應(yīng)始逐個(gè)降解，釋放出游離氨基酸，反應(yīng)如下：如下： 釋放出的氨基酸數(shù)目和種類隨時(shí)間發(fā)生變化。釋放出的氨基酸數(shù)目和種類隨時(shí)間發(fā)生變化

52、。可用自動(dòng)氨基酸分析儀作定性和定量測(cè)定，然后可用自動(dòng)氨基酸分析儀作定性和定量測(cè)定，然后根據(jù)氨基酸釋放的動(dòng)力學(xué)曲線，即以時(shí)間為橫坐根據(jù)氨基酸釋放的動(dòng)力學(xué)曲線，即以時(shí)間為橫坐標(biāo)，釋放的氨基酸量為縱坐標(biāo)作圖，便可確定該標(biāo)，釋放的氨基酸量為縱坐標(biāo)作圖，便可確定該肽鏈的肽鏈的 C 端氨基酸的序列端氨基酸的序列 。 C C 端順序是端順序是 ThrThrValValPhe Phe 但是，但是，由于羧肽酶對(duì)不同側(cè)鏈基團(tuán)有極不相由于羧肽酶對(duì)不同側(cè)鏈基團(tuán)有極不相同的親和性，所以實(shí)際情形要復(fù)雜得多同的親和性，所以實(shí)際情形要復(fù)雜得多，有時(shí)結(jié)，有時(shí)結(jié)果難于解釋。但可采取一些步驟使釋放不同羧基果難于解釋。但可采取一些步

53、驟使釋放不同羧基末端的速度更平穩(wěn)。例如在變性劑存在下使用羧末端的速度更平穩(wěn)。例如在變性劑存在下使用羧肽酶。羧肽酶在稀肽酶。羧肽酶在稀SDSSDS或或 6mol6molL L脲中是有活性脲中是有活性的，由于變性劑破壞了蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，的，由于變性劑破壞了蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，因而使不同羧基末端的釋放速度趨于相近。因而使不同羧基末端的釋放速度趨于相近。反應(yīng)反應(yīng) pH pH 也影響釋放速度。也影響釋放速度。當(dāng)當(dāng)pHpH低至足以抑制羧基上低至足以抑制羧基上的正電荷時(shí)，釋放速度加強(qiáng)。此外有可能以穩(wěn)定的正電荷時(shí)，釋放速度加強(qiáng)。此外有可能以穩(wěn)定的活性形式固定化羧肽酶，這可顯著提高的活性形式固定化羧肽酶

54、，這可顯著提高 C C 端端測(cè)定的利用率。目前至少有測(cè)定的利用率。目前至少有 4 4 種不同的羧肽酶種不同的羧肽酶可供利用。下表列出了這些酶的來源，反應(yīng)條件可供利用。下表列出了這些酶的來源，反應(yīng)條件及專一性。及專一性。表表 四種羧肽酶的性質(zhì)及其降解條件四種羧肽酶的性質(zhì)及其降解條件第四節(jié)第四節(jié) 肽鏈的專一性水解和肽片斷的分離純化肽鏈的專一性水解和肽片斷的分離純化 一、一、肽鏈的專一性水解肽鏈的專一性水解 （一）蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解（一）蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解 1. 溴化氰裂解溴化氰裂解 2. BNPSSkatole法法 3. 亞碘酰基苯甲酸裂解法亞碘酰基苯甲酸裂解法 4. XCys鍵的裂解鍵的裂解 5.

55、羥胺裂解羥胺裂解 6. Asp Pro鍵的裂解鍵的裂解 （二）（二）蛋白質(zhì)的酶法裂解蛋白質(zhì)的酶法裂解 二、肽段的分高純化及純度鑒定二、肽段的分高純化及純度鑒定 （一）（一）肽段的分離純化肽段的分離純化 （二）肽段的純度鑒定（二）肽段的純度鑒定 MetMet X X Trp X X 2 -硝基硝基-5-5-硫氰苯甲酸硫氰苯甲酸（NTCBNTCB）和（）和（2-2-甲基）甲基）-N-N-l-l-苯磺酰苯磺酰-N-4-N-4-（溴乙酰）（溴乙酰）醌二亞酰胺（醌二亞酰胺（CyssorCyssor ）AsnGlyGly 酸，酸，羥胺羥胺pH2.5pH2.5 一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：純肽只有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：純肽只有一個(gè)一個(gè)

56、N 端端一、肽鏈的專一性水解一、肽鏈的專一性水解裂解時(shí)有兩個(gè)問題必須注意裂解時(shí)有兩個(gè)問題必須注意一、要求裂解點(diǎn)少，專一性強(qiáng)、收率高一、要求裂解點(diǎn)少，專一性強(qiáng)、收率高二、與二硫鍵相關(guān)二、與二硫鍵相關(guān)方法基本上分兩大類：方法基本上分兩大類：一、化學(xué)法一、化學(xué)法二、酶法二、酶法回節(jié)目錄（一）蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解（一）蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解 化學(xué)法裂解的肽段一般較大，適化學(xué)法裂解的肽段一般較大，適于在自動(dòng)序列分析儀中測(cè)定序列，同于在自動(dòng)序列分析儀中測(cè)定序列，同時(shí)有利于肽段的吻合，所以化學(xué)法對(duì)時(shí)有利于肽段的吻合，所以化學(xué)法對(duì)較大分子量的蛋白質(zhì)的序列測(cè)定是很較大分子量的蛋白質(zhì)的序列測(cè)定是很重要的。下面介紹最常用的化

57、學(xué)裂解重要的。下面介紹最常用的化學(xué)裂解法法。 l溴化氰裂解溴化氰裂解 溴化氰能專一裂解蛋氨酸殘基的溴化氰能專一裂解蛋氨酸殘基的羧端肽鍵羧端肽鍵，產(chǎn)率達(dá)到，產(chǎn)率達(dá)到85。溴化氰與。溴化氰與蛋白質(zhì)中蛋氨酸側(cè)鏈硫醚基反應(yīng)，生蛋白質(zhì)中蛋氨酸側(cè)鏈硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，此產(chǎn)物與水進(jìn)一步成溴化亞氨內(nèi)酯，此產(chǎn)物與水進(jìn)一步反應(yīng)，將肽鍵斷裂，反應(yīng)如下圖所示：反應(yīng)，將肽鍵斷裂，反應(yīng)如下圖所示： 溴化亞氨內(nèi)酯溴化亞氨內(nèi)酯 反應(yīng)在酸性介質(zhì)中進(jìn)行。此時(shí)巰基也能反應(yīng)在酸性介質(zhì)中進(jìn)行。此時(shí)巰基也能發(fā)生反應(yīng)，但不切斷肽鏈。若事先用烷基發(fā)生反應(yīng)，但不切斷肽鏈。若事先用烷基化試劑保護(hù)巰基，可防止此反應(yīng)發(fā)生。化試劑保護(hù)巰基，

58、可防止此反應(yīng)發(fā)生。注意：注意：Ser、Thr干擾；干擾； AspPro 蛋白質(zhì)一般含蛋白質(zhì)一般含 Met較少，所以溴化氰裂解蛋白質(zhì)能得到大的肽段。較少，所以溴化氰裂解蛋白質(zhì)能得到大的肽段。Met 如被氧化成砜或亞砜，則不能發(fā)生裂解反應(yīng)，所以整個(gè)反應(yīng)要如被氧化成砜或亞砜，則不能發(fā)生裂解反應(yīng)，所以整個(gè)反應(yīng)要在氮?dú)馊萜髦羞M(jìn)行。溴化氰相對(duì)在氮?dú)馊萜髦羞M(jìn)行。溴化氰相對(duì)Met要過量要過量 50100倍（摩爾比），倍（摩爾比），反應(yīng)時(shí)間通常反應(yīng)時(shí)間通常24小時(shí)。小時(shí)。2. BNPSSkatole法法 在酸性介質(zhì)中，用溴化劑裂解多肽已經(jīng)多年了。在酸性介質(zhì)中，用溴化劑裂解多肽已經(jīng)多年了。例如，例如，N 溴琥珀酰

59、亞胺（溴琥珀酰亞胺（NBS）可在不同部位裂解可在不同部位裂解多肽，包括多肽，包括Trp、Tyr、His等部位，但常有副反應(yīng)，產(chǎn)等部位，但常有副反應(yīng)，產(chǎn)生不溶物。生不溶物。BNPSskatole是一種溫和的氧化劑和溴化是一種溫和的氧化劑和溴化劑。劑。該試劑對(duì)該試劑對(duì)Trp裂解的專一性比裂解的專一性比NBS高，產(chǎn)率通常在高，產(chǎn)率通常在5070，缺點(diǎn)是試劑不太穩(wěn)定，對(duì)光敏感，所以反，缺點(diǎn)是試劑不太穩(wěn)定，對(duì)光敏感，所以反應(yīng)要在暗處進(jìn)行。它可應(yīng)要在暗處進(jìn)行。它可在在Trp殘基的殘基的 羧基一側(cè)裂解肽羧基一側(cè)裂解肽鍵鍵。蛋白質(zhì)中一般含。蛋白質(zhì)中一般含Trp極少，所以這是一個(gè)很有用的極少，所以這是一個(gè)很有用

60、的裂解方法。裂解方法。Met和和Tyr也能與該試劑作用，但也能與該試劑作用，但Met在反在反應(yīng)結(jié)束后可用還原劑（巰基乙醇）再生，而與應(yīng)結(jié)束后可用還原劑（巰基乙醇）再生，而與Tyr的反的反應(yīng)可用加入過量應(yīng)可用加入過量Tyr來避免。來避免。 BNPSskatole的結(jié)構(gòu)式的結(jié)構(gòu)式返回3. 亞碘酰基苯甲酸裂解法亞碘酰基苯甲酸裂解法此試劑可在相當(dāng)溫和條件下此試劑可在相當(dāng)溫和條件下裂解裂解 Trp X 肽鍵肽鍵，產(chǎn)率可達(dá)，產(chǎn)率可達(dá)70100。反應(yīng)機(jī)理是氧化吲。反應(yīng)機(jī)理是氧化吲哚環(huán)。哚環(huán)。蛋白質(zhì)溶在蛋白質(zhì)溶在 4 molL鹽酸胍（用鹽酸胍（用 80醋酸醋酸液配制）中，再加甲酚并與該試劑于室溫暗處反液配制）