1、1會計學氨基酸和蛋白質一級結構氨基酸和蛋白質一級結構1.1 蛋白質是由二十種不同的氨基酸構成的蛋白質是由二十種不同的氨基酸構成的 蛋白質是由氨基酸構成的聚合物，所有生物都是利用這20種氨基酸作為構件組裝成各種蛋白質分子的。因此這20種氨基酸被認為是通用的或是標準的氨基酸。盡管氨基酸的種類有限，但由于氨基酸在蛋白質中連接的次序以及氨基酸數目的不同，所以可以組裝成幾乎無限的不同種類的蛋白質。20種氨基酸都被稱之-氨基酸，因為-氨基酸分子中的-碳（分子中第2個碳，C）結合著一個氨基和一個酸性的羧基，此外C還結合著一個H原子和一個側鏈基團（用R表示）。每一種氨基酸的R都是不同的，側鏈上的碳依次按字母命

2、名為、和碳，分別指的是第3、4、5和6位碳。 表表1.1 20種標準氨基酸的英文名稱及簡寫符號種標準氨基酸的英文名稱及簡寫符號中文名稱英文名稱三字母縮寫單字母符號甘氨酸GlycineGlyG丙氨酸AlanineAlaA纈氨酸ValineValV亮氨酸LeucineLeuL異亮氨酸IsoleucineIleI脯氨酸ProlineProP苯丙氨酸PhenylalaninePheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸TryptophanTrpW絲氨酸SerineSerS蘇氨酸ThreonineThrT半胱氨酸CystineCysC蛋氨酸MethionineMetM天冬酰胺AsparagineAsnN

3、谷氨酰胺GlutarnineGlnQ天冬氨酸Aspartic acidAspD谷氨酸Glutamic acidGluE賴氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR組氨酸HistidineHisH種標準氨基酸可以按其側鏈分類種標準氨基酸可以按其側鏈分類 20種氨基酸按照它們的側鏈基團可以分為：6種脂肪族、3種芳香族、2種含硫、2種羥基、3種堿性、2種酸性和2種酰胺氨基酸。1、R為脂肪族基團的氨基酸為脂肪族基團的氨基酸 甘氨酸的結構在20種氨基酸中最簡單，因為它的側鏈是個氫原子，所以甘氨酸的甘氨酸的 -碳不是手性碳碳不是手性碳。丙氨酸（丙氨酸（ -氨基丙酸）氨基丙酸）的側鏈是一個簡單的

4、甲基；纈氨酸（纈氨酸（ -氨基異戊酸）氨基異戊酸）的側鏈是一個含有支鏈的3碳側鏈；亮氨酸（亮氨酸（ -氨基異己酸）和異亮氨酸（氨基異己酸）和異亮氨酸（ -氨基氨基-甲基戊酸）甲基戊酸）都是含有支鏈的4碳側鏈。要注意的是，異亮氨酸分子中的異亮氨酸分子中的 -碳和碳和 -碳都是不對稱碳。所以異亮氨酸碳都是不對稱碳。所以異亮氨酸存在著存在著4種可能的立體異構體種可能的立體異構體：L-異亮氨酸， D-異亮氨酸，L-別構異亮氨酸，和D-別構異亮氨酸（別構是指一個異構形式），脯氨酸（脯氨酸（-吡咯烷基吡咯烷基- -羧酸）羧酸）明顯地不同于其它19種氨基酸，它有一個環形的飽和烴側鏈，結合在-氨基的氮和-碳上

5、。所以嚴格地講，脯氨酸是一個亞氨基酸，因為它含有一個二級氨基，而不是一級氨基。不過在蛋白質中發現的脯氨酸也象其它氨基酸一樣，它的-碳也是手性碳。脯氨酸的雜環吡咯烷環限制多肽的幾何構型，有時會在多肽鏈中引進一個轉折的變化。2、R為芳香族基團的氨基酸為芳香族基團的氨基酸 苯丙氨酸（苯丙氨酸（ -氨基氨基-苯丙酸）苯丙酸）是一個含有苯基的氨基酸。酪氨酸（酪氨酸（ -氨基氨基-對羥基苯丙酸）對羥基苯丙酸）的結構類似于苯丙氨酸，稱之對羥基苯丙氨酸。酚是個比較弱的酸，所以酪氨酸側鏈的pKa值為10.5。色氨酸（色氨酸（-吲哚吲哚- -氨基丙酸）氨基丙酸）的側鏈帶有一個雙環的吲哚基，所以色氨酸又稱之吲哚丙氨

6、酸吲哚丙氨酸。三種芳香族氨基酸都吸收紫外光，在中性pH條件下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280nm，而苯丙氨酸的在260nm，大多數蛋白質中都含有色氨酸和酪氨酸或其中的一種，所以溶液中280nm吸收的測量常用來估算蛋白質的濃度。3、R為含硫基團的氨基酸為含硫基團的氨基酸 蛋氨酸和半胱氨酸是兩個含硫氨基酸。蛋氨酸（蛋氨酸（ -氨基氨基-甲硫基丁甲硫基丁酸）酸）是個疏水氨基酸，它的側鏈上帶有一個非極性的甲基硫醚基，不過其中的硫原子是親核的。半胱氨酸（半胱氨酸（ -氨基氨基-巰基丙酸）巰基丙酸）側鏈上含有一個巰基（-SH），所以又稱之巰基丙氨酸。雖然半胱氨酸的側鏈顯得有點疏水性，但-SH也是一個高

7、反應性的基團。4、R為含醇基基團的氨基酸為含醇基基團的氨基酸 絲氨酸和蘇氨酸是兩個側鏈含有-羥基的不帶電荷的氨基酸：蘇氨酸（蘇氨酸（ -氨基氨基-羥基丙酸）、絲氨酸（羥基丙酸）、絲氨酸（ -氨基氨基-羥基丁酸羥基丁酸）。）。盡管絲氨酸的羥甲基（-CH2OH）在水溶液看不出離子化，但這個醇可以參與很多酶的活性部位反應，就象已被離子化了一樣。要注意，蘇氨酸也象異亮氨酸一樣，具有兩個手性碳原子，即-碳和-碳原子，通常出現在蛋白質中的L-蘇氨酸只是4種立體異構體中的一種，5、R為堿性基團的氨基酸為堿性基團的氨基酸 有5種氨基酸在pH7時它們的側鏈基團帶有電荷，其中有3種是帶正電荷的堿性R基團，另外2種

8、是帶負電荷的酸性R基團。組氨酸、賴氨酸和精氨酸它們都帶有親水性的含氮堿基R基團。組氨組氨酸（酸（ -氨基氨基-咪唑基丙酸）咪唑基丙酸）的側鏈有一個咪唑環，所以又稱之咪唑丙氨酸。咪唑基是可以離子化的（pKa6.0）。賴氨酸（賴氨酸（ , -二氨基己酸）二氨基己酸）是一個雙氨基酸，含有-和-氨基。在中性pH，-氨基是以堿性氨離子（-CH2-NH3）形式存在的，在蛋白質中通常帶正電荷。精氨酸（精氨酸（ -氨基氨基-胍基戊酸）胍基戊酸）是20種氨基酸中堿性最強的氨基酸，它的側鏈胍基離子的pKa值最高（pKa12.5）。6、R為酸性基團的氨基酸為酸性基團的氨基酸 天冬氨酸（天冬氨酸（ -氨基丁二酸）和谷

9、氨酸（氨基丁二酸）和谷氨酸（ -氨基戊二酸）氨基戊二酸）是二羧基氨基酸，除了含有-羧基外，天冬氨酸還含有-羧基，谷氨酸還含有-羧基。由于兩個氨基酸的側鏈在pH7時都離子化了，所以在蛋白質中是帶負電荷的，這兩個氨基酸經常出現在蛋白質分子表面上，谷氨酸的單鈉鹽是調味品味精。7、R為含酰胺基團的氨基酸為含酰胺基團的氨基酸 天冬酰胺（天冬酰胺（-氨基氨基-羧基丙酰胺羧基丙酰胺）和谷氨酰胺（）和谷氨酰胺（-氨基氨基-羧基丁羧基丁酰胺酰胺）分別是天冬氨酸和谷氨酸的酰胺化產物。盡管這兩個氨基酸的側鏈是不帶電荷的，但它們的極性很強，也經常出現在蛋白質分子的表面，它們可以和水相互作用。另外這兩種氨基酸的酰胺基可

10、以與其它的極性氨基酸的側鏈上的原子形成氫鍵。必需和非必需氨基酸：必需和非必需氨基酸： 以上氨基酸分類完全是根據側鏈的性質分類的，從營養學角度又可將氨基酸分為必需和非必需氨基酸。必需氨基酸包括賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸必需氨基酸包括賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸和精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸和精氨酸，其中組氨酸和精氨酸，人雖然能合成，但效率低，尤其在嬰幼兒時期，需要由外界供給。非必需氨基酸是其余的非必需氨基酸是其余的10種氨基酸：甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、種氨基酸：甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、

11、天冬酰胺、脯氨酸和丙氨酸。酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和丙氨酸。5678氨基酸的離子狀態取決于環境的氨基酸的離子狀態取決于環境的pH 表1.2 給出了25下游離氨基酸的酸性和堿性基團的pKa值和氨基酸的等電點（pI）。氨基酸分子量-COOHpKa-NH3+R 基團pI蛋白質中出現的幾率 (%)*甘氨酸752.349.605.977.5丙氨酸892.349.696.019.0纈氨酸1172.329.625.976.9亮氨酸1312.369.605.987.5異亮氨酸1312.369.686.024.6脯氨酸1151.9910.966.484.6苯丙氨酸1651.839.1

12、35.483.5酪氨酸1812.209.1110.075.663.5色氨酸2042.389.395.891.1絲氨酸1052.219.155.687.1蘇氨酸1192.119.625.876.0半胱氨酸1211.968.1810.285.052.8蛋氨酸1492.289.215.741.7天冬酰胺1322.028.805.414.4谷氨酰胺1462.179.135.653.9天冬氨酸1331.889.603.652.775.5谷氨酸1472.199.674.253.226.2賴氨酸1462.188.9510.539.747.0精氨酸1742.179.0412.4810.764.7組氨酸1551

13、.829.176.007.592.1* 在 200 多種蛋白質中出現的平均幾率。氨基酸的-COOH基是個弱酸，利用Henderson-Hasselbalch方程可以計算任何pH下離子化基團的比例。 共軛堿pHpKalog 弱酸從表1.2可以看出，游離氨基酸的-COOH的pKa值的范圍是1.8至2.5。對于一個典型的氨基酸它的-COOH的pKa值大約是2，羧酸鹽對羧酸的比是羧酸鹽對羧酸的比是100000 : :1，所以在中性pH條件下，占優勢的成分是羧酸鹽離子。 RCOO7.02.0log RCOOH-氨基的pKa值的范圍是8.7至10.7。它的共軛堿（游離的胺它的共軛堿（游離的胺-NH2）對共

14、軛酸）對共軛酸（質子化的胺（質子化的胺-NH3）的比，在）的比，在pH7時為時為1: :1000。計算表明，在中性pH條件下，游離氨基酸主要是以兼性離子形式存在的。所以將一個氨基酸畫成帶有所以將一個氨基酸畫成帶有-COOH和和-NH2基團的形式是不合適的。因為不存在這樣一種基團的形式是不合適的。因為不存在這樣一種pH，即在這一，即在這一pH下，下，-COOH和和-NH2都占優勢。都占優勢。脯氨酸的氨基（pKa10.6）在中性pH條件下也是質子化的堿基形式，雖然側鏈與-氨基結合，脯氨酸在pH7時仍是一種兼性離子。 通過氨基酸的滴定曲線可以確定氨基酸的各個解離基團的pKa值。圖1.4給出了丙氨酸和

15、組氨酸的滴定曲線。丙氨酸有兩個可解離基團，-COOH和-NH3，它們的pKa值分別是2.4和9.9，每一個值都是位于滴定曲線緩沖區的中心。組氨酸有3個可解離基團，即-COOH、-NH3和側鏈基團咪唑基，pKa值分別是1.8、6.0和9.3，也都是處于緩沖區的中心。使用離子交換層析可將各種氨基酸分開使用離子交換層析可將各種氨基酸分開 層析（層析（chromatography）也稱之色譜（來自Chroma），其基本原理是分析樣品作為流動相流過固相時，樣品中的各個成分與固相進行著不同程度的相互作用，使得樣品中的各個成分在固相中的遷移率產生了差別，從而達到分離樣品的目的。 根據固相與樣品中各個成分之間

16、相互作用的種類的不同，又有離子交換層又有離子交換層析、分子篩層析和吸附層析等各種層析方法。析、分子篩層析和吸附層析等各種層析方法。通常都是將固相裝到一個柱子里，然后使流動相流過柱子（有時需要加壓力），這樣的層析方法叫做柱層析（column chromatography）。 如果被分離的樣品中各個成分受溶液如果被分離的樣品中各個成分受溶液pH的影響，有時帶正電荷，有時帶的影響，有時帶正電荷，有時帶負電荷，此時就可利用離子交換層析方法進行樣品的分離。離子交換層析的負電荷，此時就可利用離子交換層析方法進行樣品的分離。離子交換層析的固相是離子交換體，其中有離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚固相

17、是離子交換體，其中有離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。糖。通常是以樹脂、或是纖維素、或是葡聚糖作為基質，這些基質具有網狀結構，將帶電基團引入到基質上托緯閃死胱詠換皇髦菀氳拇緇挪煌址治衾胱詠換惶搴鴕趵胱詠換惶濉 引入SO3Na 或COOH基團的叫做陽離子交換體；引入N（C2H5）Cl基團的叫做陰離子交換體。 分離氨基酸常用的是帶有耐酸性非常強的磺酸根SO3Na（以鹽的形式出現）的強陽離子交換樹脂。首先將這種樹脂填充到柱子中，然后注入含有樣品的流動相，樣品中含有陽離子成分X，通過靜電吸引，與樹脂中的帶電基團相互作用，結果X與Na交換，即發生陽離子交換后，形成SO3X。氨基酸可進行特征的

18、化學反應氨基酸可進行特征的化學反應 氨基酸的-氨基、-羧基以及氨基酸的各種側鏈基團可進行很多種化學反應。氨基酸與茚三酮（氨基酸與茚三酮（ninhydrin）的反應是一個檢測和定量氨基酸和蛋白）的反應是一個檢測和定量氨基酸和蛋白質的重要反應。質的重要反應。茚三酮在弱酸性溶液中與氨基酸共熱，所有具有游離氨基的所有具有游離氨基的氨基酸都生成紫色化合物（氨基酸都生成紫色化合物（ 470）（圖1.7）。然而由于脯氨酸是一個亞氨基脯氨酸是一個亞氨基酸，所以與茚三酮反應生成的是黃色化合物（酸，所以與茚三酮反應生成的是黃色化合物（ 440）。 有幾種與氨基酸的氨基反應的試劑常用來鑒定蛋白質和多肽的N-末端氨基

19、酸殘基。 2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）也叫做）也叫做Sanger試試劑劑。DNFB在弱堿性溶液中與氨基酸發生取代反應，生成黃色化合物二硝基二硝基苯基氨基酸苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸氨基酸）（圖1.8a）。丹磺酰氯（丹磺酰氯（dansyl chloride）是）是5-二甲基氨基萘二甲基氨基萘-1-磺酰氯（磺酰氯（5-dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride）的簡稱。丹磺酰）的簡稱。丹磺酰氯與氨基酸反應生成熒光性質強和穩定的磺胺衍生

20、物氯與氨基酸反應生成熒光性質強和穩定的磺胺衍生物（圖1.8b），也常用于多肽鏈的N末端氨基酸的鑒定。 苯異硫氰酸酯（苯異硫氰酸酯（phenylisothiocyanate, PITC）在弱堿性條件下，）在弱堿性條件下，與氨基酸反應生成苯乙內酰硫脲（與氨基酸反應生成苯乙內酰硫脲（phenylthiohydantoin, PTH）衍生物）衍生物，即，即PTH-氨基酸（圖氨基酸（圖1.8c），此反應又稱之），此反應又稱之Edman反應，該反應是蛋白反應，該反應是蛋白質或多肽氨基酸序列測定常用的反應質或多肽氨基酸序列測定常用的反應。1.2蛋白質中的氨基酸是通過肽鍵連接的蛋白質中的氨基酸是通過肽鍵連接的

21、 一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基縮合，通過形成的酰胺鍵將兩個氨基酸連接在一起，這個酰胺鍵稱之肽鍵（peptide bond）（圖1.9），氨基酸縮合生成的產物稱之肽（peptide）。1.3肽可以化學合成肽可以化學合成 多肽合成的基本過程是本世紀初由Emil Fischer設計的，稱為液相合成法，肽鏈從N端向C端方向延伸。首先一個氨基酸的羧基和另一個氨基酸的氨基被保護基團封閉，然后參與肽鍵形成的羧基被激活，如形成脂酰氯，或酸酐。激活的羧酸受到游離氨基的親電攻擊形成一個封閉的二肽（圖1.11）。最后通過水解有選擇地除去保護基團而留下一個完整的肽鍵。1.4蛋白質可以通過各種生物化學技術純

22、化蛋白質可以通過各種生物化學技術純化利用蛋白質的溶解度、凈電荷、大小以及與配體結合特異性上的微小差異。有透析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、電泳（垂直板電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳）等分離純化方法。透析透析離子交換層析離子交換層析 離子交換層析同樣可以用于蛋白質的分離純化。由于蛋白質也有等電點離子交換層析同樣可以用于蛋白質的分離純化。由于蛋白質也有等電點，當蛋白質處于不同的，當蛋白質處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的

23、蛋白質首先被洗脫下來。凝膠過濾層析（凝膠過濾層析（Gel-filtration chromatography） 凝膠層析是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠過濾，凝膠層析是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。單個凝膠珠本身象個分子篩層析或排阻層析。單個凝膠珠本身象個“篩子篩子”。不同類型凝膠的。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。篩孔的大小不同。C 親和層析（親和層析（Affinity chromatography） 這是一種最有選擇性的柱層析，其原理是依賴于蛋白質和它的配體（其原理是依賴于蛋白質和它的配體（ligand）之間的相互作用來分離的）之間

24、的相互作用來分離的。配體通常指的是能與另一個分子或原子結合（一般是非共價結合）的分子、基團、離子、或原子。但在親和層析中，配體是通過共價鍵先與基質結合，配體可以是酶結合的一個反應物或產物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體。當蛋白質混合物通過裝有連接了配體的基質的親和層析柱時，只當蛋白質混合物通過裝有連接了配體的基質的親和層析柱時，只有靶蛋白可以特異地與基質結合，而其它沒有結合的蛋白質首先被洗脫下來。特有靶蛋白可以特異地與基質結合，而其它沒有結合的蛋白質首先被洗脫下來。特異結合在基質上的靶蛋白最后可以用含有高濃度的自由配體的溶劑異結合在基質上的靶蛋白最后可以用含有高濃度的自由配體的溶劑。所以有時只用

25、親和層析就可使蛋白質的純化提高1000至10000倍。電泳分離蛋白質是根據蛋白質在電場中的遷移率電泳分離蛋白質是根據蛋白質在電場中的遷移率 電泳分離蛋白質是根據蛋白質在電場中的遷移的差別達到分離目的的。蛋白質樣品加到一塊預先制好的凝膠介質上，只要在凝膠的兩端加上電場，就可以達到分離蛋白質的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（gel electrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（starch gel）、瓊脂糖凝膠（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel）。一般凝膠介質中的pH被維持在堿性區，目的是使大多數蛋白質都帶有負電荷，這樣它們可以向陽極遷移。蛋白質

26、的遷移與蛋白質的質量和帶電荷的多少有關，我們介紹其中常用的幾種主要的電泳技術。A SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 使用含有一種去污劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate, SDS）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對蛋白質樣品進行處理（一般煮沸35分鐘），通過加熱和SDS可以使蛋白質變性，多亞基的蛋白質也將解離為單亞基。同時還原劑可以切斷蛋白質中的任何一個二硫鍵（使二硫鍵還原）。經過這樣處理的樣品中的肽鏈都是處于無二硫鍵連接的，分離的狀態。由于SDS是帶有負電荷的分子，同時

27、它有一個長的疏水尾巴，SDS通過疏水尾巴與肽鏈中的氨基酸的疏水側鏈結合，結合SDS的比率大約是一個蛋白質分子中每兩個氨基酸殘基結合一分子的SDS。B 等電聚焦電泳（等電聚焦電泳（Isoelectric focusing electrophoresis, IFE） 等電聚焦電泳是一種電泳的改進技術，實際上是利用聚丙烯酰胺凝膠內的緩沖液在電場作用下在凝膠內沿電場方向制造一個pH梯度。所用的緩沖液是低分子量的有機酸和堿的混合物，該混合物稱之兩性電解質（ampholytes）。當蛋白質樣品在這樣的凝膠上電泳時，每種蛋白質都將遷移至與它的pI 相一致的pH處（圖1.18），具有不同pI的各種蛋白質最后都

28、遷移至凝膠中相應的pH處，達到分離的目的。C 雙向電泳（雙向電泳（two-dimensional electrophoresis） 如果將等電聚焦電泳與SDS-PAGE結合起來，就是分辨率更高的一種雙向電泳了（圖1.19）。雙向電泳后的凝膠經染色蛋白呈現二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直方向反映出它們在分子量上的差別。所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點不同的蛋白質以及等電點相同而分子量不同的蛋白質分開。1.5蛋白質一級結構就是它的氨基酸序列蛋白質一級結構就是它的氨基酸序列 從1953年Sanger測定了胰島素的全部氨基酸序列。每一種蛋白質都具每一種蛋白質都具有唯一的氨基酸序

29、列。實際上蛋白質的氨基酸序列是由有唯一的氨基酸序列。實際上蛋白質的氨基酸序列是由DNA決定的。決定的。測定蛋白質的氨基酸序列具有重要意義，第一，測定蛋白質的氨基酸序列是闡闡明蛋白質生物活性的分子基礎明蛋白質生物活性的分子基礎。其次，研究表明蛋白質的一級結構決定它蛋白質的一級結構決定它的空間結構的空間結構。第三，氨基酸序列的改變可以產生異常功能和疾病，氨基酸序列的改變可以產生異常功能和疾病，例如致命的鐮刀形紅細胞貧血病。因此序列測定成為分子病理學的一個部分。最后蛋白質的氨基酸序列能指明它的進化史蛋白質的氨基酸序列能指明它的進化史。蛋白質的氨基酸組成可以定量確定蛋白質的氨基酸組成可以定量確定 首先

30、通過酸水解破壞蛋白質的肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件下，110，用，用6M鹽酸水解鹽酸水解16至至72小時。水解的混合物（水解液）進行柱層析，通小時。水解的混合物（水解液）進行柱層析，通過柱層析可以將水解液中的每一個氨基酸分離出來并被定量，這一過程稱之氨基過柱層析可以將水解液中的每一個氨基酸分離出來并被定量，這一過程稱之氨基酸分析（酸分析（amino acid analysis）。其中一種氨基酸分析方法是用苯異硫氰酸酯）。其中一種氨基酸分析方法是用苯異硫氰酸酯（PITC）處理蛋白質水解液（）處理蛋白質水解液（pH9），生成苯硫脲（），生成苯硫脲（PTC）-氨基酸衍生物，氨基酸衍生物，PTC

31、-氨基酸混合物經氨基酸混合物經HPLC（細硅膠柱），按照它們的疏水特性被分離。分離的（細硅膠柱），按照它們的疏水特性被分離。分離的每個每個PTC-氨基酸經測量氨基酸經測量254nm（PTC-氨基酸吸收峰波長）光吸收，確定它們的氨基酸吸收峰波長）光吸收，確定它們的濃度濃度。圖1.20給出了PTC-氨基酸混合物HPLC的洗脫圖，圖中的峰用各個氨基酸的吸收峰，用標準的單個字母表示。由于存在于水解液中每個氨基酸的量是與洗脫峰的面積成比例的。降解方法常用于氨基酸序列的測定降解方法常用于氨基酸序列的測定 P. Edman降解測序主要涉及耦聯、水解、萃取和轉換等4個過程。首先使用苯異硫氰酸酯（PITC）在p

32、H9.0的堿性條件下對蛋白質或多肽進行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機溶劑（例如氯丁烷）從反應液中萃取出來，而去掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩定，經酸作用，再進一步環化，形成一個穩定的苯乙內酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸（圖1.21）。蛋白質一級結構的比較可以揭示進化關系蛋白質一級結構的比較可以揭示進化關系 蛋白質一級結構是由編碼它的基因確定的，蛋白質一

33、級結構之間的差別蛋白質一級結構是由編碼它的基因確定的，蛋白質一級結構之間的差別可以反映出進化關系可以反映出進化關系。來自親緣關系密切的蛋白質的氨基酸序列非常類似，一級結構中氨基酸殘基序列差別越大，反映出它們的親緣關系就較遠。細胞色素細胞色素c是由一條含有是由一條含有104至至111個氨基酸殘基的多肽鏈組成的，由于細胞個氨基酸殘基的多肽鏈組成的，由于細胞色素色素c幾乎存在于所有的需氧生物中，所以通過在分子水平上比較來自不同幾乎存在于所有的需氧生物中，所以通過在分子水平上比較來自不同種屬的細胞色素種屬的細胞色素c，可以看出它們之間的進化關系，可以看出它們之間的進化關系。圖1.24就是根據不同種屬的

34、細胞色素c的氨基酸殘基的差別繪制出的進化樹，形成的每一個樹杈的長度都與蛋白質中氨基酸殘基的差別數成比例。例如人與黑猩猩的細胞色例如人與黑猩猩的細胞色素素c的氨基酸序列完全一樣，但與猴、狗、金槍魚和酵母的細胞色素的氨基酸序列完全一樣，但與猴、狗、金槍魚和酵母的細胞色素c相比相比，可變換的氨基酸殘基數依次為，可變換的氨基酸殘基數依次為1、10、21和和44。那些進化中不易改變的、保守的氨基酸殘基是維持細胞色素c功能所必需的。由同一個祖先進化來的表現出序列相似性的蛋白質稱之同源蛋白質同源蛋白質。要點提示要點提示1.蛋白質是由20種氨基酸組成的。氨基酸性質方面的差別反映了它們側鏈的不同。除了甘氨酸沒有

35、手性碳以外，其他19種氨基酸都至少含有一個手性碳。2.氨基酸的側鏈可以按照它們的化學結構分為：脂肪族的、芳香族的、含硫的、含醇的、堿性的、酸性的和酰胺類。3.氨基酸和多肽的酸性和堿性基團的離子狀態取決于pH。4.許多氨基酸具有非極性的側鏈，在水溶液中它們傾向于聚集在一起，以減少與水相互作用的面積，這種傾向稱為疏水相互作用。5.茚三酮與脯氨酸反應生成黃色化合物，與其它氨基酸生成的都是紫色化合物。2,4-二硝基氟苯、丹黃酰氯和苯異硫氰酸酯都能與氨基反應。6.蛋白質中的氨基酸殘基是通過肽鍵連接的，殘基的序列稱之為蛋白質的一級結構。肽和小的蛋白質可以利用液相或固相合成法。7.可以根據蛋白質溶解度、凈電荷、大小以及結合特性上的差異，從生物資源中純化蛋白質。常用方法包括離子交換層析、凝膠過濾層析、HPLC、SDS-PAGE、等電聚焦和雙向電泳等方法。8.多肽的氨基酸序列可以通過Edman降解確定。利用蛋白酶和化學試劑有選擇地水解