1、糖分析檢測1單糖的結構基礎知識 糖的表示式糖的表示式CH2OHCHOCHOCH3CHOCH2OHOCHOCH2OHD-木糖L-鼠李糖D-葡萄糖D-果糖五碳醛糖甲基五碳醛糖六碳醛糖六碳酮糖CHOCH2OHOD-葡萄糖2 單糖是多羥基醛或酮多羥基醛或酮。從3 3碳糖至8 8碳糖天然界都有存在。每個糖都有兩個以上的手性碳原子，它們的命名規則是：碳原子的排列順序是從醛基或者酮基基團為C-1開始的。單糖在水溶液中形成半縮醛環狀結構，即成呋喃糖和吡喃糖。具有六元六元環結構的糖吡喃糖（pyranose）具有五元五元環結構的糖呋喃糖（furanose）糖處游離狀態時用Fischer式表示，苷化后成環用Hawo

2、rth式表示單糖的結構基礎知識 醛糖和酮糖醛糖和酮糖甘油醛和二羥基丙酮有相同的化學組成，C3H6O3，但是不同的結構，它們屬于結構異構體。CCCH2OHHOOHHCCCH2OHHOHHOmirror planL- glyceraldehydeD- glyceraldehyde3CCHOHCH2OHOHG ly c e r a ld e h y d e(a n a ld o s e )C3H6O3CH2OHCCH2OHD ih y d r o x y a c e to n e(a n k e to s e )C3H6O3O甘油醛有一個不對成碳原子（手性碳原子），所以它有兩個立體異構體，即D-和L

3、-型。并且互為鏡像異構體。單糖的結構基礎知識 Fischer與Haworth的轉換及其相對構型 CHOCH2OHOOCCH2OHHOHOCCH2OHOHHOD-葡萄糖異側同側異側同側4 單糖成環后新形成的一個不對稱碳原子稱為端基碳（anomeric carbon）。生成的一對差向異構體（anomer）有、二種構型。從Fischer式看（C1與C5的相對構型）：C1-OH與原C5（六碳糖）或C4（五碳糖）-OH，順式為，反式為。從Haworth式看：C1-OH與C5（或C4）上取代基之間的關系：同側為，異側為。單糖的結構基礎知識OCCH2OHOHHCHOCHOCH2OHCHOCH3CH3O-OH

4、甘油醛D 型D-葡萄糖L-鼠李糖-D-葡萄糖-L-鼠李糖5糖的絕對構型（糖的絕對構型（D、L） 絕對構型D-和L-的判斷是從醛基或者酮基開始最遠的手性碳原子。 Fischer式中最后第二個碳原子上-OH向右的為D型，向左的為L型。Haworth式中C5向上為D型，向下為L型。單糖的結構基礎知識 環的構象環的構象 OOO1234(2)(3)(4)(5)OOC1式1C式12345123456 呋喃糖五元環接近在同一平面上。唯醛糖的C3、酮糖的C4超出平面0.5A，幾乎是固定的結構。 六元環有船式和椅式構象，在溶液或固體狀態是都是椅式構象，不是C1便是1C。C表示椅式（chair form）。 以C

5、2、C3、C5、O四個原子構成的平面為準，C4處面上，C1處面下的標為4C1，簡稱C1，反之1C4簡稱1C。Angyal用總自由能來分析構象式的穩定性，比較二種構象式的總自由能差值，能量低的是優勢構象。 多多糖研究的基本步驟糖研究的基本步驟1 1、多糖鏈的釋放、提取（、多糖鏈的釋放、提取（水提、堿解、酶解、堿解結合酶解水提、堿解、酶解、堿解結合酶解）2 2、多糖的分離純化（、多糖的分離純化（蛋白質去除、脫色素、小分子雜質、凝膠柱蛋白質去除、脫色素、小分子雜質、凝膠柱色譜、離子交換柱色譜、分級沉淀色譜、離子交換柱色譜、分級沉淀）3 3、多糖純度檢測多糖純度檢測（ UV、凝膠過濾、電泳、凝膠過濾、

6、電泳、HPLC) )4、多糖一級結構的測定多糖一級結構的測定（糖基組成、連接方式、分子量、異頭碳糖基組成、連接方式、分子量、異頭碳構型、分支等構型、分支等）7糖分析常用方法：糖分析常用方法： 化學法化學法 部分和完全酸水解、乙酰解、甲醇解部分和完全酸水解、乙酰解、甲醇解（水解成單糖）（水解成單糖） 高碘酸氧化、高碘酸氧化、Smith降解降解(糖苷鍵位置，單糖組成和分子比例，聚合糖苷鍵位置，單糖組成和分子比例，聚合度、分支度、分支) 甲基化分析甲基化分析（糖苷鍵位置，包括分支點、單糖組成和分子比例）（糖苷鍵位置，包括分支點、單糖組成和分子比例） 生物法生物法 酶法酶法（糖基連接次序，（糖基連接次

7、序， -/ -異頭體）異頭體） 色譜法色譜法 - PC, TLC（單糖組成）（單糖組成） - HPLC和和GC（單糖組成和分子比例，定量分析）（單糖組成和分子比例，定量分析） 波譜法波譜法 UV（純度檢查）（純度檢查） IR（ -/ -異頭體、吡喃環異頭體、吡喃環/呋喃環）呋喃環） MS（分子量等）（分子量等） NMR（ -/ -異頭體、糖基連接次序）異頭體、糖基連接次序）8多糖分析方法 1.單糖組成分析單糖組成分析 2.糖苷鍵鏈接分析 3.異構體分析 4.多糖分子量的測定多糖分子量的測定 5.糖的連接順序糖的連接順序 6.6.保健食品中保健食品中多糖的定性定量測定方法多糖的定性定量測定方法9

8、水解：多糖水解成單糖。水解：多糖水解成單糖。 完全酸水解：完全酸水解：多糖與強酸（濃硫酸、濃鹽酸）在（多糖與強酸（濃硫酸、濃鹽酸）在（80-100 80-100 ）水解）水解 4-10h4-10h。操作：取樣。操作：取樣20mg20mg，加，加0.5-1mol/L0.5-1mol/L硫酸溶液硫酸溶液mlml，充氮除氧封，充氮除氧封 管，在管，在 水解水解0 0小時，水解液用碳酸鋇中和，離心過濾，濾小時，水解液用碳酸鋇中和，離心過濾，濾 液備用。液備用。 或或20mol20molL L三氟醋酸（三氟醋酸（TFATFA），）， 120120恒溫恒溫 lhlh，或，或2moI2moIL L TFA

9、TFA，100100恒溫恒溫 6h6h。 部分酸水解：部分酸水解：0.02mol/L HCl,0.02mol/L HCl,多糖鏈上呋喃糖苷鍵、位于末端的糖苷鍵多糖鏈上呋喃糖苷鍵、位于末端的糖苷鍵 和支鏈上的糖苷鍵易水解特性。水解后，醇析、離心，將上清液和沉淀和支鏈上的糖苷鍵易水解特性。水解后，醇析、離心，將上清液和沉淀 分別進行分析分別進行分析。 乙酰解：乙酰解：將多糖與乙酐、冰醋酸、濃硫酸等混合反應，可得到乙酰化單將多糖與乙酐、冰醋酸、濃硫酸等混合反應，可得到乙酰化單 糖，用于單糖組成分析。糖，用于單糖組成分析。 甲醇解：甲醇解：多糖與多糖與HCl-CHHCl-CH3 3OHOH混合反應，半

10、縮醛甲基化，減少異構物，有混合反應，半縮醛甲基化，減少異構物，有 利分辨。利分辨。 1 1、單糖組分的確定、單糖組分的確定: :101)1)紙層析紙層析(Paper chromatography, PC)(Paper chromatography, PC)：濾液與標準品同時點于濾紙上，濾液與標準品同時點于濾紙上，展開劑展開后，顯色，根據樣品和標準品的展開劑展開后，顯色，根據樣品和標準品的RfRf值和斑點顏色進行鑒定。值和斑點顏色進行鑒定。溶劑系統溶劑系統 被分離的混合物被分離的混合物乙酸乙酯：吡啶：水（2：1：2）乙酸乙酯：乙酸：水（3：1：3）木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖正丁醇：乙

11、酸：水（4：1：5）葡萄糖，半乳糖，甘露糖，木糖，L-巖藻糖，葡萄糖醛酸，氨基葡萄糖及氨基半乳糖正丁醇：吡啶：水（6：4：3）鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等11苯胺苯胺- -二苯胺顯色劑：二苯胺顯色劑：8080、10min , 10min , 醛糖顯藍、藍紫色或藍綠色，酮糖醛糖顯藍、藍紫色或藍綠色，酮糖呈棕色，檢出限量為呈棕色，檢出限量為10ug10ug。苯胺苯胺- -鄰苯二甲酸顯色劑：鄰苯二甲酸顯色劑：105105、5-10min,5-10min,戊糖顯鮮紅色戊糖顯鮮紅色, ,巳醛糖及糖醛巳醛糖及糖醛酸為棕色酸為棕色, ,在紫外光下有熒光在紫外光下有熒光, ,而一般戊糖則無熒光而一

12、般戊糖則無熒光, ,可用來區別戊糖及巳可用來區別戊糖及巳糖糖, , 氨基葡萄糖呈淺棕斑點氨基葡萄糖呈淺棕斑點, ,紫外下呈黃綠色熒光，靈敏度為紫外下呈黃綠色熒光，靈敏度為1ug1ug。12）薄層層析（）薄層層析（Thin Layer ChromatographyThin Layer Chromatography， TLC)TLC)：硅膠（常用硅膠（常用0.1 0.1 mol/Lmol/L磷酸二氫鈉溶液調配）。磷酸二氫鈉溶液調配）。 水解后薄層檢測：水解后薄層檢測：先將樣品酸水解后，點樣展開檢測。先將樣品酸水解后，點樣展開檢測。 薄層酸水解檢測薄層酸水解檢測: :將點有待測樣品的高效薄層板在將點

13、有待測樣品的高效薄層板在12 N12 N鹽酸蒸氣中鹽酸蒸氣中60 60 C C 水解水解 40 min40 min，取出薄層板待酸揮發干以后，將標準品點于同一塊，取出薄層板待酸揮發干以后，將標準品點于同一塊板上，然后置于層析缸內展開，吹干展開劑后噴糖顯色劑，與標準品板上，然后置于層析缸內展開，吹干展開劑后噴糖顯色劑，與標準品進行對照。進行對照。 13苦豆子膠多糖組分的薄層色譜圖苦豆子膠多糖組分的薄層色譜圖1 1、甘露糖、甘露糖2 2、半乳糖、半乳糖3 3、混合標準單糖、混合標準單糖4 4、苦豆子膠多糖水解物、苦豆子膠多糖水解物例：例： 食品研究與開發食品研究與開發20062006，2727（1

14、111）：）：16116114）HPLCHPLC法：法：A:A:直接直接HPLCHPLC法：法：用用HRC-NH2HRC-NH2色譜柱，乙腈色譜柱，乙腈- -水（水（5 5：2525）為流動相，示差）為流動相，示差檢測器。面積歸一法，還可計算各組分百分含量。檢測器。面積歸一法，還可計算各組分百分含量。B:B:柱前衍生化柱前衍生化HPLCHPLC法：法：1-1-苯基苯基-3-3-甲基甲基-5-5-吡唑啉酮吡唑啉酮(PMP)(PMP)柱前衍生化柱前衍生化HPLCHPLC測定單糖含量，測定單糖含量，PMPPMP是最好衍生化試劑之一，衍生物不易裂解，分析時不是最好衍生化試劑之一，衍生物不易裂解，分析時

15、不產生異構峰，且在產生異構峰，且在250 nm250 nm處有強烈的紫外吸收。（處有強烈的紫外吸收。（C18C18）15例：例：標準單糖標準單糖HPLCHPLC圖譜圖譜庫拉索蘆薈多糖水解庫拉索蘆薈多糖水解衍生物的衍生物的HPLCHPLC圖譜圖譜木立蘆薈多糖水解衍生木立蘆薈多糖水解衍生物的物的HPLCHPLC圖譜圖譜食品科學，食品科學，20062006，2727：194194164) 氣相色譜法（氣相色譜法（Gas Chromatography, GC)或或GC-MS法：法：先衍生化成硅烷化衍生物，先衍生化成硅烷化衍生物，GCGC分離后檢測糖的組分及摩爾比。可與分離后檢測糖的組分及摩爾比。可與

16、MSMS聯聯用用GC-MS GC-MS 。凡是凡是能夠氣化且穩定、能夠氣化且穩定、不具腐蝕性的液體或氣體，都可用氣相色譜不具腐蝕性的液體或氣體，都可用氣相色譜法分析。有的化合物沸點過高難以氣化或熱不穩定而分解，則可通法分析。有的化合物沸點過高難以氣化或熱不穩定而分解，則可通過化學衍生化的方法，使其轉變成易氣化或熱穩定的物質后再進行過化學衍生化的方法，使其轉變成易氣化或熱穩定的物質后再進行分析。分析。 局限性：局限性：不適于高沸點、難揮發、熱穩定性差的高分子化合物和生不適于高沸點、難揮發、熱穩定性差的高分子化合物和生物大分子化合物分析。物大分子化合物分析。17例：例：混合標準單糖衍生化混合標準單

17、糖衍生化GCGC圖譜圖譜白芷多糖水解衍生化產物白芷多糖水解衍生化產物GCGC圖譜圖譜18）高碘酸氧化法：）高碘酸氧化法：可以選擇性斷裂糖分子中可以選擇性斷裂糖分子中鄰二羥基和鄰三羥基鄰二羥基和鄰三羥基處處, ,生成相應的多糖醛、甲酸生成相應的多糖醛、甲酸( (或甲醛或甲醛),),反應定量進行，每開裂一個反應定量進行，每開裂一個C-CC-C鍵消耗一分子高碘酸。如鍵消耗一分子高碘酸。如,1,2-, 1,4-, 1,6-,1,2-, 1,4-, 1,6-糖苷鍵能夠反應，而糖苷鍵能夠反應，而 1,3- 1,3- 糖苷鍵的則不能，且不同位置的縮合，高碘酸的消耗量和甲酸生糖苷鍵的則不能，且不同位置的縮合，

18、高碘酸的消耗量和甲酸生成量不同，用氫氧化鈉滴定甲酸的量成量不同，用氫氧化鈉滴定甲酸的量, , 可以判斷可以判斷糖苷鍵位置、直鏈多糖苷鍵位置、直鏈多糖聚合度、支鏈多糖的分支數目糖聚合度、支鏈多糖的分支數目等。等。1,3-1,3-不消耗高碘酸不消耗高碘酸 1,2-1,2-； 1,4-1,4- 消耗消耗1mol1mol高碘酸高碘酸1,6-1,6-消耗消耗2mol2mol高碘酸高碘酸, , 生成生成1mol1mol甲酸甲酸操作操作: :一般取一般取25mg25mg樣品樣品, ,溶于溶于20 mmol20 mmolL L高碘酸鈉溶液高碘酸鈉溶液50 ml50 ml中中, ,在在- -5 5度暗處氧化度暗

19、處氧化1414天，取天，取25 ml25 ml加乙二醇加乙二醇ml,ml,用用0.12mol/L0.12mol/L氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液滴定，以測定甲酸的生成量。滴定，以測定甲酸的生成量。2、 糖苷鍵連接位置的測定：糖苷鍵連接位置的測定：191-21-2糖苷鍵糖苷鍵1-31-3糖苷鍵糖苷鍵）Smith降解法：降解法：是過碘酸氧化的改良反應，即在高碘酸氧化后，是過碘酸氧化的改良反應，即在高碘酸氧化后，NaBH4NaBH4還還原，再用弱酸部分水解。水解液中和后，紙色譜法分離鑒定，以確定糖苷鍵原，再用弱酸部分水解。水解液中和后，紙色譜法分離鑒定，以確定糖苷鍵的連接位置，若有葡萄糖檢出，肯定有的連接

20、位置，若有葡萄糖檢出，肯定有, ,- -糖苷縮合。糖苷縮合。201-41-4糖苷鍵糖苷鍵1-61-6糖苷鍵糖苷鍵213 3）甲基化分析：）甲基化分析： 羥基的全甲基化：羥基的全甲基化：強堿條件下（使糖基的自由羥基離子化，生成穩定的強堿條件下（使糖基的自由羥基離子化，生成穩定的碳陰離子），與碘甲烷碳陰離子），與碘甲烷( (或硫酸二甲酯，三甲基氯硅烷或硫酸二甲酯，三甲基氯硅烷) )作用，甲基化化作用，甲基化化生成甲醚。生成甲醚。 甲基化產物的水解、還原、乙酰化：甲基化產物的水解、還原、乙酰化：酸水解（酸水解（90%90%甲酸）得到甲基化單糖，甲酸）得到甲基化單糖，再經再經NaBH4NaBH4還原為

21、對堿穩定的糖醇，然后用乙酸酐在吡啶中乙酰化，得還原為對堿穩定的糖醇，然后用乙酸酐在吡啶中乙酰化，得到各種部分甲基化的糖醇乙酰衍生物。到各種部分甲基化的糖醇乙酰衍生物。 GCGC和和GC-MSGC-MS分析分析：與標準譜圖歸屬比較，可確定單糖組分的種類、比例：與標準譜圖歸屬比較，可確定單糖組分的種類、比例和糖苷鍵的位置。和糖苷鍵的位置。 異頭碳糖苷鍵構型、糖基順序無法確定。異頭碳糖苷鍵構型、糖基順序無法確定。224）酶法 內切糖苷酶內切糖苷酶F（天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺糖苷酶） 內切糖苷酶內切糖苷酶H（-N-乙酰葡糖胺糖苷酶） 唾液酸酶 -半乳糖苷酶 -N-乙酰氨基己糖糖苷酶-甘露糖苷酶 -甘露

22、糖苷酶23）紅外光譜（）紅外光譜（infrared spectrographinfrared spectrograph，IRIR）法：）法：紅外光譜法是一種專屬性很強、應用較廣（固體、液體、氣體樣品）紅外光譜法是一種專屬性很強、應用較廣（固體、液體、氣體樣品）的鑒別方法。的鑒別方法。 在在800nm-20um800nm-20um連續光掃描記錄下來的圖譜。連續光掃描記錄下來的圖譜。原理：原理：由分子的振動及轉動能級躍遷而引起的。由分子的振動及轉動能級躍遷而引起的。、異頭體的測定：、異頭體的測定：24 異頭體類型：異頭體類型： 型糖苷鍵在型糖苷鍵在cm-1cm-1左右處有特征吸收；左右處有特征吸收

23、； 型糖苷鍵在型糖苷鍵在cm-1cm-1處有特征吸收處有特征吸收。 呋喃糖和吡喃糖：呋喃糖和吡喃糖：呋喃糖在呋喃糖在9249241313， 8798797cm-17cm-1，吡喃糖相應在，吡喃糖相應在9179171313， 77077014 cm-114 cm-1處。處。 吡喃糖種類：吡喃糖種類： -D-D-葡萄吡喃糖特征吸收在葡萄吡喃糖特征吸收在855855 833 cm-1833 cm-1處，處， -D-D-葡萄吡喃糖葡萄吡喃糖905905 876 cm-1876 cm-1。 磷酸基、磺酸基等取代基團信息磷酸基、磺酸基等取代基團信息IR能給的糖結構信息：能給的糖結構信息：25）核磁共振（）

24、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMRNuclear Magnetic Resonance, NMR）法）法：1 1H-NMRH-NMR中中: : C C1 1質子信號質子信號小于小于5 5ppm，為，為 型，如型，如 4.534.53信號為信號為 型糖苷鍵；型糖苷鍵； 型糖苷鍵常型糖苷鍵常大于大于5 5ppm，常在，常在 5.4-5.1ppm5.4-5.1ppm。1313C-NMRC-NMR中中: : 型型C C1 1:103-105 ppm, :103-105 ppm, 型型97-101 ppm.97-101 ppm.3 3）酶法）酶法：酶促反應的高度專一

25、性，利用酶促反應的高度專一性，利用 糖苷酶，糖苷酶， 糖苷酶糖苷酶對多糖底物的催化反應，可確認多糖糖苷鍵類型。對多糖底物的催化反應，可確認多糖糖苷鍵類型。26 多糖的分子量測定是研究多糖性質的一項重要工作。多糖的理化多糖的分子量測定是研究多糖性質的一項重要工作。多糖的理化性質及活性與多糖的分子量及其分布有關，性質及活性與多糖的分子量及其分布有關，如如右旋糖酐：右旋糖酐： 分子量為分子量為1010萬萬-20-20萬時能使血液中紅細胞聚集，而分子量為萬時能使血液中紅細胞聚集，而分子量為2 2萬萬-4-4萬時，不但不使紅細胞聚集，反而使已聚集的紅細胞解聚，所以不同萬時，不但不使紅細胞聚集，反而使已聚

26、集的紅細胞解聚，所以不同分子量的右旋糖酐在臨床上有完全不同的應用。分子量的右旋糖酐在臨床上有完全不同的應用。又如又如低分子肝素（低分子肝素（4000-60004000-6000）：）：抗血栓藥物；抗血栓藥物；而普通肝素（而普通肝素（3000-3000-4000040000）用于抗凝血。用于抗凝血。 多糖類藥物的分子量及其分布的測定，在確保生產工藝的穩定性多糖類藥物的分子量及其分布的測定，在確保生產工藝的穩定性以及臨床用藥的安全有效性方面，顯得尤為重要。以及臨床用藥的安全有效性方面，顯得尤為重要。4 4、多糖分子量的測定：、多糖分子量的測定：27數均和重均分子量：數均和重均分子量：（ Numbe

27、r average and weight average molecular weight ） 對于多糖來說，其分子鏈的長短可以是一個混合物，在衡量其分子量對于多糖來說，其分子鏈的長短可以是一個混合物，在衡量其分子量時，往往是一個平均數。時，往往是一個平均數。數均分子量數均分子量就是依據總體分子的個數，求出分子量來的，如應用化學就是依據總體分子的個數，求出分子量來的，如應用化學方法和滲透壓方法測定的即為數均分子量。方法和滲透壓方法測定的即為數均分子量。重均分子量重均分子量就是依據各個分子的重量求出的分子量，如沉降方法，擴就是依據各個分子的重量求出的分子量，如沉降方法，擴散方法，光散射方法測得的

28、分子量屬于重均分子量。散方法，光散射方法測得的分子量屬于重均分子量。按照理論計算，如果重均分子量和數均分子量數值相等，這生物大分按照理論計算，如果重均分子量和數均分子量數值相等，這生物大分子樣品屬于均一的樣品，如果重均分子量大于數均分子量，則這生物子樣品屬于均一的樣品，如果重均分子量大于數均分子量，則這生物大分子樣品為混合品。混合品一定是重均分子量大于數均分子量，倒大分子樣品為混合品。混合品一定是重均分子量大于數均分子量，倒過來是不可能的。過來是不可能的。因此數均分子量與重均分子量之差，是衡量樣品是因此數均分子量與重均分子量之差，是衡量樣品是否均一的標志。否均一的標志。D=Mw/MnD=Mw/

29、Mn28 凝膠過濾法：凝膠過濾法：lgM=a+bV HPLCHPLC法：法： 20052005年版藥典收載年版藥典收載 專用的凝膠柱（按照所測樣品的分子量大小選擇專用的凝膠柱（按照所測樣品的分子量大小選擇 特定排阻范圍的凝膠柱）特定排阻范圍的凝膠柱） 示差檢測器。示差檢測器。 GPCGPC（Gel Permeation ChromatographyGel Permeation Chromatography）專用軟件。 分子量、分布等信息。分子量、分布等信息。 其它法：其它法：質譜法（質譜法（FAB-MS,ESI-MSFAB-MS,ESI-MS），凝膠電泳法、），凝膠電泳法、 滲透壓法、蒸汽壓滲

30、透計法、黏度法、沉淀法等等。滲透壓法、蒸汽壓滲透計法、黏度法、沉淀法等等。多糖分子量測定常用的方法多糖分子量測定常用的方法29min051015202530354045nRIU-10000-50000500010000150002000025000 RID1 A, Refractive Index Signal (GPC_DEMO002-0201.D) 16.700 19.317 21.929 24.764min051015202530354045nRIU-500005000100001500020000 RID1 A, Refractive Index Signal (GPC_DEMO049

31、-0402.D) 20.344 27.529lg Mw=a+b tRMw 為標樣的已知重均分子量； t R 為標樣的保留時間。D=Mw/Mn標準葡聚糖標準葡聚糖樣品多糖樣品多糖305 5、糖的連接順序：、糖的連接順序：酶法：酶法：利用外切酶：利用外切酶： , ,或或 - -甘露糖苷酶、甘露糖苷酶、 ,或或 - -半乳半乳糖苷酶、糖苷酶、 ,或或 - -乙酰氨基葡萄糖苷酶等，從糖鏈的非還乙酰氨基葡萄糖苷酶等，從糖鏈的非還原端依次切下相應的單糖。原端依次切下相應的單糖。核磁共振（核磁共振（NMRNMR）法：）法：二維二維NMRNMR316、多糖類藥物定性定量測定方法、多糖類藥物定性定量測定方法鑒別

32、鑒別:）一般鑒別：）一般鑒別：多糖水解成單糖，在濃酸中加熱脫水生成糖醛或衍生物，多糖水解成單糖，在濃酸中加熱脫水生成糖醛或衍生物，它們在它們在 萘酚作用下生成有色物質。萘酚作用下生成有色物質。）溶解度的測定：）溶解度的測定：根據藥典，多糖類藥物測定在水、有機溶劑、稀堿根據藥典，多糖類藥物測定在水、有機溶劑、稀堿溶液中的溶解度。大多數葡聚糖在水中溶解度小，不溶于有機溶劑，但溶液中的溶解度。大多數葡聚糖在水中溶解度小，不溶于有機溶劑，但溶于稀堿溶液。酸性粘多糖溶于水。溶于稀堿溶液。酸性粘多糖溶于水。）比旋度：）比旋度：多糖均有一定的比旋度，按照藥典測定。多糖均有一定的比旋度，按照藥典測定。）特性黏

33、度：）特性黏度：按照藥典黏度測定法。按照藥典黏度測定法。包括：鑒別，檢查，含量測定包括：鑒別，檢查，含量測定32純度檢查（雜質檢查）純度檢查（雜質檢查）:主要為來自原始原料的核酸、蛋白質等。主要為來自原始原料的核酸、蛋白質等。常用分光光度法測260nm,280nm有無吸收來判斷。33多糖含量測定常用方法多糖含量測定常用方法: 1 1） 分光光度法分光光度法 苯酚一硫酸法苯酚一硫酸法(Duboi S方法方法) ：多糖在硫酸作用下水解成單糖，多糖在硫酸作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚反應生成有色化合物，再用分并迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚反應生成有色化合物，再用分光光度法測定其

34、多糖含量。光光度法測定其多糖含量。00.511.500.02 0.04 0.06 0.080.10.12濃度 (mg/ml)吸光度標準曲線法：標準曲線法：1 1）波長的選擇）波長的選擇：選擇待測物質的最大吸選擇待測物質的最大吸收波長，這時靈敏度最高，且可以避免收波長，這時靈敏度最高，且可以避免其它物質的干擾。其它物質的干擾。485nm.485nm.2 2）標準溶液的配制及標準曲線的繪制：）標準溶液的配制及標準曲線的繪制：以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，來以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，來繪制一條標準曲線。繪制一條標準曲線。3 3）待測物的含量計算：）待測物的含量計算：直接將待測物質的吸光值代入

35、標準曲線直接將待測物質的吸光值代入標準曲線計算計算. .342 ） 滴定法滴定法 斐林試劑法斐林試劑法: : 該方法是先準確吸取斐林試劑甲、乙液各該方法是先準確吸取斐林試劑甲、乙液各5mL5mL于于l50mLl50mL錐錐形瓶中，加熱至沸騰，而后用標準葡萄糖液滴定，直至溶液藍色褪盡形瓶中，加熱至沸騰，而后用標準葡萄糖液滴定，直至溶液藍色褪盡為止，紀錄滴定體積。然后再準確吸取斐林溶液甲、乙液各為止，紀錄滴定體積。然后再準確吸取斐林溶液甲、乙液各5mL5mL，于另，于另一一l50mLl50mL錐形瓶中，準確加入錐形瓶中，準確加入2mL2mL待測液，加熱至沸騰，然后用標準葡待測液，加熱至沸騰，然后用

36、標準葡萄糖液滴定，直至溶液藍色褪盡為止，紀錄滴定體積。最后，用差值萄糖液滴定，直至溶液藍色褪盡為止，紀錄滴定體積。最后，用差值法，計算待測液含糖量。該方法優點是所需待測液少、方便、準確、法，計算待測液含糖量。該方法優點是所需待測液少、方便、準確、并 且 現 像 明 顯 、 所 需 藥 品 價 格 便 宜 、 精 密 度 高 。并 且 現 像 明 顯 、 所 需 藥 品 價 格 便 宜 、 精 密 度 高 。滴定分析法的計算滴定分析法的計算 設設A A為待測組分，為待測組分，B B為標準溶液，滴定反應為：為標準溶液，滴定反應為： a aA + A + b bB B c cC + C + d dD

37、 D 當當A A與與B B按化學計量關系完全反應時，則：按化學計量關系完全反應時，則： n nA A: :n nB B = = a a: :b b 求待測溶液濃度求待測溶液濃度C CA:A: 若已知待測溶液的體積若已知待測溶液的體積V VA A 和標準溶液的濃度和標準溶液的濃度C CB B和體積和體積V VB B，則則 VA.CA=a/b VB.CBVA.CA=a/b VB.CB CA = a/b .VB.CB / VA CA = a/b .VB.CB / VA 353 3） 色譜法（內標法）色譜法（內標法） （1 1）氣相色譜法）氣相色譜法 困難是多糖困難是多糖本身沒有足夠的揮發性。利用水解

38、本身沒有足夠的揮發性。利用水解技術，將多糖水解為單糖之后進行技術，將多糖水解為單糖之后進行衍生化衍生化反應，再用反應，再用GCGC進行分析，以進行分析，以木糖醇為內標物，目前采用的衍生木糖醇為內標物，目前采用的衍生化方法主要是化方法主要是甲基化法甲基化法（三甲基氯硅烷）。（三甲基氯硅烷）。（2 2）高效液相色譜法）高效液相色譜法( (外標法外標法) ) A:A:直接直接HPLCHPLC法：法：用用HRC-NH2HRC-NH2色譜柱，色譜柱，乙腈乙腈- -水（水（5 5：2525）為流動相，示差檢測器。）為流動相，示差檢測器。B:B:柱前衍生化柱前衍生化HPLCHPLC法：法：PMPPMP是最好

39、衍生化試劑之一，是最好衍生化試劑之一，衍生物不易裂解，分析時不產生異構峰，且在衍生物不易裂解，分析時不產生異構峰，且在250 nm250 nm處有強烈的紫外吸收。（處有強烈的紫外吸收。（C18C18）364)4)生物檢定法：生物檢定法：如肝素，延長新鮮兔豬血凝血時間。如肝素，延長新鮮兔豬血凝血時間。目前使用多糖的檢測方法包括苯酚分光光度法、色譜法目前使用多糖的檢測方法包括苯酚分光光度法、色譜法和滴定法等。和滴定法等。3738核磁共振在多糖結構的應用1 1H NMRH NMR譜）譜）1 1H-H-1 1H H 2 2、TOCSY(TOCSY(全相關全相關) )譜譜 3 3、1 1H-H-1313

40、C COSYC COSY譜（譜（HMQCHMQC） 4 4、遠程、遠程1 1H-H-1313C COSYC COSY譜（譜（HMBCHMBC） 5 5、NOESYNOESY譜譜 6 6、INADEQUATEINADEQUATE譜譜39核磁共振氫譜（1H NMR譜） 核磁共振氫譜（核磁共振氫譜（ 1 1H NMRH NMR），也稱為質子磁共振譜（），也稱為質子磁共振譜（proton magnetic proton magnetic resonanceresonance，pmrpmr），是發展最早，研究得最多，應用最為廣泛的核磁共振波），是發展最早，研究得最多，應用最為廣泛的核磁共振波譜。在較長一

41、段時間里核磁共振氫譜幾乎是核磁共振譜的代名詞。原因譜。在較長一段時間里核磁共振氫譜幾乎是核磁共振譜的代名詞。原因: :一：質子的天然豐度接近一：質子的天然豐度接近 100%,100%,核磁共振測定的絕對靈敏度是所有磁核中最大的。核磁共振測定的絕對靈敏度是所有磁核中最大的。在在 PFT NMRPFT NMR（脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀）脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀）出現之前，天然豐度低的同位素，出現之前，天然豐度低的同位素，如如1313C C等的測定很困難。等的測定很困難。二二：1 1H H是有機化合物中最常見的同位素，是有機化合物中最常見的同位素， 1 1H NMR H NMR 譜是有機物結構解

42、析中最有用的核譜是有機物結構解析中最有用的核磁共振譜之一。磁共振譜之一。 在多糖中的應用在多糖中的應用 可給出的信號有在4.3-5.9ppm的異頭質子.可以判斷異頭碳的構型(5.00為-型, 5.00 為-型). 在1.1-1.3ppm處的6-位脫氧糖的甲基雙峰. 在2.0-2.2ppm處的乙酰氨基的甲基峰. 在3.0-4.2ppm的非常小的區域中,結果嚴重重疊不能給出結構信息. 40碳核磁共振譜（13C NMR 譜）1 BB1 BB譜譜(Proton broad band decoupling):(Proton broad band decoupling): 最常見的碳譜是寬帶全去偶譜最常見

43、的碳譜是寬帶全去偶譜(BB)(BB)，又稱質子噪聲去耦譜，質子噪聲去耦譜，又稱質子噪聲去耦譜，質子噪聲去耦譜可以使碳譜簡化，它損失了可以使碳譜簡化，它損失了1313C C 和和1 1H H 之間的耦合信息，每一種化學等價的碳原子之間的耦合信息，每一種化學等價的碳原子只有一條譜線。碳譜的化學位移對核所受的化學環境是很敏感的，它的范圍比氫只有一條譜線。碳譜的化學位移對核所受的化學環境是很敏感的，它的范圍比氫譜寬得多，一般在譜寬得多，一般在 0-250ppm0-250ppm。對于分子量在。對于分子量在 300-500 300-500 的化合物，碳譜幾乎可以的化合物，碳譜幾乎可以分辨每一個不同化學環境

44、的碳原子，而氫譜有時卻嚴重重迭。分辨每一個不同化學環境的碳原子，而氫譜有時卻嚴重重迭。2 DEPT2 DEPT譜譜(Distortionless enhencement by polarization transfer):(Distortionless enhencement by polarization transfer): DEPT DEPT譜即無畸變極化轉移增益法。可在質子去偶譜即無畸變極化轉移增益法。可在質子去偶, ,又可在質子不去偶的條件又可在質子不去偶的條件下測定下測定, , 由于由于BBBB譜無法確定譜線所屬的碳原子的級數，所以可以譜無法確定譜線所屬的碳原子的級數，所以可以通過

45、改變照射通過改變照射1H的第三脈沖寬度的第三脈沖寬度( )，使作，使作45 ，90 ，135 變化并測定其變化并測定其13C NMR譜。譜。 = 45 時，時，CH1和和CH2和和CH3均為正號。均為正號。 = 90 時，只有時，只有CH1有正信號，而有正信號，而CH2和和CH3信號均為信號均為0。 = 135 時，只有時，只有CH1和和 CH3有正信號，而有正信號，而CH2有負信號。有負信號。 41在多糖中的應用 確定異頭碳的數目確定異頭碳的數目: :異頭碳的共振一般出現在90-112ppm. 確定構型確定構型 : :一般來說-型連接的C1化學位移比-型低1.5-3.0, -型的化學位移為9

46、7-101， -型103-105，來確定確定構型。 預言多糖的聚合程度預言多糖的聚合程度: : 一般還原末端的C-1出現在90-98ppm間,而取代碳水化合物的C-1(非還原單糖)出現在98-112ppm),因而可預言多糖的聚合程度. 其他化學位移的信號: 52-57ppm間的共振信號一般為氨基取代碳的信號.170-176ppm范圍的低場信號反映有己糖醛酸的羧基或乙酰基的存在.在60-70ppm間醛糖只有一個共振峰,而酮糖有兩個.42-型-型異頭氫區異頭碳區-型-型432 D H-H相關譜-H-H COSY COSY COSY 譜本身為正方形，當譜本身為正方形，當 F1F1和和 F2F2譜寬不

47、等時則為矩形。正譜寬不等時則為矩形。正方形中有一條對角線（一般為左下方形中有一條對角線（一般為左下右上）。對角線上的峰右上）。對角線上的峰稱為對角峰（稱為對角峰（ diagonal peakdiagonal peak）。對角線外的峰稱為交叉峰）。對角線外的峰稱為交叉峰（ cross peakscross peaks）或相關峰（）或相關峰（correlated peakscorrelated peaks）。每個相）。每個相關峰或交叉峰反映兩個峰組間的耦合關系。關峰或交叉峰反映兩個峰組間的耦合關系。COSY COSY 主要反映主要反映3 3J J耦合關系。耦合關系。 解譜方法：取任一交叉峰作為出發

48、點，通過它作垂線，會與解譜方法：取任一交叉峰作為出發點，通過它作垂線，會與某對角線峰及上方的氫譜中的某峰組相交，它們即是構成此某對角線峰及上方的氫譜中的某峰組相交，它們即是構成此交叉峰的一個峰組。再通過該交叉峰作水平線，與另一對角交叉峰的一個峰組。再通過該交叉峰作水平線，與另一對角線峰相交，再通過該對角線峰作垂線，又會與氫譜中的另一線峰相交，再通過該對角線峰作垂線，又會與氫譜中的另一峰組相交，此即構成該交叉峰的另一峰組。峰組相交，此即構成該交叉峰的另一峰組。442 D H-H相關譜-H-H COSY45全相關譜 TOCSY、 HOHAHA TOCSYTOCSY（Total Correlatio

49、n SpectroscopyTotal Correlation Spectroscopy）與）與 HOHAHAHOHAHA（Homonuclear Hartmann Hahn spectscopyHomonuclear Hartmann Hahn spectscopy）稱為總相關譜。可從某一個氫核的譜峰出發，找到與它稱為總相關譜。可從某一個氫核的譜峰出發，找到與它處于同一耦合體系的所有氫核譜峰的相關峰。處于同一耦合體系的所有氫核譜峰的相關峰。 TOCSY TOCSY 和和 HOHAHA HOHAHA 的用途及譜圖的外觀是一樣的，只是的用途及譜圖的外觀是一樣的，只是實驗時所用的脈沖序列不同。實驗

50、時所用的脈沖序列不同。TOCSY TOCSY 和和 HOHAHA HOHAHA 譜目前譜目前正被越來越廣泛的使用。正被越來越廣泛的使用。46471H- 13C COSY譜（HMQC） HMQC 異核多重量子相干（Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) C-H COSY C-H COSY 是是1313C C 和和1 1H H 核之間的位移相關譜。它反核之間的位移相關譜。它反映了映了1313C C 和和1 1H H核之間的關系。它又分為直接相關譜和遠核之間的關系。它又分為直接相關譜和遠程相關譜，直接相關譜是把直接相連的程相關譜，直接相關譜是把直接相連的1

51、313C C 和和1 1H H核關聯核關聯起來，矩形的二維譜中間的峰稱為交叉峰（起來，矩形的二維譜中間的峰稱為交叉峰（ cross cross peakpeak）或相關峰（）或相關峰（correlated peakcorrelated peak），反映了直接相），反映了直接相連的連的1313C C 和和1 1H H核，核，在此圖譜中季碳無相關峰在此圖譜中季碳無相關峰。4849遠程1H-13C COSY譜（HMBC）50HMBCHMBC（1 1H H 檢測的異核多鍵相關實驗，檢測的異核多鍵相關實驗，1H Detected Heteronuclear Detected Heteronuclear

52、Multiple Bond CorrelationMultiple Bond Correlation或或 Long Range Heteronuclear Long Range Heteronuclear Multiple Quantum CoherecelMultiple Quantum Coherecel）。）。遠程相關譜則是將相隔兩至四根化學鍵的遠程相關譜則是將相隔兩至四根化學鍵的13C 和和1H 核關聯起來，甚核關聯起來，甚至能跨越季碳、雜原子等，交叉峰或相關峰比直接相關譜中多得多，至能跨越季碳、雜原子等，交叉峰或相關峰比直接相關譜中多得多，因而對于幫助推測和確定化合物的結構非常有用。

53、因而對于幫助推測和確定化合物的結構非常有用。 NOESY譜 和ROESY譜二維二維 NOE NOE 譜簡稱為譜簡稱為 NOESYNOESY，它反映了有機化合物結構中核與核之間空間，它反映了有機化合物結構中核與核之間空間距離的關系，而與二者間相距多少根化學鍵無關。因此對確定有機化合物距離的關系，而與二者間相距多少根化學鍵無關。因此對確定有機化合物結構、構型和構象以及生物大分子有著重要意義。結構、構型和構象以及生物大分子有著重要意義。NOESY NOESY 的譜圖與的譜圖與H-H COSY H-H COSY 非常相似，它的非常相似，它的 F2F2維和維和 F1F1維上的投影均是氫維上的投影均是氫譜，也有對角峰和交叉峰，圖譜解析的方法也和譜，也有對角峰和交叉峰，圖譜解析的方法也和 COSY COSY 相同，唯一不同的相同，唯一不同的是圖中的交叉峰并非表示兩個氫核之間有耦合關系，而是表示兩個氫核之是圖中的交叉峰并非表示兩個氫核之間有耦合關系，而是表示兩個氫核之間的空間位置接近。間的空間位置接近。由于由于 NOE