1、到目前為止，到目前為止， 幾十項幾十項Nobel生理學和醫學獎，化學獎生理學和醫學獎，化學獎 都與微生物學有關都與微生物學有關課題1 微生物的實驗室培養1.提供營養和環境條件2.防止雜菌污染微生物的類群微生物的類群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌單細胞的動植物單細胞的動植物如草履蟲、單細胞藻類等如草履蟲、單細胞藻類等無細胞結構無細胞結構真核細胞真核細胞細菌、藍藻細菌、藍藻原核細胞原核細胞一一. .培養基：培養基：1、概念：、概念：2.2.種類（物理性質）：種類（物理性質）：固體培養基固體培養基液體培養基液體培養基有有無無 凝固劑凝固劑瓊脂瓊脂微生物生存

2、的營養物質和環境條件微生物生存的營養物質和環境條件微生物在微生物在固體培養基固體培養基表面生長，可形成肉表面生長，可形成肉眼可見的眼可見的菌落菌落3.3.基本成分：基本成分： 碳源、氮源、水、無機鹽碳源、氮源、水、無機鹽對對 pHpH、特殊營養物質特殊營養物質和氧氣的需求和氧氣的需求1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養基的配方牛肉膏蛋白胨培養基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g瓊脂瓊脂20.0g分析營養構成？分析營養構成？不同的培養基，配方不不同的培養基，配方不同，但都有基本成分同，但都有基本成分不同微生物需要采用不同微生物需要采用不

3、同的培養基配方不同的培養基配方空間空間 衣著和手衣著和手 器皿器皿 滅菌滅菌 酒精酒精燈火焰附近燈火焰附近 滅菌滅菌 二二. .無菌技術：無菌技術：防止外來雜菌的污染防止外來雜菌的污染較為較為溫和溫和理化方法，理化方法，殺死殺死部分有害菌體部分有害菌體（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）強烈強烈的理化方法，的理化方法，殺死殺死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）1.1.消毒與滅菌：消毒與滅菌：消毒消毒滅菌滅菌有些細菌在一定的條件下，細胞里面有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的形成一個橢圓形的休眠體休眠體，叫做芽孢。，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫芽孢

4、的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環境有很強的抵抗力。例如，等惡劣的環境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸有的細菌的芽孢，煮沸3 3小時以后才死小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環境適宜（如溫度、水分適宜）的當環境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發，形成一個細時候，芽孢又可以萌發，形成一個細菌菌細菌、原生動物、真菌和植細菌、原生動物、真菌和植物等產生的一種有繁殖作用物等產生的一種有繁殖作用的的生殖細胞生殖細胞。能直接發育成。能直接發育成新個體。新個體。 方法方法條件條件作用對象作用對象消消毒毒煮沸煮沸消毒法消毒法100 ，煮沸，

5、煮沸56 min殺死微生物的營養細胞和一部殺死微生物的營養細胞和一部分芽孢分芽孢巴氏巴氏消毒法消毒法7075 ,煮煮30 min或或80 ,煮煮15 min不耐高溫的液體不耐高溫的液體化學藥化學藥劑消毒法劑消毒法70%的酒精的酒精對雙手消毒對雙手消毒石炭酸石炭酸 煤酚皂煤酚皂對空氣消毒對空氣消毒一定濃度的乳酸、食醋一定濃度的乳酸、食醋通過熏蒸對空氣進行消毒通過熏蒸對空氣進行消毒紫外線法紫外線法紫外線照射紫外線照射30 min物體表面或空氣中的微生物物體表面或空氣中的微生物滅滅菌菌灼燒灼燒滅菌滅菌在酒精燈火焰的在酒精燈火焰的充分充分燃燒層燃燒層灼燒灼燒對對接種環接種環、接種針或其、接種針或其他金

6、屬工具滅菌，也可他金屬工具滅菌，也可以對以對試管口、瓶口試管口、瓶口滅菌滅菌干熱干熱滅菌滅菌在干熱滅菌箱內在干熱滅菌箱內,160170 條件條件下下,加熱加熱12 h耐高溫且需保持干耐高溫且需保持干燥的物品燥的物品,如玻璃如玻璃器皿和金屬用具等器皿和金屬用具等高壓蒸高壓蒸汽滅菌汽滅菌在高壓蒸汽滅菌鍋在高壓蒸汽滅菌鍋內內,121 ,100 kPa,滅菌滅菌1530 min培養基培養基紫外線紫外線滅菌滅菌照射照射30 min小型接種室、接種箱等小型接種室、接種箱等請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。滅菌。如果需要，請選擇合適的方

7、法。（1 1） 培養細菌用的培養基與培養皿培養細菌用的培養基與培養皿（2 2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管玻棒、試管、燒瓶和吸管（3 3） 實驗操作者的雙手實驗操作者的雙手固體固體液體液體碳源、氮源、水、無機鹽碳源、氮源、水、無機鹽C C 制備培養基 純化大腸桿菌三三.大腸桿菌的純化培養大腸桿菌的純化培養：分散成單個細胞分散成單個細胞, ,形成單個菌落形成單個菌落1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養基的配方牛肉膏蛋白胨培養基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g瓊脂瓊脂20.0g制備制備牛肉膏蛋白胨固體培養基牛肉膏蛋白胨固體培養基1.1.計算

8、：計算：培養基用量培養基用量依配方計算各成分的用量依配方計算各成分的用量2.2.稱量：稱量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解、少量水加熱溶解 取紙取紙蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl瓊脂瓊脂 補水定容補水定容4.4.調調pHpH、分裝、封口：、分裝、封口：5.5.滅菌：滅菌：6.6.倒平板：倒平板：培養基、培養皿培養基、培養皿約約50防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染灼燒滅菌，灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基

9、防止瓶口的微生物污染培養基 1. 1.培養基滅菌后，需要冷卻到培養基滅菌后，需要冷卻到50 50 左右左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？基的溫度？ 答：答：可以用手觸摸盛有培養基的錐形可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。時，就可以進行倒平板了。2.2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。生物污染培養基。3.3.平板冷凝后，為什么要將平板

10、倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？培養微生物嗎？為什么？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。 答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿

11、底之答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此間的培養基上滋生，因此最好不要用最好不要用這個平板這個平板培養微生物。培養微生物。二二. .大腸桿菌的純化培養大腸桿菌的純化培養：制備牛肉膏蛋白胨固體培養基制備牛肉膏蛋白胨固體培養基純化大腸桿菌：純化大腸桿菌：平板劃線法：平板劃線法：菌種菌種劃劃3 3個平板個平板1 1個不劃線個不劃線1.1.純化大腸桿菌的方法：純化大腸桿菌的方法：平板劃線法平板劃線法和稀釋涂布平板法和稀釋涂布平板法接種環接種環防止劃破培養基防止劃破培養基（重復實驗）（重復實驗）（空白對照）（空白對照） 平板劃線法是通過接種環在瓊脂固體培養基表平板劃線法是通過接種環

12、在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。在數次劃線后培養，可以培養基的表面。在數次劃線后培養，可以分離到由分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體。1 1、為什么在操作的第一步以及每次劃線之、為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？需要灼燒接種環嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物可能存在的微

13、生物污染培養物殺死殺死上次殘留的菌種上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時，保證使下一次劃線時，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。減少，以便得到菌落。及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。環境和感染操作者。 2.2.在灼燒接種環之后，為什么要等其在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？冷卻后再進行劃線？答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。 3.3.在作第二

14、次以及其后的劃線操作時，在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細菌的數目比線答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。的菌落。6 6支試管，分別加入支試管，分別加入9ml9ml無菌水無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀釋涂布平板法稀釋涂布

15、平板法：a.a.梯度稀釋菌液梯度稀釋菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器浸浸稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法：a.a.梯度稀釋菌液梯度稀釋菌液：b.b.涂布平板涂布平板：不超過不超過0.1ml0.1ml各梯度分別涂布各梯度分別涂布3個平板個平板1 1個不涂布作空白對照個不涂布作空白對照滴滴灼灼涂涂稀稀釋釋10103 3倍倍稀稀釋釋10104 4倍倍稀稀釋釋10105 5倍倍 稀釋涂布法是將菌液進行一系列梯度稀釋，稀釋涂布法是將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。養基的表面，進行培養。 涂布平板的所有操作都

16、應在火焰附近涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步應如何進行無步應如何進行無菌操作？菌操作？應從操作的各個細節保證應從操作的各個細節保證“無菌無菌”。例如：酒精燈與培養皿的距離要合適、例如：酒精燈與培養皿的距離要合適、 吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管頭不要接觸任何其他物體、 吸管要在酒精燈火焰周圍等等。吸管要在酒精燈火焰周圍等等。3平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較優點優點缺點缺點適用范圍適用范圍平板劃線平板劃線分離法分離法可以觀察菌落特可以觀察菌落特征

17、，對混合菌進征，對混合菌進行分離行分離不能計數不能計數適用于好氧菌適用于好氧菌稀釋涂布稀釋涂布平板法平板法可以計數，可以可以計數，可以觀察菌落特征觀察菌落特征吸收量較少、吸收量較少、較麻煩，平板較麻煩，平板不干燥效果不不干燥效果不好，容易蔓延好，容易蔓延適用于厭氧菌適用于厭氧菌和兼性厭氧菌和兼性厭氧菌平板劃線法：平板劃線法：二二. .大腸桿菌的純化培養大腸桿菌的純化培養：制備牛肉膏蛋白胨固體培養基制備牛肉膏蛋白胨固體培養基純化大腸桿菌：純化大腸桿菌：1.1.接種：接種：稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法：2.2.培養：培養：將將接種后接種后的培養基和一個的培養基和一個未接種未接種的培養基的培養基放入

18、放入3737恒溫箱中培養恒溫箱中培養12h12h24h24h后，后，觀察并記錄觀察并記錄稀稀釋釋10103 3倍倍稀稀釋釋10104 4倍倍稀稀釋釋10105 5倍倍（三）菌種的保藏：（三）菌種的保藏：1.1.臨時保藏：臨時保藏： 試管固體斜面培養基上，試管固體斜面培養基上，培養長成菌落培養長成菌落44冰箱保存冰箱保存2.2.長期保存：長期保存：菌種易被污染、變異菌種易被污染、變異甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油（滅菌）甘油（滅菌）1ml1ml菌液菌液2020擱置斜擱置斜面面四、課題成果評價四、課題成果評價 （一）培養基的制作是否合格（一）培養基的制作是否合格 如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫1 12 d2 d后無后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的，否則需要重新菌落生長，說明培養基的制備是成功的，否則需要重新制備。制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求（二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大