1、第五講 RNA的生物合成以DNA為模板，在依賴于DNA的RNA聚合酶的催化下合成RNA的過程，稱為轉錄（transciption）。把與m RNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈（coding strand）或有意義鏈（sense strand），并把另一條根據互補原則指導m RNA合成的DNA鏈稱為模板鏈（template strand）或反義鏈（antisense strand）。貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉錄生成RNA，才能得到表達。除了少數的RNA病毒，所有RNA分子都來自DNA。儲存于DNA雙鏈中的遺傳信息通過堿基互補配對原則轉化為單鏈RNA分子。生物體內共有3種RNA：

2、編碼特定蛋白質序列的信使RNA（messenger RNA, m RNA），能特異性解讀mRNA中的遺傳信息、將其轉化成相應氨基酸后加入多肽鏈中的轉移RNA（transfer RNA, t RNA），直接參與核糖體中蛋白質合成的核糖體RNA（ribosomal RNA, r RNA）。一、RNA的轉錄無論是原核還是真核細胞，轉錄的基本過程包括：模板識別、轉錄起始、通過啟動子及轉錄的延伸和終止。1、 轉錄的特點2、 轉錄過程中所需物質1） 底物2） 模板3） RNA聚合酶A 聚合酶的特點B 大腸桿菌RNA聚合酶大腸桿菌RNA聚合酶由2個亞基、一個亞基、一個亞基和一個亞基組成，稱為核心酶(core

3、 enzyme)。加上一個亞基后則成為聚合酶全酶（holoenzyme），相對分子質量為4.65105。亞基可能與核心酶的組裝及啟動子識別有關，并參與RNA聚合酶和部分調節金子的相互作用。實驗證明，T4噬菌體感染大腸桿菌后對亞基的一個精氨酸殘基進行ADP糖基化修飾，造成RNA聚合酶全酶對啟動子親和力降低。因子可以極大地提高RNA聚合酶對啟動子區DNA序列的親和力，酶底結合常數提高103倍，酶底復合物的半衰期可達數小時甚至十小時。因子還能使RNA聚合酶與模板DNA上非特異為點的結合常數降低104倍。因子的作用是負責模板鏈的選擇和轉錄的起始使酶專一性識別模板上的啟動子。在某些細菌細胞內包含有能識別

4、不同啟動子的因子，以適應不同生長發育階段的要求，調控不同基因裝爐的啟示。列如，枯草桿菌中就有6種不同相對分子質量的因子。C 真核生物的RNA聚合酶真核生物中有3種RNA聚合酶，即RNA聚合酶I、RNA聚合酶和RNA聚合酶，分布于細胞核的不同部位。它們之間的區別主要在于對-鵝膏碳堿的敏感性：最敏感的是聚合酶，存在于核質中，轉錄前體m RNA；其次是聚合酶，也存在于核質中，轉錄t RNA、5S r RNA和其它幾種小分子RNA；不敏感的是聚合酶I，存在于核仁中，轉錄r RNA。這三種聚合酶的相對分子量都在5105左右，一般為814個亞基。聚合酶研究得比較深入，至少由1012個亞基組成，有2個最大亞

5、基。第一大亞基相對分子量為2.4105，相當于細菌RNA聚合酶的亞基，其羧基端有多磷酸化位點的7肽重復序列，稱為羧基末端結構域（carboxy-terminal domain, CTD），為聚合酶獨有特征，可能是轉錄起始過程中不同階段的開關。第二大亞基的相對分子量為1.4105，與大腸桿菌RNA聚合酶亞基有同源區，可能類似原核生物RNA聚合酶的亞基的識別功能。真核生物除上述3種RNA聚合酶外，在線粒體和葉綠體中，也發現了少數的RNA聚合酶，它們都是由核基因編碼，在細胞質中合成后再運送到細胞器中。這些RNA聚合酶的相對分子質量小，活性也比較低，這與細胞器DNA的簡單性是相適應的。4）終止因子 因

6、子是一種強堿性蛋白，由3個二聚體組成，能與RNA結合。能水解各種核苷酸三磷酸，實際上是一種NTP酶。RNA合成起始以后，因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產生的能量，沿著53方向朝著RNA聚合酶移動，到達RNA的3OH端后取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，使之從模板DNA上釋放m RNA，完成轉錄過程。3 原核生物的轉錄 一般過程包括啟動、起始、延伸、終止。1）啟動子A 定義B 幾個概念C 啟動子的結構2）識別原核生物RNA聚合酶中的因子識別轉錄起始點，并促使核心酶結合形成全酶復合物。被辨認的區段就是位于轉錄起始點-35區的TTGACA序列。酶與該區結合后，即滑動至-10區的TAT

7、AAT序列（Pribnow盒），并啟動轉錄。因子在DNA雙鏈上迅速、隨機滑動,尋找到啟動子因子識別轉錄起始點（-35區）促使核心酶結合形成全酶復合物酶與該區結合后,即滑動至-10區,并啟動轉錄。 3）起始4）延伸 核苷酸不斷加到RNA鏈的3OH上，RNA鏈就延長。酶沿DNA鏈移動，解開DNA螺旋，裸露一段新的單鏈模板區，核苷酸以共價鍵加合到RNA成長鏈的3末端，在去螺旋區形成一段RNADNA雜交鏈。在解螺旋的后部，DNA摸板鏈由于原配對鏈重新形成雙螺旋，RNA以自由單鏈形式被擠出來。 在延伸過程中，DNA分子和酶分子發生構象的改變。DNA從解旋到重旋。酶分子也是如此。在轉錄起始階段，全酶與DN

8、A分子形成穩定的復合物；在延長階段，亞基從全酶上釋放出來，由核心酶負責鏈的延伸。亞基的存在與否，因其與亞基構象上的變化，即當亞基締合時，與表現為有利于專一與DNA結合的構象，而亞基釋放后留下核心酶，則與DNA結合不專一，不能形成穩定的復合物。 鏈的延伸速度是不恒定的，在DNA某些區域，轉錄速度減慢或停止，這種速度的降低叫pause，pause發生在復含GC區，在圖中，由于GCAT的變化，使得突變株消除了pause，因為GC變成AT后降低了氫鍵的穩定性。 一個RNA聚合酶附屬因子，稱為NusA蛋白。像一樣，NusA與RNA聚合酶的核心酶結合，但不那么牢固。在細胞中，當釋放出來以后，NusA就馬上

9、與RNA聚合酶分子結合，并轉錄出一條RNA鏈。但是，在轉錄時，NusA并非總是固定在一個RNA聚合酶上，二是可以和幾個RNA聚合酶分子起作用。RNA聚合酶從DNA分子上釋放出來后，因子由于與核心酶的親合力比NusA大，所以又取代了NusA與核心酶結合在一起。5）終止（1）不依賴于因子的終止 終止位點上游一般存在一個富含GC堿基的二重對稱區，由這段DNA轉錄產生的RNA容易形成發夾結構。在終止位點前面有一段由48個A組成的序列，所以轉錄產物的3端為寡聚U，這種結構特征的存在決定了轉錄的終止。 在新生RNA中出現發夾式結構會導致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈5端的正常結構。寡聚U的存在

10、使雜合鏈的3端部分出現不穩定的r UdA區域。兩者共同作用使RNA從三元復合物中解離出來。（2）依賴于因子的終止 RNA合成起始以后，因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產生的能量，沿著53方向朝著RNA聚合酶移動，到達RNA的3OH后端取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，使之從模板DNA上釋放m RNA，完成轉錄過程。4 轉錄后的加工 RNA在轉錄完成后，繼續形成具有功能的活性的RNA分子。即轉錄后加工（Post-transcriptional processing）在轉錄中新合成的RNA往往是較大的前體分子，需要經過進一步的加工修飾，才轉變為具有生物學活性的、成熟的RNA分子，這一

11、過程稱為轉錄后加工或RNA的成熟。主要包括剪接、剪切和化學修飾。 與一個多肽鏈相對應的DNA片段加上啟動部位再加上終止部位叫做一個順反子，一次轉錄下來的mRNA可以包含一個順反子也可以包含多個順反子，分別叫做單順反子mRNA（mono-cistron mRNA）和多順反子mRNA（poly-cistron mRNA）。原核生物中，多順反子mRNA比單順反子更普遍。 由于轉錄與翻譯過程偶聯，大多數原核生物mRNA都不需要加工，轉錄后直接翻譯；只有少數多順反子mRNA需要經過加工，切成小單位后再進行翻譯。 rRNA 和tRNA的合成過程與mRNA沒有什麼不同，但r RNA 和t RNA有以下三點特

12、性與mRNA不同：成熟的rRNA和tRNA5端是5-單磷酸； 比原初轉錄產物小； 所有tRNA都含有稀有堿基1）mRNA的加工 少數多順反子mRNA須通過核酸內切酶切成較小的單位，然后再進行翻譯，加工的意義在于可對mRNA的翻譯進行調控。T7早期轉錄的6個基因轉錄成一個大的多順反子mRNA分子，每個mRNA分子之間有莖環結構，RNaseIII在莖環處將大分子切開，形成單個mRNA分子進行翻譯。切點在不配對的泡上，而不是在環上。2）tRNA的加工 tRNA的種類遠比r RNA要多，在原核生物中有3040種。并且一些tRNA基因和rRNA基因連接在一起。此外，tRNA基因多以基因簇存在，構成多順反

13、子轉錄單位。原核的tRNA初始轉錄本多為多順反子（polycistron），也就是幾個tRNA分子串連在一起。這有三種不同的情況：串聯的tRNA分子都是相同的，如在27的tRNATyr-tRNATyr；串聯的tRNA分子是不同的，如71的tRNAIle-tRNAAla-tRNAThr；由tRNA和rRNA串聯組成。少數的tRNA前體為單順反子（monocistron）如43的tRNAser（圖13-1）。tRNA的加工分成3個階段（圖13-2）：(1) 剪切、修剪和剪接： RNase P是一種不常用的酶，是由23蛋白和至少77RNA組成的復合體。其RNA長375nt，分子量為130kDa。RN

14、ase P具有內切酶的活性，是一類主要的加工酶，可切除E.coli前體tRNA 5端的前導序列（41nt），形成成熟的5末端，也被叫做tRNA5成熟酶。此酶不識別特殊的序列，而識別二級結構發夾所組成的tRNA。實驗還發現，RNase P的專一性也與3CCAOH有關。RNaseF是3內切核酸酶，切下前體中3端的核苷酸序列。RNase和RNaseE在tRNA加工中可能也起作用，使大的新生轉錄產物變得小些。 RNaseD，分子量38000U，為單一亞基蛋白質。可以從3端逐個切去附加的序列，以暴露出tRNA3端，是體內3tRNA成熟酶。 （2）核苷修飾 成熟的tRNA分子中含有許多修飾成分，不同的tR

15、NA所含修飾成分種類和數目都各不相同。tRNA的修飾是在多核苷酸鏈上進行的，由修飾酶所催化。 tRNA修飾酶具有高度的專一性，一般說來，每種修飾核苷都有催化合成本身的修飾酶。 tRNA甲基轉移酶，高度的專一性，如tRNA（腺嘌呤1）甲基化酶催化tRNA中特定位置的Am A，tRNA甲基化酶也具有嚴格的順序要求，如酵母中的二個甲基化酶，分別甲基化tRNA中的G19和G43生成m1G19和m1G43。 還有tRNA異戊烯轉移酶、tRNA鳥嘌呤轉糖苷酶和tRNA合成酶。3）rRNA的加工 大腸桿菌中的rRNA有三種：5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。這些rRNA和幾個tRNA全部包

16、含在一個具有5000個核苷酸的轉錄子中。 當轉錄子完成以后，一序列的酶與之作用。其中最主要的是RNase，這是一種切割雙鏈RNA的酶。四、真核生物的轉錄 真核生物的順式作用元件，即DNA上對基因表達有調節作用的特定序列，包括啟動子、增強子、沉默子。 真核生物的轉錄，是由RNA聚合酶與這些元件相互作用，在蛋白質輔助因子的協同下完成的。1、啟動子的結構 真核生物有3種RNA聚合酶，每種酶都有自己的啟動子。1）RNA聚合酶的啟動子 Pribnow實驗時發現5個核苷酸組成的共有序列，RNA聚合酶緊密結合位點，稱為Pribnow區，又位于上游10bp處，又稱為10區。2）RNA聚合酶的啟動子真核生物DN

17、A序列5上游區有一段與原核生物Pribnow區相似的富含TA的保守區列。在2535區含有TATA序列，稱為TATA框（hogness box），它可選擇轉錄起始位點，控制轉爐的精確性。在7080區含有CCAAT序列，為CAAT框，共有序列是GGCCCAATCT，決定啟動子的起始頻率。在80110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，稱為GC框，也具有調控啟示和轉錄效率的功能。3）聚合酶的啟動子 可以用上游和下游啟動子。分為兩類：內部啟動子和上游啟動子。2、增強子的結構 能強化轉錄起始的序列成為增強子或強化子（enhancer）。增強子位于上游，距轉錄起始點至少100bp以上，是一種遠端控

18、制元件，又稱游上激活序列（upstream activating sequence, UAS）或上游啟動子元件（upstream promoter element, UPE），它通過啟動子來增強轉錄效率。增強子區的跨度一般為100200bp，由812bp的“核心”組件構成，共有序列為TGGAAAG與TTT，可有完整或部分的回文結構，并以單拷貝或多拷貝的形式存在。增強子通常能距轉錄起始點14kb，甚至30kb外起作用。 增強子是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件，最早是在SV40病毒中發現長約200bp的一段DNA，可使旁側的基因轉錄提高100倍，其后在多種真核生物、甚至在原核生物中都發現了增強

19、子。增強子通常占100-200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，其基本核心組件常為8-12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強子的作用有以下特點：增強子提高同一條DNA鏈上基因轉錄效率，可以遠距離起作用，通常可距離1-4kb、個別情況下離開所調控的基因30kb仍能發揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。增強子的作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒置就不能起作用，可見增強子與啟動子是很不相同的。增強子要有啟動子才能發揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現活性。但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉錄。例如當含有增強

20、子的病毒基因組整合入宿主細胞基因組時，可能夠增強整合區附近宿主某些基因的轉錄；當增強子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉錄。使某些癌基因轉錄表達增強，可能是腫瘤發生的因素之一。增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調控元件一樣，必須與特定的蛋白質因子結合后才能發揮增強轉錄的作用。增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現活性，是由這些細胞或組織中具有特異性蛋白質因子所決定的。3、轉錄因子 真核生物的轉錄起始較為復雜。目前已知RNA聚合酶至少有六種不同的蛋白因子參與轉錄復合體的形成。這些蛋白因子被稱為轉錄因子（trans-criptional f

21、actor, TF)。包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TF-I。 4、轉錄的過程1）起始復合物的形成：，TFD與TATA框特異結合，形成TFD啟動子復合體；TFD是起始轉錄中最重要的基本起始因子。TFA進入復合物，使TFD能夠保護上游更遠的區段。TFB結合于TATA框的下游，保護模板鏈的起始區域。TFF攜帶RNApol裝配轉錄復合物。TFE結合，保護延伸的下游區段。 真核生物轉錄的起始，基本上與原核相似，先形成封閉復合物，再轉變成開放復合物。2）延伸 延伸前，TF因子要釋放，便于聚合酶活動轉錄。TF因子釋放后，RNA聚合酶轉變為延伸過程。TFH因子再延伸中起重要作用。TFH和TF

22、E結合進入無纏繞的DNA區帶，使RNA聚合酶開始移動進行轉錄。3）終止 目前機制還不是特別清楚，在一些因素的影響下，如，受到核小體結構的影響、蛋白因子與轉錄的3端結合、DNA雙螺旋結構彎曲、DNA形成環狀結構等等，轉錄起始復合物被迫停止在一定位置上，只是轉錄停止。修飾位點.轉錄越過修飾點后,合成的mRNA被切斷,隨即加polyA尾巴和5帽子.余下的RNA雖然繼續轉錄,但很快被RNA酶降解.5 轉錄后的加工 真核生物的核DNA，由于基因的長度和性質的差異，原使轉錄產物很不均一，被統稱為不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）。1）mRNA的加工A 帽 成熟

23、的真核生物mRNA，其結構的5端都有一個m7G-PPNmN結構，該結構被稱為甲基鳥苷的帽子。鳥苷通過5-5焦磷酸鍵與初級轉錄物的5端相連，反應由鳥苷轉移酶完成。當鳥苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN時，此時形成的帽子被稱為“帽0”，被尿苷酸7甲基轉移酶催化。第一個甲基出現在所有真核生物中，單細胞真核生物主要使這個結構。如果除m7G-PPNmN外，在第二個核苷酸核糖的第“2”號碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，稱為“帽1”，真核生物中以這類為主。如果5末端N1和N2中的兩個核糖均甲基化，成為m7G-PPNmPNm2，稱為“帽2”。有帽2的mRNA只占有帽mRNA總量的1015以下。

24、從真核生物帽子結構形成的復雜可以看出，生物進化程度越高，其帽子結構越復雜。有帽結構的mRNA可免遭核酸酶的破壞，更容易被蛋白質合成的起始因子所識別，從而促進蛋白質的合成。B尾目前還不清楚RNA聚合酶所轉錄基因的準確終止位點，但研究發現，幾乎所有真核基因的3末端轉錄終止位點上游1530bp處的保守序列AAUAAA對于初級轉錄產物的準確切割及加尾是必需的。大多數的真核mRNA 都有3端的多聚尾巴（A），多聚（A）尾巴大約為200bp。多聚（A）屠巴不是由DNA編碼的，而是轉錄后在核內加上去的。加polyA時需要由內切酶切開m RNA3端生物特定序列，然后受polyA聚合酶催化，該酶能識別，mRNA

25、 的游離3-OH端，并加上約200個A殘基。polyA是mRNA由細胞核進入細胞質所必須的形式，大大提高了mRNA在細胞質中的穩定性。C 剪接 在5端帽子和3端尾巴形成以后，內含子一個一個被切除，外顯子連接形成成熟的m RNA，這個過程就是RNA的剪接（核內） 。mRNA拼接反應需要有核內小分子RNA參與，以及它們與蛋白質形成的復合物稱為小核糖核蛋白顆粒（snRNA），SnRNA分別被命名為U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA(由100-200個核苷酸組成)。步驟：U1snRNA以堿基互補的方式識別mRNA前體5剪接點；由結合在3剪接點上游富嘧啶區的U2AF因子引導SnRNA中的U2sn

26、RNA與分支點相結合，形成一個剪接前提，并進一步與U4、U5、U6snRNA相結合，形成環狀結構剪接體，由特定的酶來識別切除該環狀結構，完成剪接過程。 內含子通常是有序或組成性的從mRNA前體中被剪接。真核生物 mRNA前體在剪接過程中，還可以形成套索樣的結構，在內含子序列中常有一個分支部位的腺苷酸殘基，它的2-OH可以自動攻擊內含子5端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開了外噗子1，而腺苷酸原來已有3，5-磷酸二酯鍵相連的兩個相鄰的核苷酸殘基，加上此3，5-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現了一個套索，已被切下的外顯子1的3-OH攻擊內含子3末端與外顯子2之間的3，5-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內含子

27、以套索的形式被節下來，此時外顯子1和外顯子2可以連接起來（圖17-13）。D 編輯 圖23.15 所示是哺乳動物的腸和肝臟中，載脂蛋白B(Apolipoprotein B)基因和mRNA的序列。基因組中含有一個單基因(割裂基因)，基因序列在所有的組織中都是相同的，編碼區有4563個密碼子。此基因轉錄成一個能代表肝臟中整個編碼序列的mRNA，翻譯的蛋白質大小為512kD，即全長載脂蛋白。在腸中合成的卻是只包含有2153個密碼子的m RNA，產生的蛋白質較短，為250kD 左右。這種蛋白質其實是全長載脂蛋白的N-末端。翻譯此蛋白質的mRNA序列和肝臟中的這種mRNA 序列基本相同，只是在第2153

28、個密碼子上的一個C 變成了U。這個堿基的替換使得編碼谷氨酰胺的CAA 變成了終止密碼UAA。是什么導致了這種替換？基因組中沒有編碼這種新序列的任何可變基因或外顯子，其剪接機制也沒有任何改變。我們只能認為在轉錄物的序列中直接發生了一種變化。 RNA 編輯的另外一個例子是在大鼠腦中谷氨酸受體中發現的。一個位置上的編輯使DNA中谷氨酰胺的密碼子在RNA中變成了精氨酸的密碼子，這種變化影響了通道的傳導性，因此對控制通過神經遞質的離子流有重要影響。在谷氨酸受體中另外一個位置上，一個精氨酸密碼子變成了甘氨酸密碼子。載脂蛋白B中的編輯使C2153變成了U；谷氨酸受體中兩個位置上A變成了I(次黃苷)。這些事件

29、是脫氨基作用，即核苷酸環上的氨基酸基團被除掉了。這些事件分別是由胞苷和腺苷脫氨酶(Deaminase)催化的。如在錐蟲cox的mRNA上158個位點插放了394核苷酸；在9個位點刪去了18個尿苷酸，實際增加了376個核苷酸，使coxIII的長度增加了55%。因此cox的基因比成熟的mRNA小了很多，故稱其隱匿基因。E 變異不論拼接過程如何，拼接必須極為精確，否則會導致遺傳信息傳遞障礙，合成的蛋白質可能喪失其正常的功能。我國南方廣大地區是-地中海貧血的高發區，這是由于-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制所引起的一種血紅蛋白病。實驗表明-珠蛋白基因元1中核苷酸的點突變改變了正常拼接部位的堿基順序，結

30、果造成錯誤部位的拼接。加工成熟的 mRNA雖能翻譯，但產物不是正常的-珠蛋白，結果引起血紅蛋白級結構和功能的改變。2）tRNA加工原核生物和真核生物剛轉錄生成的tRNA前體一般無生物活性，需要進行剪切和拼接堿基修飾3-OH連接-ACC結構。成熟的tRNA分子中有許多的稀有堿基，因此tRNA在甲基轉移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如AmA,GmA。有些尿嘧啶還原為雙氫尿嘧啶。尿嘧啶核苷轉變不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脫氨基為成為次黃嘌呤核苷酸（）3末端加上CCA：在核苷酸轉移酶作用下，3-末端除去個別堿基后，換上tRNA分子統一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂結構。 tRNA前體的

31、加工tRNA前體在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大腸桿菌RNase P可特異剪切tRNA前體的5旁順序，因此，該酶被稱為。除了RNaseP外，tRNA前體的剪切尚需要一個3-核酸內切酶，這可將tRNA前體3端的一段核苷酸序列切下來。此外RNaseD是tRNA3端成熟酶。近年來的研究表明大腸桿菌RNaseP是一種非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白質組成，最近發現RNAaseP分子中的RNA部分在某些條件下，可以單獨地催化tRNA前體的加工成熟，這個發現和四膜蟲tRNA能自我拼接被認為是近十年來生化領域內最令人鼓舞的發現之一。說明RNA分子確具有酶的催化活性。經過剪切后的t

32、RNA分子還要在拼接酶作用下，將成熟tRNA分子所需的片段拼起來。 轉錄后加工：第一，切除tRNA前體兩端多余系列。tRNA前體5端較成熟tRNA通常多幾個到10個核苷酸，去除這些核苷酸是有高度專一的RNaseP（即tRNA 5端成熟酶）催化的。tRNA 3端的切除有兩個酶催化，即tRNA3端成熟核酸內切酶核酸外切酶。第二是末端的添加，即在3添加CCA序列，此一步驟由tRNA核苷 轉移酶（tRNA nu-cleotidyl transferase）催化。第三，修飾。tRNA修飾堿基很多，主要為甲基化修飾占被修飾堿基的一半以上。其它如堿基（U異化產生），Y堿基（tRNA特定位置上的G37轉變而來

33、），I和Q主要系置換產生（前者是次黃嘌呤置換了前提tRNA上34位的腺嘌呤，后者是Q堿基置換了前提tRNA34位上的鳥嘌呤獲得）。3）rRNA加工真核生物rRNA前體比原核生物大，哺乳動物的初級轉錄產物為45s，低等真核生物的rRNA前體為38s，真核生物5sRNA前體獨立于其他三種rRNA的基因轉錄。真核生物rRNA前體的加工真核生物rRNA前體中含有插入順序，rRNA前體要形成成熟的rRNA，需要經過拼接反應。例如，四膜蟲的rRNA前體的拼接是一種無酶催化的自動拼接過程。四膜蟲基因組內，26srRNA編碼的區域內有413bp的插入順序。該插放序列可以不消耗能量從rRNA前體中被除掉。用SD

34、S煮沸和用蛋白酶外理等破壞酶活性辦法，都不能破壞拼接活性，但反應中Mg2+和鳥嘌呤核苷酸是必在的。用32P-GTP進行追蹤實驗表明，起始過程是GTP在插入順序5端發生親核反應，同時GMP與5端切點的切除段形成磷酸二酯鍵并使原RNA斷開。第二步是5切點的外元3-OH與3切點的外元5-P共價連接，獲得成熟的rRNA，被切除部分最后環化，形成一個環狀結構，同時從5端去掉一個15核苷酸啐片。剩余部分連接成399核苷酸的環狀產物，再經過幾步，最后切下一個19個核苷酸的線性內含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由內含子本身的催化性質決定的 。從哺乳動物的中間產物的大小來看rRNA前體的加

35、工可能有多種途徑，但并不是所有的途徑都已搞清楚了。圖13-9表明HeLa（人類）細胞和L（鼠）細胞中rRNA的加工途徑：切除5端的前導序列，即外部的轉錄間隔序列（ETS），使45S的初始轉錄本變成41S的中間產物；從41S的中間產物中先切下18S的片段，但Hela細胞途徑和L途徑不同，前者的切點在18S和5.8S之間的內部轉錄間隔序列（ITS），產物分別為20S（含18S rRNA片段）和32S；而后者的切點在18S序列和ITS的交界處，這樣18S rRNA就已經成熟，無需修整，故稱為先成熟；部分退火：兩種途徑中的32S和36S中間產物（含5.8S和28S rRNA）中的5.8S和28S之間進

36、行退火，形成發夾結構；最后修正：在HeLa細胞途徑通過外切酶等將20S中殘余的ITS切除，還要將已退火的32S中的ITS切除掉；在L細胞途徑中只需將已退火的32S中的ITS切除即可。我們現在尚不知道加工的細節；但已知道45S RNA立即和蛋白質結合，在核糖體上進行加工，而不是以游離的rRNA進行加工的。 4）核酶的發現眾所周知，核酸DNA、RNA是遺傳信息的載體，而作為功能分子的蛋白質能催化成千上萬的化學反應，即起著酶的作用。蛋白質與DNA、RNA之間存在著千絲萬縷的聯系，這一點從中心法則中可窺其一斑（圖1）。沒有DNA和RNA，就無法進行蛋白質的生物合成，而沒有酶（蛋白質），DNA和RNA無

37、法自我復制或相互轉錄。蛋白質是DNA和RNA調控的產物，而DNA、RNA的自我復制離不開蛋白質，那么蛋白質（酶）與核酸（DNA、RNA）在生命形成過程中究竟孰先孰后呢？RNA可作為催化劑這一功能的發現打破了生物體內生化反應僅由蛋白質酶催化的框子，為生命進化提供了新的理論。這種RNA的形成需要從其前體中準確地切去含有413個核苷酸的插入片段（IVS）并進行一系列切割、剪接（圖2、3）。在研究中，Cech等驚訝地發現，該片段的切割、剪接并不需要酶至少不需要傳統意義上的酶只需要適量三磷酸鳥苷（GTP），或者正如后來所發現的，只需要適量鳥嘌呤或其衍生物。核酸所進行的是一系列快速、溫和的化學反應，從而導

38、致不需要蛋白質酶的輔助而完成自身的切割、剪接。在剪接過程中，鳥嘌呤（或其衍生物）進攻RNA中413個核苷酸插入序列的5端。這是一種酯交換反應，鳥嘌呤的羥基（OH）進攻第一個內含子核苷與第一個外顯子核苷之間的磷酸二酯鍵的3端，使得鳥嘌呤基團與內含子的5端相連，而外顯子的3端被游離出（圖3）。“自由”了的外顯子3端又自發地與413個核苷酸插入序列的最遠端相接，完成了將外顯子兩端相剪接的過程。內含子被切除，外顯子被剪接后，自由的內含子又自發地產生了一系列反應（圖4）。首先該多聚核苷酸的3端幾乎完全專一地進攻第15個核苷與第16個核苷之間的磷酸二酯鍵，形成環多聚核苷酸，從而導致從內含子的5端切去含15

39、個核苷酸的片段。如果該環多聚核苷酸被置于高pH值（如pH=9.0）環境下，則分子精確地在最新形成的化學鍵處開環。活潑的3端又一次進攻，切去含有4個核苷酸的短鏈，并再一次成環。同樣，在堿性條件下開環，形成了含有395個核苷酸的多聚核苷酸長鏈。定義為Ribozyme，即RNA酶（或RNA催化劑）。然而，近年的研究發現，許多RNA卻能催化其他分子而不是本身，從此，Ribozyme就完全符合酶的定義了。類內含子的結構特點類內含子的結構特點是：其邊界序列為5 U G3（表示剪切位點）；具有中部核心結構（Central core strucature）。所有的類內含子中都具有2級結構，圖13-24表示四膜

40、蟲內含子中二級結構模型，共九個配對區（P1-P9）其中有2個配對區（P4和P7）是類內含子中共有的保守序列，P4由P和Q序列形成，長10nt，有6-7堿基是可以配對的。P7是由R和S序列構成的，長12nt，但只有5個堿基可配對。其他的配對區在不同的內含子中是不同的，突變分析表明，P3，P4，P6，P7是核心結構，也就是可以執行催化的最小區域。 具有內部引導序列（internal guide sequence IGS）。Davies（1982年）第一個提出了內部引導序列，它由六個nt組成，GGAGGG（四膜蟲）。內含子中可與外顯子配對的序列稱為內部引導序列。最初人們認為IGS的作用是通過和兩個外

41、顯子近側區域配對，使外顯子并在一起，現在認為其作用是決定剪接的專一性。而且使切點的U處于易于受到攻擊的暴露點。有的序列很短，在P7和P9之間配對，要在內含子3端G激活前立即配對。堿基的配對對于產生核心結構是很必要的，順式作用位點的突變就會阻止類內含子的剪接。各種突變的線粒體內含子在體內都不能被切除，而四膜蟲的內含子插入到細菌基因中，再轉化到細菌中，它仍可以剪切。圖13-25表示構建一個重組DNA，轉化到在E.coli中表達。將自我剪接的內含子插到-半乳糖苷酶的第10個密碼中，再轉化-gal-E.coli，若此內含子不被剪接的話，-半乳糖苷酶基因受到破壞不能表達，菌株為白色，若能自我剪切，則-半

42、乳糖苷酶基因可以翻譯成完整的酶，能使底物X-gal發酵變蘭。用此方法可以檢測內含子是否具有自我剪接的活性。(二) 類內含子的剪接機制核酶具有多種催化活性，對于類內含子來說這些活性是由于它可以產生特殊的二級和三級結構，形成活性位點，相當于傳統酶的激活位點。圖13-26就表示在這些位點上進行的剪接反應。內含子的二級三級結構形成了G苷酸結合位點和底物結合位點，后者依賴于內部引導序列的配對來確定。核心結構和內部引導序列又使這兩個位點彼此靠近，便于相互作用。首先是GTP進入G結合位點，左邊外顯子的3端通過和引導序列的互補配對進入底物位點。GTP的3-OH作用左邊外顯子和內含子交界處的磷酸二酯鍵，本身結合

43、到內含子的5末端，被切下的5外顯子仍保持在底物位點上，并未游離。第二步內含子的G414（即3交界序列上的G）又進入了G-結合位點，切下的外顯子的3-OH又對G-結合位點上的G與3外顯子之間的磷酸二酯鍵發動親核進攻，切開磷酸二酯鍵，而其3-OH和3外顯子的P重新形成磷酸二酯鍵而連接起來，這樣就完成內含子的剪接。內含子成為線形的413nt的RNA分子。第三步，內含子5端和引導序列相鄰的序列通過引導序列互補配對，進入底物位點。仍然留在G結合位點上的G414其3-OH再作用底物位點上的序列，切下19nt的內含子5端，并和余下內含子的5-P形成二酯鍵，形成414nt的環狀內含子。類內含子的剪接型內含子在

44、植物和低等真核生物的細胞器基因組中發現。類內含子的剪接和I類內含子不同，而和核mRNA 內含子的剪切有些相似。但也有不同之處。(一)結構特點1列為5GUGCGYnAG，符合GT-AG法則。2二級結構的形成使兩個并列的功能區靠近。功能區5和功能區6被2堿基隔離開。功能區6含有1個不配對A殘基，其上帶有2-OH首先進行轉酯反應。3在內含子的近3端具有分支點順序（branch-point seguence），也就是在第6功能區有6-12nt保守序列，在哺乳動物中為YNCURAY（Y：嘧啶，R：代表嘌呤，N表示任何核苷酸）。分支點順序可和上游序列互補，形成莖環，但A不配對（圖13-27）。(二)剪接機

45、制類內含子的剪接無需鳥苷的輔助，但需鎂離子的存在。首先是分枝點A的2-OH對5端外顯子和內含子交界處的磷酸二酯鍵發動親核進攻（圖13-28）切下外顯子1，內含子5的邊界序列上的G與5磷酸和分枝點A的2-OH形成磷酸二酯鍵，從而產生了套索（lariat）結構；第二步是切下的外顯子1，其3-OH繼續對內含子3端的交界序列進行親核進攻，切下的外顯子2的5磷酸和外顯子1的3-OH形成磷酸二酯鍵，連接在一起，同時釋放出套索狀的內含子。核mRNA的剪接和類內含子十分相似，但根本的不同點是核mRNA前體的剪接本身不能形成二級結構，必需依賴于snRNP（U1，U2，U4，U5，U6）的幫助才能形成剪接體，進行

46、自我剪接。它們自己本身不能象I類及類內含子那樣依賴核心結構，形成莖環，將5和3剪切點拉在一起。和snRNA的結合是相當復雜的，但剪接反應的第一步5位點的剪接是由U6催化的，3位點是由5外顯子1的3-OH對內含子3端切點進行轉酯反應來完成。(一) 結構特點1. 邊界順序:其邊界序列是完全符合GU-AG法則。2. 分枝點順序：它和類內含子相似也具有分枝點順序。位于內含子3端上游18-40nt處，序列為Py80NPy87Pu75APy95其中A為百分之百的保守，且具有2-OH。3. 內含子5端有一保守序列（5GUAAGUA3）可以和U1 snRNA的5端的保守順序3CAUUUCAU5互補（圖13-2

47、9）。(二)剪接機制圖13-29已初步表明了核mRNA剪接的過程，實際上要比這復雜得多，首先要解決的是如何識別剪接位點，一般是通過兩種途徑：存在一種酶可以特異識別它們，并將兩者的保守序列拉到一起；通過RNA的堿基配對產生二級結構，再由一種酶來識別。核mRNA的剪接可能要依賴于反式作用RNA（trans-acting RNA）。在高等生物中都含有很多的不連接的小分子RNA片段，在高等生物中其長度在100-300nt，在酵母中長度可達1000nt，其豐度很高。僅限制在核內的這些RNA稱為小分子核內RNA（small nuclear RNAs, snRNA）。在細胞質內的稱為小分子胞質內RNA(sm

48、all cytoplasmic RNAs,ScRNA)。在自然狀態下，它們以核糖核蛋白（snRNP）的形式存在。在剪接裝置中會有幾種snRNPs和大量的附加蛋白，常稱為剪接因子,這些snRNPs是U1，U2，U5和U4/U6。U1，U2和U5 snRNA每種都含有單個的snRNA和幾種蛋白，而U4/U6含有U4和U6 snRNAs及幾種蛋白。U1 snRNA自我配對形成了多個莖環結構，從而構成了不同的功能區（圖13-30）。Sm結合位點是和其他snRNP相互作用的區域。其5末端有一保守序列：3CAUUCAU 5，這一序列可與核mRNA內含子5端的邊界序列互補結合，這對于剪接反應是很重要的。以腺

49、病毒12S RNA的5端邊界順序為例，如果此序列發生突變，從GUGAGG突變成為GUGAAU，雖然僅二個堿基發生突變，配對的堿基數仍然未變，僅減少了一個氫鍵，結果不能剪接。若在此基礎上U1 RNA的5端序列也發生相應的突變，使得突變的堿基也能配對，結果又恢復了剪接的能力（圖13-31）。由此可見U1 RNA 5端保守序列和內含子5剪接位點的配對對于剪接反應來說是十分重要的。其作用可能是通過配對使URNP可以和核mRNA3剪接位點牢固地結合，再通過U1和其他snRNP的相互作用使5剪接接點與3剪接位彼此靠近，彌補了核mRNA本身不能通過形成特殊的二級結構將兩個剪接位點拉近的問題。使剪接能順利進行

50、。圖13-32表示snRNAp的剪接功能和反應步驟。第一步是U1通過和5剪接位點的配對和5位點結合。但U1也可和分枝點結合，因帶有突變的分枝位點的pri-mRNA其5位點是不能和U1snRNA結合的，現在還不知道U1如何識別分枝位點的，可能和snRNP的某些組分有關，或者存在某些輔助因子。U1的存在對于第二步也是必要的。在第二步中U2 snRNA結合在分枝位點上。U2 snRNA通過和分枝位點的堿基配對來識別它。在酵母中分枝位點順序為5UACNACA 3，由于分枝位點緊靠3剪接位點，U1 snRNA（結合在5位點）和U2snRNA（結合在分枝位點）之間的反應使兩個剪接點彼此靠近。含有U5和V4

51、/U6 snRNA的3聚體結合，水解ATP，現在剪接裝置的所有成分都全部到位，在剪接反應前，它們都裝配起來。U1和U2是剪接起始階段是所需要的，它們的失活會阻礙5位點的剪切和套索的形成。雖5位點和U1snRNA的堿基配對是負責剪接位點的識別，但并不控制剪切。U1在反應開始前解離。在此點上的U5 snRNA會改變自己的位置，開始它靠近外顯子，后來移到附近的內含子上。催化反應是通過U4的釋放來啟動。此也需ATP的水解，U4snRNA的作用可能是抓住U6snRNA，直到U6參加反應。以上幾種內含子的剪接機制是不同的，現總結如表11-2所示：表11-2 幾種不同內含子剪接反應的區別酵母tRNAI類內含

52、子類內含子核mRNA前體邊界順序無5U-G35GU-AG35GU-AG3特殊順序C（莖上）G(環上)內部引導序列分支點順序分支點順序,5外顯子順序二級結構莖環構象核心結構5、6功能區連接體基因外的成分內切酶，連接酶GTP，鎂離子鎂離子U1U2,U4,U5,U6能量要求ATP不不ATP中間型分子半分子tRNA環狀L-19 IVS套索套索Ribozyme的類型與特點 自從第一個Ribozyme被發現并命名后，至今已發現了幾十種Ribozyme。現已發現的Ribozyme按其作用方式可分為切割型和剪接型。切割型的Ribozyme是只切不接，而剪接型的卻既剪又接。無論是切割還是剪接，所有的切割-連接反

53、應都是轉酯基作用，即酯交換過程。根據作用的底物分類，Ribozyme可分為自體催化和異體催化兩類。絕大多數Ribozyme以自身為底物，進行自體催化，即自我切割或自我剪接。而異體催化則是以其他分子為底物，可以是不同的RNA，也可以是其他分子。各類Ribozyme通常以RNA為底物，但也有例外。與蛋白質酶相比，Ribozyme的催化效率較低。如四膜蟲rRNA插入序列具有核糖核酸酶的作用，水解RNA的速率為30秒鐘一次，而胰RNA酶作用速率則為每秒鐘數千次。另外，RNaseP中RNA單獨作用時，催化效率很低，而結合蛋白質后，其催化效率大為提高，這也許與蛋白質上含有多種活潑基團有關。核酶作用方式較簡

54、單，歸納起來主要有以下幾種類型：剪切型，這類核酸能催化自身RNA或異體RNA分子剪掉一段核苷酸片段，其催化功能相當于內切核酸酶的作用。剪接型，這類核酶催化自身RNA進行化學反應，首先切去自身RNA內一個核苷酸片段，再將剩余的兩個片斷連接起來；相當于內切核酸酶及連接酶的聯合作用。其他類型，如核苷酸轉移，脫磷酸作用。錘頭狀結構的RNA分子有13個保守的核苷酸序列，如果它們中的堿基改變會使這種催化活性失去作用。根據這種特片，科學家們在體外沒計并人工合成這種RNA分子，用于抗腫瘤及抗病毒的實驗中。1. 核酶的錘頭結構:科學家Symons自多種植物病毒衛星RNA及類病毒RNA的自我剪接研究中，觀察到自我

55、切割區內有錘頭結構（hammer-head structure），其中的結構特點是：（1）三個莖區形成局部的雙鏈結構；其中含13個保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。（2）圖中的箭頭表示自我切割位點，位于GUX的X外側，X可表示為C、U或A，不能是G2. 核酶的作用（1）核苷酸轉移作用。（2）水解反應，即磷酸二酯酶作用。（3）磷酸轉移反應，類似磷酸轉移酶作用。（4）脫磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。（5）RNA內切反應，即RNA限制性內切酶作用。從大多數Ribozymw的結構中發現一些特征，例如：錘頭狀結構的RNA分子有13個保守的核苷酸序列，如果它們中的堿基改變會使這種催化活性失去作用。根據這種特點

56、，科學家們在體外設計并人工合成這種RNA分子，一個19ntRNA和一個24ntRNA，形成錘頭RNA。其中19ntRNA是酶，而24ntRNA是底物。合成的核酶在特定的部位切割靶RNA，以阻止病原物的RNA病毒的基因或基因組的表達，達到治療RNA病毒病的目的，用于抗腫瘤及抗病毒的實驗中。1. RNA為生物催化劑，具有重要生物學意義。2.打破了酶是蛋白質的傳統觀念。3.在生命起源問題上，為先有核酸提供了依據。4.為治療破壞有害基因，腫瘤等疾病提供手段。 有關RNA酶的資料：RNA作為催化劑的化學本質磷元素在生命化學過程中起著重要作用，磷酯基團充分勝任DNA、RNA的橋連基團的角色。這是因為磷酯基

57、團既能連接兩個核苷基團，又能保證自身的離子化。其離子化不僅可使核酸分子能存在于磷脂生物膜中，而且能防止被水解，確保核酸分子的穩定。磷酯基團的這些特殊功能是其他基團所無法替代的。不僅如此，由于磷酯基團的存在，能導致一系列不需要酶作用而發生的生化反應，這是其他基團所無法替代的，而Ribozyme的催化機理正是其中一種在磷酯基團作用下發生的自發反應。磷酯基團的特殊功能與磷原子的原子結構密切相關。磷位于元素周期表近中心位置，外層有3個未成對的p電子和5個3d空軌道。其3s、3p及3d軌道的能量較為接近，易形成sp3、sp3d、sp3d2等多種雜化軌道，具有形成4、5、6等根化學鍵的能力。核酸磷酯基團中的磷為五配位結構，由于磷原子具有較多可利用的空電子軌道，配位數較多以及各化合價態間在一定條件