1、第十六章DNA的復制與修復-王鏡巖生物化學第三版筆記(完美打印.txt43風帆，不掛在桅桿上，是一塊無用的布；桅桿，不掛上風帆，是一根平常的柱；理想，不付諸行動是虛無縹緲的霧；行動，而沒有理想，是徒走沒有盡頭的路。44成功的門往往虛掩著，只要你勇敢去推，它就會豁然洞開。 第十六章DNA的復制與修復 第一節 DNA的復制 一、半保留復制（semi-conservation replication）（一）證據：1.用氮15標記大腸桿菌DNA，然后在氮-14中培養，新形成的DNA是雜合雙鏈，即雙鏈中一條是重鏈（約重1），一條是輕鏈。第二代則有一半全是輕鏈，一半是雜合雙鏈。2.大腸桿菌DNA在用氚標記

2、的胸苷復制近兩代，放射自顯影，未復制部分銀密度低，由一條放射鏈和一條非放射鏈組成；已復制部分有一條雙鏈是放射的，一條雙鏈有一半是放射的。這證明大腸桿菌DNA是環狀分子，以半保留方式復制。（二）特點：子代保留一條親代鏈，而不是將它分解。這說明DNA是相對穩定的。雙螺旋DNA（或RNA）是所有已知基因的復制形式。二、復制的起點和單位（一）基因組能獨立進行復制的單位稱為復制子。原核生物是單復制子，真核生物是多復制子。每個復制子有起點。通過測定基因出現的頻率可以確定起點位置，距離起點越近的基因出現的頻率越高。起點有發動復制的序列，也有決定拷貝數的序列。起點的結構是很保守的。（二）復制終止點：已發現Ec

3、oli的與復制終止有關位點，其中含有23bp的保守序列，由tus蛋白與此位點結合參與復制的終止。真核生物中似乎沒有復制終止點。（三）復制多數是雙向、對稱的，但也有例外。通過放射自顯影可以判斷復制是雙向還是單向：先在低放射性培養基中起始復制，再轉移到高放射性培養基中，如是雙向復制，其放射自顯影圖是中間銀密度低；單向復制則為一端低。（四）單向復制有一些特殊方式：1.滾動環：噬菌體X174DNA是環狀單鏈分子，復制時先形成雙鏈，再將正鏈切開，將5'連接在細胞膜上，從3'延長，滾動合成出新的正鏈。2.取代環：線粒體DNA復制時是高度不對稱的，一條鏈先復制，另一條鏈保持單鏈而被取代，呈D

4、環形狀。這是因為兩條鏈的復制起點不同，另一條鏈的起點露出才能復制。三、有關的酶（一）反應特點：1.以四種dNTP為底物2.需要模板指導3.需要有引物3'-羥基存在4.DNA鏈的生長方向是5'-3'5.產物DNA的性質與模板相同（二）大腸桿菌DNA聚合酶1.DNA聚合酶I：單鏈球狀蛋白，含鋅。有聚合酶活性和外切酶活性，其中3'-5'外切酶活性起校正作用，5-3活性起修復和切除引物作用。DNA聚合酶I主要起損傷修復作用。每秒可聚合10個堿基。切除氨基端5-3外切酶活性后稱為Klenow fragment，用于引物標記等。2.DNA聚合酶II：單鏈，以切口雙鏈

5、DNA為模板，作用不清楚。3.DNA聚合酶III：起DNA復制作用，功能與聚合酶I相似。全酶共10種亞基，含鋅。每秒可聚合1000個堿基。2 / 9（三）真核生物DNA聚合酶：有a、b、g、五種，性質與大腸桿菌的酶相似，多無外切酶活性。a相當于聚合酶III，用于引發、滯后鏈合成；b主要起修復作用，位于線粒體，合成前導鏈，但前50個堿基由a合成。（四）DNA連接酶：使雙鏈DNA切口處的5'-磷酸和3'-羥基生成磷酸二酯鍵。需供能，細菌用NAD，動物和噬菌體用ATP，形成焦磷酸鍵的活化形式，再由3'羥基發動親核攻擊，形成磷酸二酯鍵。大腸桿菌的連接酶作用于粘末端，T4的還可作

6、用于平末端。四、半不連續復制（semi-discontinuocos replication）（一）復制叉由5'向3'方向連續復制，稱為前導鏈；另一條鏈復制叉由3'向5'移動，而DNA復制方向不變，形成許多不連續片段，稱為岡崎片段，最后連接成完整的DNA，稱為滯后鏈。（二）首先由引物合成酶由5'向3'方向合成10個核苷酸以內的RNA引物，然后聚合酶III在引物3'-羥基上合成DNA，再由聚合酶I切除引物，填補空白，最后DNA連接酶將岡崎片段連接起來，形成完整DNA。（三）復制具有高度忠實性，其錯配幾率約為10-10，從熱力學上考慮，堿基發

7、生錯配的幾率約為10-2，酶對底物的選擇作用和校正作用各使錯配幾率下降10-2，所以體外合成DNA的錯配幾率為10-6。體內復制叉的復雜結構提高了復制的準確性，修復系統對錯配加以糾正，進一步提高了復制的忠實性。五、解鏈復制時必需解鏈，如靠旋轉，則大腸桿菌DNA要達到每分鐘6000轉。其實復制時是用拓撲異構酶和解螺旋酶來解鏈的。拓撲異構酶I可切斷一條鏈，牽引另一條鏈通過切口，再連接起來。每次可消除一個負超螺旋，不需要ATP。同轉錄有關。拓撲異構酶II每次引入2個負超螺旋，需要ATP。引入負超螺旋可消除復制叉前進帶來的張力，促進解鏈。解螺旋酶通過水解ATP來解開雙鏈，每對堿基需2個ATP。單鏈結合

8、蛋白(SSB)可與解開的單鏈結合，防止復性和水解。六、DNA復制體的結構七、與DNA復制有關的酶和蛋白質因子由30多種，他們在復制叉上形成離散的復合物，彼此配合，進行高度精確的復制，這種結構稱為復制體。引物合成酶與另外6種蛋白構成引發體。在DNA復制叉上進行的基本活動包括：（一）雙鏈的解開（二）RNA引物的合成（三）DNA鏈的延長（四）切除引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片斷（五）切除和修復尿嘧啶和錯配堿基。八、真核生物DNA的復制（一）真核生物有核小體結構，復制速度慢，復制叉每分鐘移動約10003000堿基對，而細菌約為50千堿基對。真核生物有許多復制起點，復制子只有細菌的幾十分之一，所以復

9、制時間在同一數量級（E.coli 4.2Mb，酵母、果蠅40Kb，植物300，蛙200，鼠150Kb）。快速生長的原核生物，其復制起點可連續復制，而真核生物采取多復制起點的方法加速復制。（二）真核生物復制時，核小體打開，組蛋白直接轉移到子代前導鏈上，滯后鏈用新合成的組蛋白。所以DNA是半保留的，而組蛋白是全保留的。真核生物岡崎片段長度約為200堿基對（E.coli 12Kb），相當于一個核小體的長度。（三）真核生物的增殖周期可分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有絲分裂期（M期）等四個時相，間期為分裂期作準備，進行生物大分子和細胞器的倍增。前期合成DN

10、A復制必須的蛋白質和RNA，復制期先復制常染色質DNA，再復制異染色質。然后進入有絲分裂的準備期。前期變動較大。分裂期后，有些細胞進入前期，開始下一個周期；有些失去分裂能力；有些脫離分裂周期，或進行分化，或進入靜止期（G0期）。成年動物大部分細胞處于靜止期。九、DNA復制的調控復制有復雜的調控機制。有正調節，也有負調節。有順式作用，即以某DNA序列為調控因子；也有反式作用，即以基因的產物，如蛋白質或RNA為調控因子。原核生物的復制起點與細胞膜相結合，復制與細胞膜有密切關系。真核生物復制從核膜開始，與質膜也密切相關。dnaA濃度決定起始頻率。第二節 DNA的修復 一、DNA的損傷（一）環境作用1

11、.物理因素2紫外線：形成嘧啶二聚體，使轉錄終止，復制受阻。2電離輻射：X-射線等，主要通過電離作用造成損傷。可造成多種損傷，如DNA斷裂、堿基脫落、雜環破裂、氧化等。2.化學因素2烷化劑：有活潑烷基，可轉移到堿基或磷酸上，如硫酸二甲酯、芥子氣等。鳥嘌呤的O6和N7最易烷化，導致錯配(GT)或脫落。磷酸三酯不穩定，易斷裂。雙功能試劑可造成交聯。2堿基或核苷類似物：FU、BrdU、6-巰基嘌呤等。可競爭抑制核苷酸合成或摻入核酸導致錯配。2亞硝酸鹽及亞硝胺：前者造成脫氨，后者氧化后生成烷化劑和自由基。2代謝活化化合物：如苯并笓、黃曲霉毒素等。經混合功能氧化酶催化形成環氧化物，與核酸結合，造成突變。以

12、上物理及化學因素統稱誘變劑。3.生物因素2DNA、RNA腫瘤病毒可插入基因組，引起突變。（二）自發性損傷1.復制時的堿基錯配2.互變異構：ANH時可形成A=C，GOH時可形成GT三鍵配對3.堿基脫氨：C-U，A-I，G-X4.堿基丟失：大腸桿菌每代丟失一個嘌呤，哺乳動物可達一萬個。嘧啶丟失幾率只有嘌呤的120。二、光復活光復活酶可被可見光（300600納米，400納米最有效）激活，分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。此酶廣泛存在，但人體只存在于淋巴細胞和皮膚成纖維細胞，且是次要修復方式。三、切除修復（一）細胞內有多種特異的核酸內切酶，可識別DNA的損傷部位，在其附近將DNA單鏈切開，再由外切

13、酶將損傷鏈切除，由聚合酶以完整鏈為模板進行修復合成，最后有連接酶封口。（二）堿基脫氨形成的尿嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤可被專一的N-糖苷酶切除，然后用AP（apurinic/apyrimidinic，缺嘌呤或缺嘧啶）核酸內切酶打開磷酸二酯鍵，進行切除修復。DNA合成時消耗NADPH合成胸腺嘧啶，可與胞嘧啶脫氨形成的尿嘧啶相區別，提高復制的忠實性。RNA是不修復的，所以采用"廉價"的尿嘧啶。（三）切除修復不需光照，也稱暗修復。大腸桿菌中有UvrABC系統，可切除修復嘧啶二聚體。人體缺乏相應系統則發生"著色性干皮病"，皮膚干燥，有色素沉著，易患皮膚癌。可加入T4

14、內切酶治療。四、重組修復 以上修復發生在復制前，稱為復制前修復。復制時未修復的損傷部分會留下缺口，通過遺傳重組進行修復：從完整的母鏈上將相應序列移至缺口處，用再合成的序列填補母鏈的空缺。此過程也叫復制后修復。重組修復中原損傷沒有除去，但若干代后可逐漸稀釋，消除其影響。所需要的酶包括與重組及修復合成有關的酶，如重組蛋白A、B、C及DNA聚合酶、連接酶等。五、誘導修復 DNA嚴重損傷能引起一系列復雜的誘導效應，稱為應急反應，包括修復效應、誘變效應、分裂抑制及溶原菌釋放噬菌體等。細胞癌變也可能與應急反應有關。應急反應誘導切除和重組修復酶系，還誘導產生缺乏校對功能的DNA聚合酶，加快修復，避免死亡，但

15、提高了變異率。單鏈DNA誘導重組蛋白A，可水解Lex A蛋白，使一系列基因得到表達，如RecA、UvrABC、SOS修復所需的酶等，產生應急反應。應急反應可作為致癌物的簡易檢測方法。采用缺乏修復系統、膜透性高的E.coli突變株，并添加鼠肝勻漿液。六、Ada蛋白也叫適應性蛋白，可識別甲基化的DNA，將甲基轉移到自身的半胱氨酸上，不可逆，故稱"自殺修復"。可修復磷酸及鳥苷上的甲基。七、真核細胞修復特點1. 多聚腺苷酸核糖化：由多聚(ADP-核糖)聚合酶催化，用NAD合成并轉移到相應蛋白上。可增加一些修復酶的活性，如連接酶。2. 轉錄修復偶聯：轉錄時，若模板鏈損傷，則轉錄暫停，

16、轉錄因子TFIIS使聚合酶退回，CSA/CSB及TFIIE召集修復。若DNA雙鏈損傷，則模板鏈優先修復。第三節 逆轉錄生成DNA 一、逆轉錄酶含兩個亞基，a亞基是b亞基水解產生的。含鋅。要求有模板和不少于四個核苷酸的引物，由5'向3'合成DNA。真核生物的信使RNA加入寡聚dT后可作為模板。此酶有多種功能，可先合成DNARNA雜合分子，再水解RNA（RNA酶H活力），然后復制其互補鏈，形成雙鏈DNA。二、逆轉錄過程 以前任宿主的tRNA為引物,為復制末端,需要借助末端重復結構進行"跳躍"。三、意義（一）逆轉錄與細胞惡性轉化有關，為腫瘤的研究和防治提供了重要線

17、索。艾滋病、乙肝等也有逆轉錄過程。（二）逆轉錄病毒經過改造，可作為信息載體，用于腫瘤和遺傳疾病的基因治療。 真核生物的基因組中多含逆假基因，可能是信使RNA經逆轉錄而整合到基因組中的。所以真核生物正常細胞也存在逆轉錄過程 本 章 名 詞 解 釋 半保留復制（semiconservative replication）：DNA復制的一種方式。每條鏈都可用作合成互補鏈的模板，合成出兩分子的雙鏈DNA，每個分子都是由一條親代鏈和一條新合成的鏈組成。復制叉（replication fork）：Y字型結構，在復制叉處作為模板的雙鏈DNA解旋，同是合成新的DNA鏈。DNA聚合酶（DNA polymerase

18、）：以DNA為模板，催化核苷酸殘基加到已存在的聚核苷酸3末端反應的酶。某些DNA聚全酶具有外切核酸酶的活性，可用來校正新合成的核苷酸的序列。Klenow片段（Klenow fragment）：E.coli DNA聚合酶I經部分水解生成的C末端605個氨基酸殘基片段。該片段保留了DNA聚合酶I的5-3聚合酶和3-5外切酶活性，但缺少完整酶的5-3外切酶活性。前導鏈（leading strand）:與復制叉移動的方向一致，通過連續的5-3聚合合成的新的DNA鏈。滯后鏈（lagging strand）：與復制叉移動的方向相反，通過不連續的5-3聚合合成的新的DNA鏈。岡崎片段（Okazaki fra

19、gment）：相對比較短的DNA鏈（大約1000核苷酸殘基），是在DNA的滯后鏈的不連續合成期間生成的片段，這是Reiji Okazaki在DNA合成實驗中添加放射性的脫氧核苷酸前體觀察到的。引發體（primosome）：一種多蛋白復合體，E.coli中的引發體包括催化DNA滯后鏈不連續DNA合成所必需的，短的RNA引物合成的引發酶，解旋酶。復制體（replisome）：一種多蛋白復合體，包含DNA聚合酶，引發酶，解旋酶，單鏈結合蛋白和其它輔助因子。復制體位于每個復制叉處進行細菌染色體DNA復制的聚合反應。單鏈結合蛋白（SSB）：一種與單鏈DNA結合緊密的蛋白，它的結構可以防止復制叉處單鏈DN

20、A本身重新折疊回雙鏈區。滾環復制（rolling-circle replication）：復制環狀DNA的一種模式，在該模式中，DNA聚合酶結合在一個缺口鏈的3端繞環合成與模板鏈互補的DNA，每一輪都是新合成的DNA取代前一輪合成的DNA。逆轉錄酶（reverse transcriptase）：一種催化以RNA為模板合成DNA的DNA聚合酶，具有RNA指導的DNA合成，水解RNA和DNA指導的DNA合成的酶活性。互補NDA（cDNA）：通過逆轉錄酶由mRNA模板合成的雙鏈DNA。聚合酶鏈式反應（PCR）：擴增樣品中的DNA量和富集眾多DNA分子中的一個特定的DNA序列的一種技術。在該反應中，使

21、用與目的DNA序列互補的寡核苷酸作為引物，進行多輪的DNA合成。其中包括DNA變性，引物退火和在Tap DNA聚合酶催化下的DNA合成。直接修復（direct repair）：是通過一種可連續掃描DNA，識別出損傷部位的蛋白質，將損傷部位直接修復的方法。該修復方法不用切斷DNA或切除堿基。切除修復（excision repair）：通過切除-修復內切酶使DNA損傷消除的修復方法。一般是切除損傷區，然后在DNA聚合酶的作用下，以露出的單鏈為模板合成新的互補鏈，最后用連接酶將缺口連接起來。錯配修復（mismatch repair）：在含有錯配堿基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢復的修復方式。這種

22、修復方式的過程是：識別出下正確地鏈，切除掉不正確鏈的部分，然后通過DNA聚合酶和DNA連接酶的作用，合成正確配對的雙鏈DNA。 遺傳學中心法則（genetic central dogma）：描述從一個基因到相應蛋白質的信息流的途徑。遺傳信息貯存在DNA中，DNA被復制傳給子代細胞，信息被拷貝或由DNA轉錄成RNA，然后RNA翻譯成多肽。不過，由于逆轉錄酶的反應，也可以以RNA為模板合成DNA。轉錄（transcription）：在由RNA聚合酶和輔助因子組成的轉錄復合物的催化下，從雙鏈DNA分子中拷貝生物信息生成一條RNA鏈的過程。模板鏈（template strand）：可作為模板轉錄為RN

23、A的那條鏈該鏈與轉錄的RNA堿基互補（A-U，G-C）。在轉錄過程中,RNA聚合酶與模板鏈結合，并沿著模板鏈的35方向移動，按照53方向催化RNA的合成。編碼鏈（coding strand）：雙鏈DNA中，不能進行轉錄的那一條DNA鏈，該鏈的核苷酸序列與轉錄生成的RNA的序列一致（在RNA中是以U取代了DNA中的T）。核心酶（core enzyme）：大腸桿菌的RNA聚合酶全酶由5個亞基組成（2，），沒有基的酶叫核心酶。核心酶只能使已開始合成的RNA鏈延長，但不具有起始合成RNA的能力，必須加入基才表現出全部聚合酶的活性。RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一條DNA鏈或RNA為模

24、板催化由核苷-5-三磷酸合成RNA的酶。啟動子（promoter）：在DNA分子中，RNA聚合酶能夠結合并導致轉錄起始的序列。內含子（intron）：在轉錄后的加工中，從最初的轉錄產物除去的內部的核苷酸序列。術語內含子也指編碼相應RNA外顯子的DNA中的區域。外顯子（exon）：既存在于最初的轉錄產物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。術語外顯子也指編碼相應RNA內含子的DNA中的區域。終止因子（termination factor）：協助RNA聚合酶識別終止信號的的輔助因子（蛋白質）。核酶（ribozyme）：具有像酶那樣催化功能的RNA分子。剪接體（spliceosome）:大的蛋

25、白質-RNA復合體，它催化內含子從mRNA前體中除去的反應。RNA加工過程（RNA processing）：將一個RNA原初轉錄產物轉換成成熟RNA分子的反應過程。加工包括從原初產物中刪除一些核苷酸，添加一些基因沒有編碼的核苷酸和對那些堿基進行共介修飾。RNA剪接（RNA splicing）：從DNA模板鏈轉錄出的最初轉錄產物中除去內含子，并將外顯子連接起來形成一個連續的RNA分子的過程。 翻譯（translation）：在蛋白質合成期間，將存在于mRNA上代表一個多肽的核苷酸殘基序列轉換為多肽鏈氨基酸殘基序列的過程。遺傳密碼（genetic code）：核酸中的核苷酸殘基序列與蛋白質中的氨基

26、酸殘基序列之間的對應關系。；連續的3個核苷酸殘基序列為一個密碼子，特指一個氨基酸。標準的遺傳密碼是由64個密碼子組成的，幾乎為所有生物通用。起始密碼子（iniation codon）：指定蛋白質合成起始位點的密碼子。最常見的起始密碼子是蛋氨酸密碼：AUG終止密碼子（termination codon）：任何tRNA分子都不能正常識別的，但可被特殊的蛋白結合并引起新合成的肽鏈從翻譯機器上釋放的密碼子。存在三個終止密碼子：UAG ,UAA和UGA。密碼子（condon）：mRNA（或DNA）上的三聯體核苷酸殘基序列，該序列編碼著一個指定的氨基酸 ，tRNA 的反密碼子與mRNA的密碼子互補。反密碼子（anticodon）：tRNA分子的反密碼子環上的三聯體核苷酸殘基序列。在翻譯期間，反密碼子與mRNA中的互補密碼子結合。簡并密碼子（degenerate codon）：也稱為同義密碼子。是指編碼相同的氨基酸的幾個不同的密碼子。氨基酸臂（amino arm）：也稱為接納莖。tRNA分子中靠近3端的核苷酸序列和5端的