1、實驗一農桿菌感受態細胞的制備目的及要求了解和掌握農桿菌感受態細胞制備的原理和方法。實驗原理在利用根癌農桿菌介導的基因轉化中，首先要獲得含有目的基因的農桿菌工程菌株。在基因工程操作中，感受態細胞的制備和質粒的轉化是一項基本技術。感受態是細菌細胞具有的能夠接受外源DNA勺一種特殊生理狀態。農桿菌的感受態可用CaCl2處理而誘導產生。將正在生長的農桿菌細胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0c下處理便會使細菌細胞膜的透性發生改變，此時的細胞呈現出感受態。制備好的農桿菌感受態細胞迅速冷凍于-70C可保存相當一段時間而不會對其轉化效率有太大的影響。實驗儀器、材料和試劑一、儀器：超凈工作臺，恒溫搖床，冷凍高速

2、離心機，高壓滅菌鍋，冰箱，-70C超低溫冰柜，分光光度計，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進樣器及吸頭。以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120c,15分鐘。二、材料：土壤農桿菌LBA4404菌株或其它農桿菌菌株三、試劑：YEB夜體培養基（1L）:酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白陳5g,蔗糖5g,MgSO-7H2O0.5g,pH7.0,高壓滅菌。利福平（Rif）儲液：50mg/ml20mMCaGl,高壓滅菌。實驗步驟1、挑取根癌農桿菌LBA440必菌落于3ml的YEB1體培養基（含Rif50mg/l）中，28c振蕩培養過夜；2、取過夜培養菌液1ml接

3、種于50mlYEB（Rif50mg/l）液體培養基中，28c振蕩培養至OD00為0.5;3、取2ml菌液，13000rpm,離心30sec,棄上清；4、加入1000d20mMCaClz,使農桿菌細胞充分懸浮，冰浴30min；5、13000rpm,離心30sec,棄上清，置于冰上，加入500M預冷的20mMCaCb,充分懸浮細胞，冰浴中保存，24hr內使用，或液氮中速凍1min,置-70C保存備用。實驗二質粒DNA1接導入農桿菌目的及要求了解和掌握質粒DNA專化農桿菌細胞的原理和方法，獲得能用于植物轉化的工程菌。實驗原理在低溫下，外源DNA（質粒）可吸附到感受態細胞表面，誘導細胞吸收DNA（加入

4、熱激原理）轉化了質粒DNA勺農桿菌隨后28c恢復培養，可使質粒上攜帶的編碼抗生素的抗性基因得到表達，因此，轉化了質粒的農桿菌細胞可在含有相應抗生素的培養基上生長，而沒有轉化的細胞則無法生長。植物真核表達載體pCAMBIA1300fl譜實驗儀器、材料和試劑一、儀器：超凈工作臺，恒溫搖床，培養箱，臺式離心機，水浴鍋，高壓滅菌鍋，-70C超低溫冰箱，培養皿，微量進樣器及吸頭。材料：根癌農桿菌LBA4404（或EHA105感受態細胞，質粒pCAMBAI1300+SPR植物表達載體二、試劑：液氮YEB夜體培養基（1L）:酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白陳5g,蔗糖5g,MgSO7Ho0.5g,pH7.0

5、,高壓滅菌。YEB固體培養基：每升YEB液體培養基加15g瓊脂粉，高壓滅菌。卡那霉素（Kan）儲液：50mg/ml利福平（Rif）儲液：50mg/mlYEB固體培養基平板（Kan抗性）：滅菌后的YEB固體培養基待其溫度降至50c時加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）,至終濃度分別為100聞/ml和50皿ml,混勻后立即倒入培養皿，凝固后4c倒置保存。實驗步驟1、在200M感受態細胞中加入26d質粒（pBI121）DNA冰浴5min,液氮中速凍5min；2、迅速轉入37c水浴中，熱激5min；3、加入1mlYEB液體培養基，28c慢速振蕩培養24小時；4、3000rpm離心4min,去一部分

6、上清，留取200M菌液涂布于含有50國/mlKan和50©mlRif的YEB平板；5、放置約0.5h,待水份干后，28c培養約24小時至長出菌落。實驗三農桿菌轉化子的鑒定目的及要求掌握農桿菌質粒DNA勺提取方法。將從農桿菌提取的質粒與對照質粒同時電泳，通過比較確定獲得了農桿菌轉化子。實驗原理經改造的Ti質粒(只含有幫助T-DNA跳到植物染色體上的Vir區)存在于農桿菌工程菌株中，含有T-DNA的雙元載體(BinoryVectors)完成重組后可以在大腸桿菌中擴增，再轉入農桿菌中。從抗性培養基上篩選得到的農桿菌轉化子中應攜帶轉入的重組質粒，而對照菌株則沒有。堿裂解法是一種應用最為廣泛的

7、質粒DNAI®取方法，該法用于從小量培養物中抽提質粒DNA比較方便、省時，提取的DN頌量較高，可用于DNA勺酶切、PCF©至測序。提取質粒DNA1基于染色體DNAW質粒DNA勺變性與復性的差異而使其分離。當細胞在NaOH和SDS容液中裂解時，在pH高達12.6的堿性條件下，蛋白質和染色體DN儂生變性，染色體DNA勺氫鍵斷裂、雙螺旋結構解開，而質粒DNAS大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當加入中和液醋酸鉀或醋酸鈉高鹽緩沖液時，質粒DNAR復原來的構型，而染色體DNA能復性，形成纏繞的網狀2構，通過離心，染色體DNA蛋白質-SDS復合物隨細胞

8、碎片等沉淀下來，質粒DNAU留在上清中。實驗儀器、材料和試劑一、儀器：臺式高速離心機，高壓滅菌鍋，恒溫搖床，恒溫水浴，電泳儀及電泳槽，紫外燈，加樣器(pipettor)，小離心管(eppendorftube),吸頭(tip),三角瓶，牙簽。二、材料：含質粒的農桿菌LBA4404或EHA105，農桿菌LBA4404或EHA105三、試劑：YEB夜體培養基(1L):酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白陳5g,蔗糖5g,MgSO-7H2O0.5g,pH7.0,高壓滅菌。溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0),高壓滅菌(6.895

9、X104Pa),4c保存溶液H:0.2mol/LNaOH,1%SDS先分別配成濃度0.4MNaOH(滅菌)及2%SDS,用前等體積混合。溶液出：3mol/LNaAc/KAc(pH4.8)105mol/LNaAc/KAc60ml(滅菌)HAc11.5mlHO28.5ml(滅菌)，三者混合EB:貯液濃度為10mg/mL工作濃度為0.5聞/mlTAE40mmol/LTris-HAc,2mmol/LEDTApH8.0,Tris飽和酚、氯仿、無水乙醇、RNaseA實驗步驟1、質粒DNA勺提取(1)挑取一個單菌落接種于3ml含相應抗生素的YEB(50mg/LKnj)液體培養基中，28c劇烈振蕩過夜；(2)

10、收集1.5ml過夜培養物于1.5ml離心管中，10000rpm離心30sec收集菌體，盡可能除盡培養基；(3)向細胞沉淀中加入100d預冷的溶液I,劇烈振蕩，使菌體充分懸浮；(4)加入200膜溶液H,立即溫和顛倒離心管4-10次，避免劇烈振蕩；(5)加入150屋溶液田，溫和顛倒離心管4-10次，將離心管置冰浴5min；(6)于室溫12000g離心15min,將上清液轉入新的離心管中(盡量避免吸取沉淀)；(7)加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻；(8)12000g離心10min,棄上清液，加入400仙l70%J享,12000g離心8min,棄上清，在真空抽干或在超凈工作臺中吹干；(9)加入10M

11、含20閨/mlRNaseA的TE或重蒸水溶解DNA37°C溫育30min；(10)-20C保存。2、用瓊脂糖電泳檢測質粒DNA(或用PCRa行檢測)用1XTAE配制0.8%的瓊脂糖凝膠，取所提取的質粒DNA容7取2-5pl進行電泳，50-100V約0.5-1hr,紫外燈下觀察結果。實驗四煙草遺傳轉化實驗實驗目的與意義煙草是遺傳轉化的模式植物，已經建立了一套完善的轉化再生體系。本實驗以煙草為實驗材料，使同學們了解根癌農桿菌介導法的基本原理和一般步驟，掌握遺傳轉化的基本操作技術。實驗器材搖床、超凈工作臺、冰箱、移液搶、銀子、手術刀、打孔器、酒精燈、棉球、培養皿、三角瓶、濾紙、牛皮紙、牙簽

12、。實驗藥品MSW養基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、瓊脂、蔗糖、卡那霉素、竣卞青霉素、無菌水、6-BA、NAA0.1%升汞、70%.醇。煙草愈傷誘導或分化培養基：MSP6-BA(1.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)煙草生根培養基：MS+NAA(0.1mg/L)煙草選擇培養基：M濟6-BA(1.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)+75mg/LKm+500mg/L竣卞青霉素(Cb)實驗步驟1 .受體材料的準備與預培養(1)取自田間栽培煙草植株，用蒸儲水沖洗1遍后，以70%L醇清洗45s,再以0.1%的升汞消毒6-8min,無菌水沖洗5遍，無菌濾紙吸干水分。(2)用滅過菌的打孔器將無菌煙

13、草葉片鑿成6mmi勺葉盤(或用手術刀切成510mnj!r形葉片。(3)將葉盤或葉片接種在煙草愈傷組織誘導或分化培養基上進行預培養，預培養23天，材料切口處剛剛開始彭大時備用。2 .根癌農桿菌培養(1)從平板上挑取單菌落，接種到20mLW加相應抗生素(卡那霉素)的YEB液體培養基中，在恒溫搖床上，于28c下以180r/min培養至。詼為0.60.8(約需17h)。(2)。聯0為0.60.8的菌液，按1%2%j比例，轉入新配制的無抗生素的YEB液體培養基中，可同時加入100500叩ol/L的乙酰丁香酮。在上述相同的條件下再培養6h左右，待。瓦為0.20.5時即可用于轉化。3 .浸染在超凈工作臺上，將菌液倒入無菌三角瓶中，從培養瓶中取出預培養過的外植體，放入菌液中，浸泡適當時間(530min)。取出外植體置于無菌濾紙上吸去附著的菌液。4 .共培養將浸染過的外植體接種在煙草愈傷組織誘導或分化培養基上，在28C暗培養條件下共培養24天。5 .選擇培養將經過共培養的外植體移到加有選擇壓的煙草愈傷組織誘導或分化培養基(附加500mg/L的竣葦青霉素，抑制根癌農標菌生長)上，在光照為2000100001X、25c條件下進行選擇培養。6 .繼代選擇培養選擇培養2-3周后，外植體的轉化細胞將分化出抗性不定芽或產生抗性愈傷組織，將這些抗性材料轉入相相應的選擇培養基中進行繼