1、一一、蛋白質的理化性質蛋白質的理化性質 蛋白質的膠體性質 蛋白質的兩性電離蛋白質分子顆粒大小1100nm之間,屬膠體顆粒范圍蛋白質的膠體原因： 表面形成水化層表面形成水化層表面同種電荷的斥力表面同種電荷的斥力蛋白質的膠體性質在溶液中能形成穩定的膠體當破壞了維持蛋白質膠體穩定的因素甚至蛋白質的構象時，蛋白質就會從溶液中析出，這種現象稱為蛋白質的沉淀(一) 蛋白質的沉淀概念:應用: :(1) 蛋白質分離純化 (2) 解毒 (3) 臨床檢驗 蛋白質膠體性質與蛋白質沉淀蛋白質膠體性質與蛋白質沉淀1 1、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）；、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）； 2 2、酸堿（等電點沉淀）；、酸堿（等電

2、點沉淀）； 3 3、有機溶劑沉淀；、有機溶劑沉淀； 4 4、重金屬鹽類沉淀；、重金屬鹽類沉淀；5 5、生物堿試劑沉淀、生物堿試劑沉淀6 6、加熱變性沉淀、加熱變性沉淀(1) 鹽析法( salting out) 常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等 使蛋白質沉淀的方法概念：向蛋白質溶液中加入大量中性鹽使蛋白質沉 淀稱為鹽析特點：不破壞蛋白質的構象，蛋白質不發生變性 作用原理: 鹽離子與水親和力極強，奪去蛋白質的 水化層，減少分子間靜電斥力(2) 有機溶劑沉淀法 注意事項: 必須在低溫下操作 盡量縮短處理的時間 及時將蛋白質中殘存的有機溶劑除去 缺點：常會使蛋白質變性常會使蛋白質變性 原理: 使

3、蛋白質脫去水化層,又能降低溶液的介電 常數使蛋白質表面電荷減少，導致蛋白質分 子聚集而沉淀 常用有機溶劑：甲醇、乙醇、丙酮 (3) 重金屬鹽沉淀法 若溶液pH大于蛋白質的pI，沉淀更易發生 缺點：此法常使蛋白質變性失活 原理: 重金屬離子如Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+ 等帶有正電荷，能與蛋白質分子中帶負 電的基團結合，生成不溶性的重金屬蛋 白鹽而沉淀(4) 生物堿試劑和某些酸類沉淀法 缺點：常引起蛋白質變性原理: 生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等)，某 些酸類(主要是指三氯醋酸、磺酰水楊酸和 硝酸等)，與帶正電的蛋白質 結合生成不溶 性的鹽而沉淀 注意事項: 反應溶液的pHpI，確保

4、蛋白質以陽離子 形式存在等電點沉淀：pH=pI時引起蛋白質的沉淀(二) 蛋白質的凝固概念：變性蛋白質互相凝聚或互相穿插在一起的 現象稱蛋白質的凝固，凝固作用本質上是 蛋白質變性后進一步發展的不可逆結果如加熱可使蛋白質變為不能再溶解的凝塊如加熱可使蛋白質變為不能再溶解的凝塊超濾：利用壓力或離心力強行使水和小分子雜質通 過超濾膜(一種半透膜)除去，而蛋白質留在 膜上，稱為超過濾透析：將蛋白質溶液放在半透膜的袋內，置于流 動的適當的緩沖液（如純水）中，小分子 雜質（如硫酸銨、氧化鈉等）從袋中透出， 而蛋白質保留于袋中從而將蛋白質純化（三）透析和超濾透析工作圖半透膜原理磁力攪拌器透析袋超濾工作圖(四)

5、 電 泳 概念：帶電顆粒在電場中向著所帶電荷相反方向 移動的現象原理：不同的蛋白質的因結構、形狀和帶電量的 不同而有不同的泳動速度，從而達到分析 和分離蛋白質的目的應用：電泳技術是生化常用分析技術之一 (四) 電 泳 分類：自由界面電泳：蛋白質溶于緩沖液中進行電泳蛋白質溶于緩沖液中進行電泳區帶電泳：將蛋白質溶液點在浸了緩沖液的支持物上進將蛋白質溶液點在浸了緩沖液的支持物上進 行電泳，不同組分形成帶狀區域行電泳，不同組分形成帶狀區域 - - 紙電泳：紙電泳：用濾紙作為支持物用濾紙作為支持物 - - 凝膠電泳：凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物

6、支持物圓盤電泳：圓盤電泳：玻璃管中進行的凝膠電泳玻璃管中進行的凝膠電泳平板電泳：平板電泳：在鋪有凝膠的玻板上進行的電泳在鋪有凝膠的玻板上進行的電泳+ +圓盤電泳圓盤電泳平板電泳平板電泳(四) 電 泳 電泳的應用：蛋白質分子量的測定：SDS-PAGE, Native-PAGE蛋白質等電點的測定： Isoelectric Focusing 蛋白質組學研究：雙向電泳 樣品處理樣品處理染色染色電泳電泳蛋白質分子量的測定（ SDS-PAGE ）(四) 電 泳 (四) 電 泳 蛋白質等電點的測定等電聚焦等電聚焦第二相電泳第二相電泳染色染色 主要用于蛋白質組學研究蛋白質雙向電泳(2D-PAGE)(四) 電

7、泳 ( (五五) ) 層層 析析原理：溶質在互不相溶的兩相之間分配行為存在差 別，從而導致移動速度的不同 離子交換色譜 (ion exchange chromatography) 疏水作用色譜 (hydrophobic chromatography) 凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography) 親和色譜 (affinity chromatography) 金屬螯和色譜 (metal chelating chromatography) 離子交換色離子交換色譜譜原理：根據離子交換樹脂對各種離子的親和力不同 而達到分離的目的，大分子因與樹脂親和力 不同，以不同牢度被吸

8、附于離子交換劑，通 過改變離子強度或(和)pH使大分子從樹脂上 先后被洗脫 分為：陰離子交換基：DEAE（二乙胺乙基） QAE（季銨乙基） 陽離子交換基： CM（羧甲基） P（磷酸基） SP（磺丙基）實驗條件的選擇實驗條件的選擇2468101214等電點等電點-體系體系pH蛋白質帶負電荷蛋白質帶負電荷+蛋白質帶正電荷蛋白質帶正電荷 根據蛋白的性質選擇適宜的pH值和緩沖體系0實驗條件的選擇實驗條件的選擇P P+ +P P0 0P P- -P P2-2-P P3-3-P P3-3-P P2-2-P P- -P P+ +P P0 0P P3-3-P P2-2-P P- -P P+ +P P0 0 根

9、據蛋白的性質選擇合適的洗脫條件疏水作用色疏水作用色譜譜原理：根據蛋白質與吸附劑之間的弱疏水性 作用的差別進行蛋白質的分步洗脫 各種凝膠過濾介質經偶聯疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑 常用的疏水性配基： 苯基、短鏈烷基C3C8）、 烷氨基、聚乙二醇和聚醚 疏水吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應根據配基的疏水性而異，過小則疏水性吸附作用不足，過大則洗脫困難 疏水作用色譜的洗脫一般采用降低緩沖液中的鹽濃度來 洗脫蛋白 也可以采用加入少量的有機溶劑來洗脫，如反相色譜疏水作用色疏水作用色譜譜Fraction凝膠過濾色凝膠過濾色譜譜概念： 當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的

10、層析柱時，根據 它們分子大小不同而進行分離的技術，又可稱作排 阻色譜或者分子篩色譜原理： 凝膠顆粒內部具有多孔網狀結構，被分離的混合物 流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠 孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被 洗脫出來；比網孔小的分子能不同程度的自由出入 凝膠孔內外，在柱內經過的路程較長移動速度較 慢，最后被洗脫出來常用凝膠：交聯葡聚糖凝膠（Sephadex) 、聚丙烯酰胺凝膠、 瓊脂糖凝膠（ Sepharose）凝膠過濾色譜的洗脫凝膠過濾色譜的洗脫凝膠過濾色譜的應凝膠過濾色譜的應用用生物大分子的分離純化分子量的測定分級分離溶液濃縮平衡常數的測定細胞及顆粒的分離親和色親和色譜

11、譜 原理：利用化學方法將可與待分離物質可逆性特異 結合的化合物（稱配體）連接到固相載體 上，當待提純的生物大分子通過此層析柱 時，可以與載體上的配體特異的結合而留在 柱上，其他物質則不能結合，然后用適當方 法使生物大分子從配體上洗脫下來，從而達 到分離提純的目的 特點：純化效率高，提純度可達幾千倍配體配體蛋白質蛋白質蛋白質和配體復蛋白質和配體復合物合物交聯試劑交聯試劑載體載體配體配體載體與配體載體與配體交聯體交聯體雜質雜質雜質雜質游離配游離配體體洗脫結合耦聯作用機理親和色譜的洗脫親和色譜的應用親和色譜的應用 抗原和抗體 激素和受體蛋白 凝集素和多糖(糖蛋白) 酶與輔酶(或產物、抑制劑) 核酸與

12、互補鏈（或核酸多聚酶、結合蛋白） 細胞與細胞表面特異蛋白（或凝集素）金屬螯合色譜金屬螯合色譜 原理：利用固定相載體上偶聯的亞胺基乙二酸為配 基與二價金屬離子發生螯合作用，結合在固 定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有 的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發生 特異螯合作用而進行分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein特點： 體系復雜: 含量低、組分多、干擾大 水溶液體系： 接近生理狀態，盡量避免 使用有機溶劑 低溫操作： 防止蛋白變性和失活 必要的添加劑： 蛋白酶抑制劑、還原劑 專業的儀器設備：制備型 蛋白質分離、純化和鑒定蛋白質分離、純化和鑒定蛋白質分離、純化和鑒定蛋白質分

13、離、純化和鑒定 蛋白質分離提純的原則： 純度、活性和產量 蛋白質分離提純的一般步驟： 破碎細胞 蛋白提取 粗細分級 鑒定 分離純化技術 綜合運用各種方法和技術蛋白質分離純化方蛋白質分離純化方法法 按蛋白質性質分類 溶解度： 沉淀(鹽析、有機溶劑、等電點) 分子大小、形狀：離心、超濾、透析、 凝膠過濾層析 分子大小、電荷：電泳、離子交換層析 分子間作用力： 親和層析、金屬鰲合層析、 疏水作用層析蛋白質分離純化方蛋白質分離純化方法法 按純化方法分類 沉淀：鹽析、有機溶劑、等電點 電泳：凝膠電泳、等電聚焦 離心：常規、密度梯度 過濾：超濾、透析 層析：離子交換、凝膠過濾、親和層析、 疏水作用蛋白分離

14、純化的目的蛋白分離純化的目的 活力的生化分析 蛋白的翻譯后修飾（Post-translational modifications) 相互作用和蛋白的裝配 (Interactions and assembly) 三維結構 (3-dimensional structure) 生物功能分析 (Analysis of biological function) 藥物開發 (Drug development) 從有機體中獲得純的蛋白要盡可能的用較少 的步驟，盡可能少的丟失活力分離純化策略分離純化策略 細胞與組織(材料來源有限，但是蛋白是天然的 狀態) 折疊均一, 可溶（主要指非膜蛋白） 可通過差速離心分離

15、細胞組份 純化可用色譜方法（chromatography）從哪兒開始從哪兒開始 ？ cDNA克隆（為目前蛋白來源的主要方法，但是蛋白易形成包涵體（inclusion body） 重組蛋白基因在大腸桿菌、昆蟲細胞、 哺 乳動物細胞或植物細胞中表達 也用差速離心及色譜方法純化 在重組的蛋白中可以添加Tags以便于純化從哪兒開始從哪兒開始 ？破碎細胞破碎細胞上上清清沉淀沉淀( (丟棄丟棄) )離心離心細胞裂解細胞裂解細胞裂解物細胞裂解物, ,蛋白蛋白 核酸及小分子核酸及小分子多步純化多步純化(包括鹽析包括鹽析、過濾過濾、層析等層析等)不需要的分子不需要的分子純蛋白純蛋白從組織細胞中進行蛋白分離流程圖

16、蛋白質粗分離 I I：從組織細胞 - 提 取 哪個物種合適？ 豐度及活力特點 大小，成本及物種的可獲得狀況 哪個組織合適 ? 對于特定的細胞哪個組織豐富 組織中哪種細胞中有這類蛋白 純化過程中的作為應該與特定的方案相關 非常有益的信息 大小 組成影響組織提取的因影響組織提取的因素素 緩沖液（ Buffer ） 離子強度（ Inoic strength ） 金屬離子螯合劑（ Metal ion chelators） 還原劑（ Reducing agents ） 蛋白酶抑制劑（ Protease inhibitors ） 溫度（ Temperature ） 組織的破碎方式（ Tissue disr

17、uption ）組織破碎組織破碎(Tissue disruption) 除去不要的組織 攪碎 勻漿（homogenization） 研磨 (vessel for extraction)細胞破碎細胞破碎(Cell Disruption) 化學破碎: 堿、有機溶劑、去污劑 酶學手段: 溶菌酶、葡聚糖酶、幾丁質酶 (常適用于含細胞壁的細菌及植物細胞) 物理方法: 滲透壓震蕩、凍溶 機械方法: 超聲、勻漿、濕磨、壓力初步純初步純化化 - 熱變性熱變性 不同的蛋白有 不同的熱穩定 性，且有些蛋 白可以在熱變 性以后再復性 鈣調蛋白是能 通過熱變性而 獲得純化的一 個很好例子天然結構天然結構(%)一般蛋白

18、一般蛋白0 () 100鈣調蛋白鈣調蛋白初步純初步純化化 - 沉淀沉淀 鹽析：減少蛋白質表面的水化層 硫酸銨、尿素 等電點沉淀：降低蛋白質分子的荷電狀態 改變體系pH值至pI附近 有機溶劑沉淀：減少蛋白表面水化層，增加疏水性 降低水的介電常數，降低蛋白溶解性 甲醇、乙醇、丙酮、聚乙二醇蛋白質粗分離蛋白質粗分離 IIII：表達蛋表達蛋白白 重組基因的表達 可獲得大量的蛋白 可進行突變 - structure/activity studies 可引入具有光譜特性的物質 可引入穩定同位素 15N 、 2H 、 13C (for NMR) 蛋白融合體 便于純化及免疫學研究菌體菌體細胞破碎細胞破碎總蛋白

19、總蛋白純蛋白純蛋白性質分析性質分析培養介質培養介質細胞碎片細胞碎片非目的蛋白非目的蛋白離心、過濾物理、化學、酶學方法多步純化步驟重組蛋白分離純化蛋白質的精細純化 基本策略： 綜合運用各種層析技術，尤其是特異性比較高的方法，如親和層析，可以大大減少純化的步驟和工作量，提高產品的純度蛋白質的鑒定蛋白質的鑒定定性分析： 分子量: 凝膠電泳、質譜 (可同時鑒定分子量和純度) 活性: 根據蛋白質的功能選用不同的活 性檢測方法SDS-PAGE測定蛋白質的分子量和純度 MALDI-TOF-MS測定蛋白質的分子量和純度 080001600024000320004000048000560000400800120

20、0160053232.7635380.8017697.728849.63m/Z蛋白質的鑒定 定量分析： Folin-酚試劑法（Lowry法）： A500nm 靈敏度高、是常用的方法 考馬斯亮藍染色法（Bradford法）：A595nm 簡單迅速、干擾少、靈敏度高(1g) 紫外檢測法：濃度(mg/mL)= 1.45A280nm-0.74A260nm 簡單快速、不破壞樣品、準確度低常用儀器作業題： 已知某蛋白的分子量約為17 kDa，等電點3.94.1，它能耐一定的高溫，在90 C加熱34 min后仍然能夠保持80%的活性。該蛋白含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結合后可以暴露它的疏水基團。該蛋白的

21、作用是作為生物體內酶的激活劑。請設計一個從腦組織中提取和分離純化該蛋白的實驗方案，要求寫出具體的步驟和理由，以及檢測方法。(1) 鹽析法( salting out) 常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等 使蛋白質沉淀的方法概念：向蛋白質溶液中加入大量中性鹽使蛋白質沉 淀稱為鹽析特點：不破壞蛋白質的構象，蛋白質不發生變性 作用原理: 鹽離子與水親和力極強，奪去蛋白質的 水化層，減少分子間靜電斥力(二) 蛋白質的凝固概念：變性蛋白質互相凝聚或互相穿插在一起的 現象稱蛋白質的凝固，凝固作用本質上是 蛋白質變性后進一步發展的不可逆結果如加熱可使蛋白質變為不能再溶解的凝塊如加熱可使蛋白質變為不能再溶解的凝塊樣品處理樣品處理染色染色電泳電泳蛋白質分子量的