1、表面增強拉曼光譜分析原理及應(yīng)用一、引言二、拉曼光譜基本理論三、拉曼光譜儀器介紹四、表面增強拉曼光譜概述五、表面增強拉曼光譜的應(yīng)用六、前景展望一、引言 用單色光照射透明介質(zhì)（氣體、液體或固體）時，絕大部分的光沿著入射光的方向透過，在透射和反射方向以外會出現(xiàn)光的散射現(xiàn)象。 當激發(fā)光的光子與作為散射中心的光子相互作用時，大部分光子只是改變方向發(fā)生散射，而光的頻率與激發(fā)光的頻率相同，這種散射稱為Rayleigh散射。 約占光散射強度的10-610-9的散射，不僅改變光的傳播方向，而且散射光的頻率不同于激發(fā)光的頻率，這種散射稱為Raman散射。光散射的過程：激光入射到樣品，產(chǎn)生散射光。 散射光彈性散射（

2、頻率不改變-瑞利散射）非彈性散射（頻率改變-拉曼散射）2、拉曼光譜基本理論2.1 拉曼光譜歷史淵源 1923年德國的Smeka理論上預(yù)言了光的非彈性散射 。 1926年印度物理學(xué)家Raman在論文中開始并沒有肯定這種散射是非彈性的,以后的許多次實驗最終證明了這種散射的非彈性,他將這種效應(yīng)稱為“一種新輻射”。 1928年,Raman和Kishnan首先在液體苯中觀察到了這種散射效應(yīng)。此后不久,俄國物理學(xué)家Lardsberg和MandelStam在石英中也發(fā)現(xiàn)了同樣的光散射現(xiàn)象,他們稱之為“聯(lián)合散射光譜”。1928年，Cabanues和Rocard在巴黎也證實了Raman的觀察結(jié)果,Pringsh

3、eim撰文總結(jié)并指出Raman發(fā)現(xiàn)的是一種全新的現(xiàn)象,并建議稱之為Raman效應(yīng), 1930年42歲的Raman為此獲得了諾貝爾物理學(xué)獎,這是亞洲人獲得的第一個諾貝爾科學(xué)獎。 2.2拉曼光譜基本原理 拉曼光譜是單色光束入射光的光子與分子發(fā)生非彈性散射的結(jié)果。在非彈性碰撞過程中，光子與分子之間發(fā)生能量交換，光子不僅改變運動方向，同時光子的一部分能量傳遞給分子，或分子的振動和轉(zhuǎn)動能量傳遞給光子，從而改變了光子的頻率，這種散射過程稱為拉曼散射。 2.3拉曼光譜量子理論瑞利散射：彈性碰撞，無能量交換，僅改變方向。拉曼散射：非彈性碰撞；方向改變，且有能量交換。拉曼散射的兩種能量差A(yù)、E=h(v0 v）產(chǎn)

4、生stokes線：強；基態(tài)分子多B、E=h(v0 v)產(chǎn)生反stokes線：弱 Stokes與反Stokes線的頻率與入射光頻率之差v稱為Raman位移。同一種物質(zhì)分子，隨著入射光頻率的改變，Raman線的頻率也改變，但位移v始終保持不變，故Raman位移與入射光頻率無關(guān)。 RayleighStokesAnti-StokesResonanceRamanFluorescence拉曼光譜研究分子振動和轉(zhuǎn)動模式的機理與紅外光譜的異同點？ 相同點：同屬于分子光譜。兩者都是研究分子振動的重要手段。不同點：一些同核原子對稱結(jié)構(gòu)的官能團(如：- C=C-、-N=N-、-S-S-等)在紅外光譜儀較難檢測的信息

5、，在拉曼光譜儀上卻有較強的反映；而在紅外光譜中有很強吸收峰的不均衡對稱的官能團，在拉曼光譜卻表現(xiàn)很弱。 3、拉曼光譜儀器激光Raman光譜儀激光光源：A、He-Ne激光器，波長632.8nmB、Ar激光器波長514.5nm 488.0nm傅里葉變換-Raman光譜儀光源：Nd-YAG釔鋁石榴石激光器（=1064nm）3.1 儀器結(jié)構(gòu)1、激光光源 根據(jù)所用的材料不同大致可把激光器分為氣體激光器、固體激光器、半導(dǎo)體激光器和燃料激光器等四大類。氣體激光器的類型最多，在拉曼光譜儀中的應(yīng)用也最廣泛。它包括原子氣體激光器、離子氣體激光器、分子氣體激光器以及準分子激光器。固體激光器主要有紅寶石激光器、摻釹的

6、釔鋁石榴石（YAG）激光器、摻釹的玻璃激光器等。這類激光器的特點是輸出功率高，并且體積小又很堅固。其YAG激光器是一種比較有用的固體激光器，其激光波長為1064nm。半導(dǎo)體激光器在所有的激光器中是效率最高、體積最小的一種激光器。 2、外光路系統(tǒng) 外光路系統(tǒng)一般是指在激光器之后、單色器之前的光學(xué)系統(tǒng)，它的作用是為了有效地收集拉曼散射光。在外光路系統(tǒng)中，激光器輸出的激光首先經(jīng)過光柵，以消除激光中可能混有的其它波長的激光以及氣體放電的譜線（若激光無雜線時，可不用此光柵）。純化后的激光經(jīng)棱鏡折光改變光路再由透鏡準確地聚焦在樣品上。樣品所發(fā)出的拉曼散射光再經(jīng)聚光透鏡準確地聚集在單色儀的入射狹縫上。3、樣

7、品池 由于在可見光區(qū)域內(nèi)，拉曼散射不會被玻璃吸收，因此拉曼光譜的一大優(yōu)點是樣品可放在玻璃制成的各種樣品池中，這給樣品的拉曼測試帶來很大便利。樣品池可以根據(jù)實驗要求和樣品的形狀和數(shù)量而設(shè)計成不同的形狀。 4、單色器 經(jīng)樣品散射的光，其絕大部分為Rayleigh散射光，Raman散射光強度僅為Rayleigh散射光強度的10-610-9，散射光由外光路系統(tǒng)收集進入單色儀。單色儀是色散型拉曼光譜儀的心臟部分，它應(yīng)具有雜散光少、色散度高等特點。為了降低Rayleigh散射光對檢測強度較弱的拉曼散射光的影響，通常采用雙單色儀，有時甚至采用三單色儀來進一步降低雜散光，提高分辨率。但光柵的反射率一般小100

8、%，使用多光柵必然要降低光通。5、檢測和記錄系統(tǒng) 激光拉曼光譜儀中一般采用光電倍增管做探測器，由于拉曼散射強度很弱，這就要求光電倍增管要有高的量子效率和盡可能低的熱離子暗電流。近年來，液氮冷卻的CCD型電子偶合器件探測器的使用可大大提高探測器的靈敏度。由探測器輸出的信號必須經(jīng)放大，然后由記錄儀記錄或輸出到計算機上。3.2拉曼光譜技術(shù)優(yōu)越性1、水的拉曼散射強度很微弱,因此拉曼光譜是研究水 溶液中的生物樣品和化學(xué)化合物的理想工具。2、拉曼一次可以同時覆蓋很廣波數(shù)的區(qū)間,可對有機物及無機物等多種物質(zhì)進行分析。相反,若讓紅外光譜覆蓋如此廣闊的區(qū)域則必須改變各種器件的參數(shù),相比較而言程序復(fù)雜不具有通用性

9、。 3、拉曼光譜的譜峰清晰尖銳,適合定量研究以及運用差異分析進行定性研究。在化學(xué)結(jié)構(gòu)分析中,獨立的拉曼區(qū)間的強度和功能集團的數(shù)量相關(guān)。 4、由于激光束的直徑在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常規(guī)拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得到。而且,拉曼顯微鏡物鏡可以將激光束進一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小體積的樣品。 5、利用共振拉曼效應(yīng),可以用來有選擇性地增強大生物分子特個發(fā)色基團的振動,這些發(fā)色基團的拉曼光強能被選擇性地增強1000到10000倍。4、表面增強拉曼光譜概述4.1 SERS的發(fā)現(xiàn) 表面增強拉曼散射現(xiàn)象第一次被觀測到,是在1979年,Fleischman小組在對粗糙化

10、的Ag電極表面的吡啶進行研究時,發(fā)現(xiàn)其具有巨大的拉曼散射現(xiàn)象4。后來直到VanDuyne和Creighion領(lǐng)導(dǎo)的兩個研究小組5,6分別重復(fù)了這個實驗并證實了這一現(xiàn)象。通過計算,這種銀電極表面的吡啶分子的拉曼信號是其水溶液的106倍。這一嶄新的現(xiàn)象被稱之為表面增強拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)。4.2 SERS基本原理 SERS效應(yīng)可以使拉曼信號得到高達幾個數(shù)量級的增強,通常是增強來自分子的信號。SERS中信號的增強主要來自于光與金屬之間的電磁作用。這種作用會通過等離子體共振激發(fā)使得激光場得到極大的增強。要產(chǎn)生這一現(xiàn)象,分子必須吸附在或

11、者非常接近金屬表面(通常最大約為10nm)。SERS的命名,能很好的總結(jié)這一效應(yīng)的要點:Surface(S): SERS是一種表面光譜技術(shù),因此分子必須吸附在(或者很接近)金屬表面。這是對SERS的應(yīng)用來說最主要的一點。必須確保要檢測的分子“貼” 到了金屬基底的表面。Enhanced(E): 信號高達104-107的增強是由金屬基底上的等離子體共振造成的。事實上,等離子體共振是與金屬的電磁輻射作用有關(guān)的一系列效應(yīng)的簡稱。另外，SERS效應(yīng)中,金屬以納米結(jié)構(gòu)的形式出現(xiàn),從金屬溶膠到用納米光刻制或者自組裝制備,形式變化多樣。不同的金屬,要求的粗糙度也不一樣。在可見光范圍內(nèi)，Ag的粗糙度在100nm

12、左右,有較好的增強效果8。而Cu的粗糙度在50nm，在紅外區(qū)增強最明顯9。Raman(R): 這項技術(shù)存在于分子(SERS探針或被分析物)信號的測量。拉曼光譜研究的是非彈性散射,能解析被探測分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)尤其是振動結(jié)構(gòu)。S: 表示scattering或者spectroscopy，當強調(diào)光學(xué)效應(yīng)時,用scattering；當強調(diào)光譜技術(shù)及其應(yīng)用時,用spectroscopy。4.3 SERS機理 為了解釋 SERS 的增強機制，人們提出了不同的理論模型。由于分子的拉曼散射是分子在外電場作用下被極化而產(chǎn)生極化率，交變的極化率在再發(fā)射的過程中，受到分子中原子間振動的影響，從而產(chǎn)生拉曼散射光。散射光的

13、增強可能是由于作用在分子上的局域電場的增加和分子極化率的改變，可以形象地把分子的極化偶極矩看成是電磁效應(yīng)和分子效應(yīng)的乘積。目前學(xué)術(shù)界普遍認同的 SERS 機理主要有物理增強機理和化學(xué)增強機理兩類, 物理增強機制通過局域場和偶極發(fā)射起作用，化學(xué)增強機制通過分子的極化率起作用。物理增加機理 物理類模型致力于闡釋金屬表面局域電場的增強，它認為，具有一定表面粗糙度的類自由電子金屬基底的存在，使得入射光在表面產(chǎn)生的電磁場得到較大的增強，而拉曼散射強度與分子誘導(dǎo)偶極矩 P 的平方成正比，因此極大地增加了吸附在表面的分子產(chǎn)生拉曼散射的幾率，從而提高了檢測到的表面拉曼強度。物理類模型主要包括以下幾種典型模型。

14、A、表面電磁場模型 表面電磁增強模型又可稱為表面等離子體共振模型。該模型認為，在光電場作用下，金屬表面附近的電子會產(chǎn)生疏密振動。因此當粗糙化的襯底材料表面受到光照射時，襯底材料表面的等離子體能被激發(fā)到高的能級，而與光波的電場耦合，并發(fā)生共振，使金屬表面的電場增強，從而產(chǎn)生增強的拉曼散射。 B、天線共振子模型 天線共振子模型是 P.Watcher 教授10在1983年提出的 SERS 增強機制理論模型。該模型認為具有一定粗糙度的金屬表面的顆粒或凸起可看作是有一定形狀，能與光波耦合的天線振子。粗糙金屬表面的突出物或各種微粒可以被看作位于電磁場中的天線振子，它們既可以吸收電磁波，也可以發(fā)射電磁波。當

15、電磁波波長和粒子尺寸之間滿足一定條件時，電磁波在粒子中將發(fā)生共振，此時輻射場最大；同時，吸附在粒子表面上分子的拉曼散射光(也是一種電磁輻射)強度也會受到天線振子的增強，從而產(chǎn)生 SERS 效應(yīng)11。C、表面鏡像場模型 表面鏡象場模型是提出得比較早的電磁增強類模型之一，鏡像場模型假定金屬表面是一面理想的鏡子，吸附分子為振動偶極子，它在金屬內(nèi)產(chǎn)生共軛的電偶極子，以此在表面形成鏡像光電場。入射光與鏡像光電場都對吸附分子的表面拉曼信號起增強作用，再加上表面反射造成兩倍的局域電場增強，可以得到總增強效應(yīng)。D、避雷針效應(yīng) 金屬粗糙過程中產(chǎn)生的表面粒子形狀各不相同，一些粒子或粒子的某些部位曲率半徑非常小，這

16、些顆粒的尖端處具有很強的局部表面電磁場。曲率半徑越小，其表面電場強度越大，從而引起拉曼散射強度的增強。4.3.2 化學(xué)增強機理A、電荷轉(zhuǎn)移模型 電荷轉(zhuǎn)移模型認為13：在適當波長的激光照射下，金屬中的電子被激發(fā)到電荷轉(zhuǎn)移態(tài)上去，這會引起分子原子核的骨架松弛，因為分子在基態(tài)和激發(fā)態(tài)下的平衡位置不同。當電子再回到金屬中時發(fā)射的光子能量就比入射光少了一個振動量子的能量。增強的原因是散射過程同電荷轉(zhuǎn)移態(tài)共振。B、活位模型 活位模型認為：在所有吸附在金屬顆粒表面的分子中，只有當其吸附在金屬顆粒表面某種特殊的位置(活位)的才能產(chǎn)生強的表面增強拉曼信號。 總的來說，物理類模型所涉及的分子與金屬間作用為物理吸附

17、，具有長程效應(yīng)，它的代表為 EM 模型。化學(xué)類模型強調(diào)吸附分子與金屬基底間的吸附，具有短程效應(yīng)，它的代表為 CT 模型。5、SERS應(yīng)用5.1 SERS檢測微量添加物的研究 5.1.1 中成藥中微量西藥成分的研究 中藥的熒光現(xiàn)象很強，而熒光是拉曼散射的“硬傷”，特別是在成分復(fù)雜的中藥中，西藥的光譜信號常常被強熒光遮蓋，常常表現(xiàn)為以上圖譜 。 SERS可以大大降低熒光的干擾，同時將信號放大10的n次方倍。以往關(guān)于SERS的研究，大都限于研究純化合物。因為SERS的高靈敏度SERS 常常作為一種檢測器同其它經(jīng)典方法聯(lián)用來檢測混合物中的各成分或某些成分，常見的聯(lián)用方法有TLC-SERS、HPLC-S

18、ERS和CE-SERS等。在混合物的SERS研究方面，一般是研究同類化合物的共存情況，且各化合物在濃度數(shù)量級上相差不遠。 張雁15等人對表面增強拉曼光譜檢測中成藥中的西藥成分進行了研究。馬來酸羅格列酮和鹽酸苯乙雙胍都是常用的降糖類化學(xué)藥，也是藥品市場上常見的非法添加化學(xué)藥品種。這兩種化學(xué)藥的特點是每日服用量低，即非法添加比低，用傳統(tǒng)HPLC方法檢測消耗時間長。我們用SERS對它們的光譜進行了考察，檢測速度快，結(jié)果準確，且不需對中成藥樣品進行任何分離提取，操作簡便快捷。 馬來酸羅格列酮標準品溶液的 SERS 譜圖（C=0.0003% ） 添加了不同比例的馬來酸羅格列酮的中成藥水溶液的SERS 譜

19、圖（馬來酸羅格列酮添加于中成藥中的比例：a:1%,b:0.8%,c:0.5%,d:0.3%,e:0.1%，f:0% 。 鹽酸苯乙雙胍標準品溶液的 SERS 譜圖（C=0.0003% ） 添加了微量鹽酸苯乙雙胍的中成藥水溶液的 SERS 譜圖（鹽酸苯乙雙胍添加于中成藥中的比例：a:1%,b:0.8%,c:0.5%,d:0.3%,e:0.1%。） 鹽酸苯乙雙胍與馬來酸羅格列酮標準品混合溶液的SERS 譜（C=0.0003%） 兩種西藥添加于中成藥中的比例：a:馬來酸羅格列酮0.5%，鹽酸苯乙雙胍 0.8%；b:馬來酸羅格列酮 0.3%，鹽酸苯乙雙胍 0.5%；c:馬來酸羅格列酮 0.1%，鹽酸苯乙

20、雙胍0.3%。 5.1.2 蘇丹紅的表面增強拉曼光譜 蘇丹紅原料的 SERS 圖譜(C=0.0001%) 添加了 0.05%蘇丹紅的番茄醬的 SERS 實驗初步說明，SERS用于檢測復(fù)雜混合體系中的微量特定成分有其獨特的優(yōu)勢。實驗不需要對復(fù)雜樣品進行任何的前處理及提取分離，可以對其中的微量特定成分進行直接檢測，且檢測靈敏度高。整個實驗過程不需要使用有機試劑，經(jīng)濟、快捷、環(huán)保。5.2 快速檢測牛奶中的三聚氰胺 目前，檢測三聚氰胺的國家標準檢測方法為高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法三種方法為三聚氰胺的檢測方法，檢測定量限分別為 2 mg/kg、0.05 mg/kg 和 0

21、.01mg/kg16。但對牛奶收購、運輸環(huán)節(jié)的三聚氰胺現(xiàn)場快速測定需求，上述技術(shù)存在成本高、檢測周期長等缺陷。現(xiàn)場快速測定三聚氰胺的技術(shù)成為食品安全監(jiān)管部門和生產(chǎn)企業(yè)的需求。 趙宇翔17等人采用便攜式拉曼檢測儀，結(jié)合表面增強試劑技術(shù)，牛奶中三聚氰胺檢測限可達 2.0 mg/L，且重現(xiàn)性良好，樣品前處理簡單，檢測時間短，檢測成本低，設(shè)備操作相對簡捷，適用于食品安全監(jiān)管部門和食品生產(chǎn)企業(yè)。5.2.1 三聚氰胺的表面增強特征光譜圖 含 5mg/L 三聚氰胺的牛奶樣品的表面增強拉曼光譜 5.2.2 靈敏度試驗三聚氰胺梯度濃度對比試驗 樣品編號三聚氰胺濃度（mg/L) 陰性 陽性1234501.02.0

22、5.010.0-(n=15)-(n=15)-(n=0）-(n=0）-(n=0）+(n=0)+(n=0)+(n=15)+(n=15)+(n=15)5.2.3 干擾物質(zhì)和梯度濃度三聚氰胺混合牛奶標準溶液的檢測 10g/L含氮化合物和梯度濃度三聚氰胺混合牛奶標準溶液的檢測結(jié)果見下表，由實驗結(jié)果可見，三個分析人員的實驗測量結(jié)果對 2.0 mg/L 及以上濃度的樣品陽性率達 100 %。 表面增強拉曼光譜快速測定牛奶中的三聚氰胺方法的檢測限為 2.0 mg/L；常見的牛奶中的尿素、亞硝酸鈉等共存物均不干擾檢測，特異性較好。該方法操作簡單，易于掌握，同時可在很短的時間內(nèi)進行檢測。整個操作流程從樣品制備、檢

23、測、到結(jié)果顯示一般可在 10 min 內(nèi)完成，因此尤其適宜于現(xiàn)場篩檢。方法也可適用于食品安全監(jiān)管部門和食品生產(chǎn)企業(yè)現(xiàn)場的三聚氰胺快速測定。5.3 SERS快速檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠 孔雀石綠是一種人工合成的三苯甲烷類堿性染料,自20世紀30年代起就被廣泛用于漁業(yè)生產(chǎn),防治水霉病。研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠易為魚類吸收并代謝為無色孔雀石綠,且孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物均有毒性和致癌性。目前檢測孔雀石綠的方法很多,國家標準檢測方法為高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,檢測定量限分別為2.0g/kg、0.5g/kg。 顧振華18等人采用便攜式拉曼檢測儀,結(jié)合表面增強試劑技術(shù),水產(chǎn)品水樣中孔雀石綠檢測限可達5.0g/L,且重現(xiàn)性良好,樣品前處理簡單,檢測時間短,檢測成本低,設(shè)備操作相對簡捷,適用于食品安全監(jiān)管部門和食品生產(chǎn)企業(yè)。5.3.1 孔雀石綠的表面特征拉曼光譜圖 用表面增強特征拉曼光譜技術(shù)對10g/L孔雀石綠水溶液進行測定,表面增強拉曼光譜顯示432437 cm-1,11661170 cm-1,16131617 cm-1處有孔雀石綠的特征峰,可做孔雀石綠定性檢測的依據(jù)。如432437 cm-1,11661170 cm-1,16131