1、色譜分析法理論基礎色譜分析法理論基礎 色譜法早在色譜法早在19031903年由俄國植物學家年由俄國植物學家分離植物色素時采用。后來分離植物色素時采用。后來不僅用于分離有色物質，還用于分離不僅用于分離有色物質，還用于分離無色物質，并出現了種類繁多的各種無色物質，并出現了種類繁多的各種色譜法。許多氣體、液體和固體樣品色譜法。許多氣體、液體和固體樣品都能找到合適的色譜法進行分離和分都能找到合適的色譜法進行分離和分析。析。 目前色譜法已廣泛應用于許多領域，成為十分重要的目前色譜法已廣泛應用于許多領域，成為十分重要的分離分析手段。但不管屬于哪一類色譜法，其共同的分離分析手段。但不管屬于哪一類色譜法，其共

2、同的基本特點是具備基本特點是具備兩個相：兩個相： 不動的一相，稱一為不動的一相，稱一為固定相固定相； 另一相是攜帶樣品流過固定相的流動體，稱為另一相是攜帶樣品流過固定相的流動體，稱為流動相流動相。 當流動相中樣品混合物經過固定相時，就會與固定相當流動相中樣品混合物經過固定相時，就會與固定相發生作用，由于各組分在性質和結構上的差異，與固發生作用，由于各組分在性質和結構上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推定相相互作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中

3、流出。從而按先后不同的次序從固定相中流出。色譜法分類 1.1.按兩相狀態分類按兩相狀態分類氣體為流動相氣體為流動相的色譜稱為的色譜稱為氣相色譜（氣相色譜（GC),GC),根據固定相是固體吸附根據固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機化合物液劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機化合物液體），又可分為體），又可分為氣固色譜（氣固色譜（GSCGSC）氣液色譜（氣液色譜（GLCGLC）液體為流動相液體為流動相的色譜稱的色譜稱液相色譜（液相色譜（LC),LC),同理，液相色譜亦可分為同理，液相色譜亦可分為液固色譜（液固色譜（LSCLSC）液液色譜（液液色譜（LLCLLC）超臨界

4、流體為流動相的色譜稱為超臨界流體色譜（超臨界流體為流動相的色譜稱為超臨界流體色譜（SFCSFC）。）。一、一、 流出曲線及有關術語流出曲線及有關術語 在氣相色譜分析法中，在氣相色譜分析法中，將以將以組分濃組分濃 度為縱坐標，度為縱坐標， 流出時間為橫坐標，繪流出時間為橫坐標，繪得的組分及其濃度隨時得的組分及其濃度隨時間變間變 化的曲線稱為色譜化的曲線稱為色譜圖，也稱色譜流出曲線。圖，也稱色譜流出曲線。下面是單個組分的色譜下面是單個組分的色譜圖，用以說明圖，用以說明 色色 譜分析法的相關術語。譜分析法的相關術語。 基線和保留值基線和保留值 1. 基線：圖中的基線：圖中的O t 表示表示只有載氣通

5、過只有載氣通過檢測器時響應信號檢測器時響應信號的記錄。在條件穩的記錄。在條件穩定時為一直線。定時為一直線。2. 保留值保留值：表示試：表示試樣中各組分在色譜樣中各組分在色譜柱內停留的時間數柱內停留的時間數值值。通常用。通常用時間時間或或相應的相應的載氣體積載氣體積來來表示。表示。（1）用時間時間表示的保留值 保留時間保留時間 tR：指：指待測組分從進樣到待測組分從進樣到柱后出現濃度最大柱后出現濃度最大值時所需的時間值時所需的時間, 如如圖中的圖中的O B。 死時間死時間tM：指：指不不與固定相作用的氣與固定相作用的氣體（如空氣、甲烷體（如空氣、甲烷等）的保留時間，等）的保留時間，如圖中如圖中O

6、A所示。所示。（1）用時間時間表示的保留值（二）_ 調整保留時間調整保留時間 t R：指指扣除了死時間的保留扣除了死時間的保留時間時間，如圖中的，如圖中的AB。 即：即：tR = tR tM 注意：當固定相一定，注意：當固定相一定，在確定的實驗條件下，在確定的實驗條件下，任何物質都有一定的保任何物質都有一定的保留時間，它是色譜分析留時間，它是色譜分析法的基本參數。法的基本參數。 保留體積VR：指從進樣到柱后出現待測組分濃度極大值時所通過的載氣體積。 VRtR F0 F0 色譜柱出口處載氣流速 （mL/min） 死體積死體積V VM M：指：指色譜柱內色譜柱內除了填充物固定相以外除了填充物固定相

7、以外的空隙體積、色譜儀中的空隙體積、色譜儀中管路和連接頭間的空間管路和連接頭間的空間及檢測器的空間的總和。及檢測器的空間的總和。 V VM Mt tM MF F0 0 調整保留體積調整保留體積VVR R：指扣除了死體積后：指扣除了死體積后的保留體積。的保留體積。（2）用體積表示的保留值用體積表示的保留值3. 相對保留值相對保留值相對保留值 r21： 指組分2和組分1調整保留值之比，是一個無 因次量。 r21 = tR2 /tR1 = VR2 /VR1 注意：注意：相對保留值只與柱溫及固定相性質有關，與其他色譜操作條件無關，它表示了色譜柱對這兩種組分的選擇性。4. 區域寬度（一）區域寬度（一）（

8、1）標準偏差標準偏差： 1/2EF1/4IJ（1/4Wb） 即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。 峰高 h 是色譜峰頂到基線的距離。h、是描述色譜流出曲線形態的兩個重要參數 。 h 、與的關系如何？ 即色譜峰寬度。習慣上常用以下三個量三個量來表示。區域寬度（二）區域寬度（二） （2）半峰寬半峰寬Y1/2: 峰高一半處峰高一半處色譜峰的寬度色譜峰的寬度。如圖中的GH。 半峰寬與標準偏差的關系為：注意注意：由于半峰寬容易測量，使用方便，所以一般用它來表示區域寬度。354. 22ln22Y2/1區域寬度（三）區域寬度（三）（3）峰基寬度峰基寬度Wb：即：即通通過流出曲線的拐點所作的過流出曲線的拐點

9、所作的切線在基線的截距，切線在基線的截距，如圖如圖I J所示。所示。Wb與與的關系：的關系： Wb 4二二 色譜法中的主要參數和關系式色譜法中的主要參數和關系式分配系數分配系數Kp和容量因子和容量因子K （1）分配系數分配系數Kp：定溫定壓下物質在固定相和流動相中的：定溫定壓下物質在固定相和流動相中的濃度比。濃度比。 KPCs / Cm （s固定相；固定相； m流動相）流動相） （2）容量因子容量因子K：分配系數與兩相體積有關的參數，表示：分配系數與兩相體積有關的參數，表示溶質溶質A在兩相中的質量之比。在兩相中的質量之比。 K=mAs / mAm =KPVS/Vm分配系數分配系數Kp和體積保留

10、值和體積保留值VR的關系的關系VR = VM + KpVs 即：即：VR = VM（1+ K） 或：或：K（VRVM）/ VM當流動相流速一定時有：當流動相流速一定時有： K（tRtM）/tM tR/tM 從上兩式可以看到，色譜分析法中各組分保留值從上兩式可以看到，色譜分析法中各組分保留值隨隨K 而變化，而而變化，而tM 、tR都可以從色譜圖上測得，從都可以從色譜圖上測得，從而可以求出而可以求出K。容量因子。容量因子K是描述溶質保留行為的一是描述溶質保留行為的一個重要參數。個重要參數。（3）分離比分離比a 色譜分析法中A、B兩種物質的分離效率可用分離比表示。當兩相體積一定時，分離比與保留值的關

11、系為： aKp(B)/Kp(A)K(B)/K(A)tR(B)/ tR(A)B，A 在色譜法中，分離比等于被分離兩種物質分離比等于被分離兩種物質的調整保留值之比。的調整保留值之比。 tR(B)/ tR(A)B，A也稱相對保留值。也稱相對保留值。三、三、 色譜柱的效能塔板理論色譜柱的效能塔板理論 在50年代，色譜技術發展的初期，Martin等人把色譜分離過程比作分餾過程，并把分餾中的半經驗理論塔板理論用于色譜分析法。 色譜柱的效能塔板理論（二）色譜柱的效能塔板理論（二） 這理論把色譜柱比作一個分餾塔，假設柱內有這理論把色譜柱比作一個分餾塔，假設柱內有n個塔板，在每個塔板高度間隔內，試樣各組分在兩相

12、個塔板，在每個塔板高度間隔內，試樣各組分在兩相中分配并達到平衡，最后中分配并達到平衡，最后,揮發度大的組分和揮發度小揮發度大的組分和揮發度小的組分彼此分離，揮發度大的最先從塔頂（即柱后）的組分彼此分離，揮發度大的最先從塔頂（即柱后）逸出。盡管這個理論（概念）并不完全符合色譜柱的逸出。盡管這個理論（概念）并不完全符合色譜柱的分離過程，色譜分離和一般的分餾塔分離有著重大的分離過程，色譜分離和一般的分餾塔分離有著重大的差別，但是因為這個比喻形象簡明，因此幾十年來一差別，但是因為這個比喻形象簡明，因此幾十年來一直沿用。直沿用。 色譜柱的效能塔板理論（三）色譜柱的效能塔板理論（三） 按照塔板理論，色譜柱

13、的分離效能可以用按照塔板理論，色譜柱的分離效能可以用塔板數塔板數來表示，由塔板理論導出的來表示，由塔板理論導出的理論塔板數理論塔板數 n 的計算公式是：的計算公式是： n=5.54(tR/y1/2)216(tR/Wb)2 注：使用該公式，注：使用該公式，分子分母應取相同單位分子分母應取相同單位。色譜柱的效能塔板理論（四）色譜柱的效能塔板理論（四） 由于死體積由于死體積V VM M ( (或死時間或死時間t tM M) )內并沒有發生分配作用，內并沒有發生分配作用，在考慮柱的實際分離效能時應予扣除，在考慮柱的實際分離效能時應予扣除，扣除死時間后色譜扣除死時間后色譜柱效用柱效用有效塔板數有效塔板數

14、n n有效有效 和有效塔板高度和有效塔板高度H H有效。有效。2)(16)Yt(54. 5n221RbR/Wt有效H有效L / n有效 由于同一色譜柱對不同物質的柱效能不同，故用由于同一色譜柱對不同物質的柱效能不同，故用H H、n n、H H有效、有效、n n有效有效等指標表示柱效能時應注明被測物質和色等指標表示柱效能時應注明被測物質和色譜條件。譜條件。色譜柱的效能塔板理論（五）色譜柱的效能塔板理論（五）22)1(16n2121rrR有效n有效有效也可以用下式表達：也可以用下式表達：)1(162121rrnR有效n有效有效與與R的關系式為的關系式為：有效HrrRL22)1(162121柱長柱長

15、符號與上面討論的相同。符號與上面討論的相同。色譜柱的效能塔板理論（六）色譜柱的效能塔板理論（六） 理論塔板高度理論塔板高度（H）：H L / n L 色譜柱長度色譜柱長度 n n 大或大或 H H 小，表示柱的分離效能愈高。小，表示柱的分離效能愈高。 有效塔板數（高度）：扣除了死體積或死有效塔板數（高度）：扣除了死體積或死時間后的塔板數（高度）。色譜柱內的死時間后的塔板數（高度）。色譜柱內的死體積或相應的死時間實際上并沒有參與分體積或相應的死時間實際上并沒有參與分配作用。配作用。 四、四、 影響色譜柱效能的因素影響色譜柱效能的因素速率理論（一）速率理論（一） 前面已知，用塔板理論來說明色譜柱內

16、各組前面已知，用塔板理論來說明色譜柱內各組分的分離過程并不合理，因為色譜柱內并沒有分的分離過程并不合理，因為色譜柱內并沒有塔板。當同一試樣進入同一色譜柱，當流動相塔板。當同一試樣進入同一色譜柱，當流動相速度變化時，得到不同的色譜圖。測得的速度變化時，得到不同的色譜圖。測得的 n n 和和 H H 也不同，充分說明塔板理論不足以說明色譜也不同，充分說明塔板理論不足以說明色譜柱的分離過程。柱的分離過程。影響色譜柱效能的因素影響色譜柱效能的因素速率理論（二）速率理論（二） 1956年，荷蘭學者范德姆特（年，荷蘭學者范德姆特（VanDeomter）等提出一個描述色譜柱分離過程中復雜因素使色等提出一個描

17、述色譜柱分離過程中復雜因素使色譜峰擴寬而致柱效降低（即：使譜峰擴寬而致柱效降低（即：使 H 增大）影響的增大）影響的方程。此方程經簡化后寫為方程。此方程經簡化后寫為:UDUCUB/ AH該式稱為速率方程（范氏方程范氏方程）。 下面我們將對公式中的各項進行討論下面我們將對公式中的各項進行討論 影響色譜柱效能的因素影響色譜柱效能的因素速率理論（三）速率理論（三） A 渦流擴散項, 反映溶質分子受固定相顆粒障礙改變移動方向，形成渦流引起擴散。與填充顆粒的大小及填充的均勻性有關，而與流動相的流速無關。A越大，色譜峰變寬更嚴重。 式中 ； 流動相的平均線速度 UDUCUB/ AH（范氏方程）。影響色譜柱

18、效能的因素影響色譜柱效能的因素速率理論（四）速率理論（四）v由于由于溶質區帶前后存在著濃度差，因而產生縱溶質區帶前后存在著濃度差，因而產生縱向擴散使區帶（色譜峰）擴寬向擴散使區帶（色譜峰）擴寬。由于分子在液體。由于分子在液體中的擴散速率大約是在氣體中的中的擴散速率大約是在氣體中的 1/105，所以該，所以該項項對液相色譜來說很小，對液相色譜來說很小，而對氣相色譜則很重要。而對氣相色譜則很重要。v擴散的嚴重與否，擴散的嚴重與否，關鍵是取決于流動相的線速關鍵是取決于流動相的線速度。度。速率方程（范氏方程）UDUCUB/ AH：分子擴散項UB/ 影響色譜柱效能的因素影響色譜柱效能的因素速率理論（五）

19、速率理論（五） 此兩項對色譜峰的影響均與流速成正比。在流速很此兩項對色譜峰的影響均與流速成正比。在流速很高的情況下，由于沒有足夠的時間建立平衡，偏離更為高的情況下，由于沒有足夠的時間建立平衡，偏離更為嚴重。嚴重。C 固定相傳質阻力項固定相傳質阻力項 D 流動相傳質阻力項流動相傳質阻力項 (非平衡狀態作用非平衡狀態作用) 對于一定的色譜體系，速率方程中對于一定的色譜體系，速率方程中A、B、C、D其其值為一定。速率方程描述了流動相的平均線速度對柱值為一定。速率方程描述了流動相的平均線速度對柱效能的影響。效能的影響。影響色譜柱效能的因素影響色譜柱效能的因素速率理論速率理論(六六) 固定填充柱，對某一

20、固定填充柱，對某一物質在不同的載氣流速物質在不同的載氣流速下下,測定塔板高度，即可測定塔板高度，即可作右圖。作右圖。從圖中可以看出，從圖中可以看出，曲線最曲線最低點處低點處 H 最小，即柱效能最小，即柱效能最高，該點對應的載氣流最高，該點對應的載氣流速為最佳流速。速為最佳流速。 上述做法可用來求上述做法可用來求某條件某條件下對某種物質的最佳載氣下對某種物質的最佳載氣流速。流速。 H 的關系如下圖所示的關系如下圖所示氣相色譜分析法中，氣相色譜分析法中，五、五、 分離效率的表示方法分離度分離效率的表示方法分離度 分離效率的表示方法分離效率的表示方法 分離度（分辨率）分離度（分辨率） 一個混合物（設

21、只有一個混合物（設只有A、B兩種組分）經色譜分離兩種組分）經色譜分離后，得到的譜圖可能為：后，得到的譜圖可能為：試評價（試評價（1）（）（2）（）（3）的分離效果。）的分離效果。（考慮兩方面因素：溶質的保留值和溶質區帶的區域寬度）（考慮兩方面因素：溶質的保留值和溶質區帶的區域寬度）色譜分離效率用參數分離度（分辨率）色譜分離效率用參數分離度（分辨率）R來表示。來表示。分離效率的表示方法分離度（一）分離效率的表示方法分離度（一）色譜分離效率用分離度（分辨率）色譜分離效率用分離度（分辨率）R來表示：來表示：v式中：分子反映了溶質在兩相中分配行為對分離的影響，式中：分子反映了溶質在兩相中分配行為對分離的影響， 是色譜分離的熱力學因素。是色譜分離的熱力學因素。v分母反映了動態過程溶質區帶的擴寬對分離的影響，是分母反映了動態過程溶質區帶的擴寬對分離的影響，是 色譜分離的動力學因素。色譜分離的動力學因素。v從中得到：從中得到：兩溶質保留時間相差越大，色譜峰越窄，分兩溶質保留時間相差越大，色譜峰越窄，分 離越好。離越好。)(699. 1)( 2)( 2/ 1)(2/1)(2/1)()()()()()(BAARBRBbAbARBRYYttRWWttR或分離效率的表示方法分離效率的表示方法分離度（二）分離度（二） 對于兩個面積相等的對稱峰，理論上可以證明： R 0.8 1.0 1