1、王王 震震 提要提要v生物大分子是指生物體內由分子量較低的基本結構生物大分子是指生物體內由分子量較低的基本結構單位首尾相連形成的多聚化合物。單位首尾相連形成的多聚化合物。vDNADNA、RNARNA和蛋白質是生物體中最重要的生物大分子，和蛋白質是生物體中最重要的生物大分子，是分子生物學研究和分子診斷的對象。它們的分離是分子生物學研究和分子診斷的對象。它們的分離純化是分子生物學研究和疾病分子診斷的基礎，而純化是分子生物學研究和疾病分子診斷的基礎，而蛋白質的分離純化也具有生產的應用。蛋白質的分離純化也具有生產的應用。v核酸和蛋白質的結構與功能及相互作用是分子水平核酸和蛋白質的結構與功能及相互作用是

2、分子水平生命活動的基礎；內源基因的突變、表達及調控的生命活動的基礎；內源基因的突變、表達及調控的異常和外源致病基因的侵入是人類疾病發生、發展異常和外源致病基因的侵入是人類疾病發生、發展的根因。的根因。v核酸分離純化的原則是：一保持核酸一級結構的完核酸分離純化的原則是：一保持核酸一級結構的完整性；二是盡可能提高核酸制品的純度。整性；二是盡可能提高核酸制品的純度。v第一節第一節 核酸分離純化的設計及原則核酸分離純化的設計及原則v第二節第二節 真核細胞基因組真核細胞基因組DNA的分離純化的分離純化v第三節第三節 真核細胞總真核細胞總RNA的分離純化的分離純化v第四節第四節 質粒質粒DNA的提取與純化

3、的提取與純化v第五節第五節 蛋白質的分離與純化蛋白質的分離與純化本章內容本章內容第一節第一節 核酸分離純化的設計核酸分離純化的設計及原則及原則一、材料與方法的選擇一、材料與方法的選擇v（一）（一） 材料與方法的選擇材料與方法的選擇 核酸存在于動植物的細胞以核酸存在于動植物的細胞以及各種微生物之中。常見的標本包括血液、尿液、唾液、及各種微生物之中。常見的標本包括血液、尿液、唾液、組織及培養的細胞。不同的研究目的對核酸的完整性、純組織及培養的細胞。不同的研究目的對核酸的完整性、純度、產量及濃度可能有不同的要求，另外尚需考慮制備核度、產量及濃度可能有不同的要求，另外尚需考慮制備核酸所需的時間與成本酸

4、所需的時間與成本v（二）（二） 選擇原則選擇原則 一是保持核酸堿基序列的完整性。二是一是保持核酸堿基序列的完整性。二是盡量清除其它分子的污染，保證核酸制品的純度。盡量清除其它分子的污染，保證核酸制品的純度。 v（三）（三） 保持核酸的完整性保持核酸的完整性 在整個操作過程中應盡量避在整個操作過程中應盡量避免各種有害因素對核酸的破壞。免各種有害因素對核酸的破壞。二、技術路線的設計二、技術路線的設計（一）（一） 核酸的釋放核酸的釋放一般情況下，一般情況下，DNA和和RNA均位于細胞內（病毒除均位于細胞內（病毒除外）。因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細外）。因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細胞、

5、釋放核酸。胞、釋放核酸。破碎細胞的方法很多包括機械和非機械法兩大類。破碎細胞的方法很多包括機械和非機械法兩大類。對于富集在細胞特定區域的核酸，一般應先收集對于富集在細胞特定區域的核酸，一般應先收集該部分核酸，可獲得高純度、高濃度且結構較完該部分核酸，可獲得高純度、高濃度且結構較完整的核酸分子。整的核酸分子。（二）（二） 核酸的分離與純化核酸的分離與純化應該清除的雜質主要包括三部分：非核酸應該清除的雜質主要包括三部分：非核酸的大分子污染物、非需要的核酸分子及在的大分子污染物、非需要的核酸分子及在分離純化過程中前后加入的對后繼研究與分離純化過程中前后加入的對后繼研究與診斷有影響的溶液和試劑。診斷有

6、影響的溶液和試劑。v隨著提取試劑的逐步加入，加上去除雜質過程中核隨著提取試劑的逐步加入，加上去除雜質過程中核酸分子不可避免地丟失，樣品中核酸的濃度無疑會酸分子不可避免地丟失，樣品中核酸的濃度無疑會逐步下降，當不能滿足后續研究與診斷所需時應對逐步下降，當不能滿足后續研究與診斷所需時應對樣品進行濃縮。樣品進行濃縮。v沉淀是濃縮核酸的最常用且高效的方法，其優點在沉淀是濃縮核酸的最常用且高效的方法，其優點在于核酸沉淀后，可以很容易將核酸溶液調至所需濃于核酸沉淀后，可以很容易將核酸溶液調至所需濃度。此外，還能清除部分雜質和某些鹽離子。度。此外，還能清除部分雜質和某些鹽離子。10v因此，常在加入一定濃度的

7、鹽后，用有機溶劑沉淀因此，常在加入一定濃度的鹽后，用有機溶劑沉淀抽提液中的核酸。抽提液中的核酸。v常用的鹽類有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、常用的鹽類有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂；氯化鉀及氯化鎂；v常用的有機溶劑則為乙醇、異丙醇和聚乙二醇。常用的有機溶劑則為乙醇、異丙醇和聚乙二醇。v核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%70%75%75%的乙醇洗滌去除。的乙醇洗滌去除。三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（一）核酸的鑒定 1. 濃度鑒定濃度鑒定 核酸濃度的測定可通過紫外分光光核酸濃度的測定可通過紫外分光光度法與熒

8、光光度法進行。度法與熒光光度法進行。 紫外分光光度法：該法是基于核酸分子中的堿基具紫外分光光度法：該法是基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結構因而可以吸收紫外線，其最大吸有共軛雙鍵結構因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長為收波長為260nm。熒光光度法：核酸的熒光染料熒光光度法：核酸的熒光染料EB嵌入堿基平面后，嵌入堿基平面后，核酸在核酸在UV激發下發出紅色熒光激發下發出紅色熒光 純度鑒定純度鑒定紫外分光光度法：該法主要通過紫外分光光度法：該法主要通過A260A260與與A280A280的的比值來判定有無蛋白質的污染。在比值來判定有無蛋白質的污染。在TETE緩沖液中，緩沖液中，純純DNADNA的的

9、A260/A280A260/A280為為1.81.8，純，純RNARNA的比值為的比值為2.02.0。比值升高與降低均提示不純。比值升高與降低均提示不純。熒光光度法：用熒光光度法：用EBEB等熒光染料示蹤的核酸電泳等熒光染料示蹤的核酸電泳結果可判定核酸制品的純度。結果可判定核酸制品的純度。完整性鑒定完整性鑒定瓊脂糖凝膠電泳法：以瓊脂糖凝膠電泳法：以EB為示蹤劑的核酸凝膠為示蹤劑的核酸凝膠電泳結果可判定核酸制品的完整性。基因組電泳結果可判定核酸制品的完整性。基因組DNA片段的分子量很大，在電場中泳動很慢，片段的分子量很大，在電場中泳動很慢，如果發生降解，電泳圖呈拖尾狀。完整的或如果發生降解，電泳

10、圖呈拖尾狀。完整的或降解很少的總降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶的熒電泳圖譜中，三條帶的熒光強度積分應呈特定的比值。光強度積分應呈特定的比值。14電泳結果電泳結果100 mg動物肌肉組織經過總RNA提取,用2.5g進行RNA甲醛變性膠電泳結果。 電泳結果可檢測電泳結果可檢測RNARNA的完整性，的完整性，28S28S和和18S18S真核細胞的比值約為真核細胞的比值約為2 2：1 1，表明無，表明無RNARNA降降解，由下至上分別為解，由下至上分別為5S5S、18S18S和和28S28S的的RNARNA。（二）核酸的保存（二）核酸的保存vDNADNA的儲存的儲存 DNA DNA溶于溶于TET

11、E緩沖液中在緩沖液中在-70-70冰箱可冰箱可保存數年。當保存數年。當TETE的的pHpH為為8.08.0時，時，DNADNA的脫氨反應的脫氨反應減少。加入少量氯仿，可避免細菌對核酸的污減少。加入少量氯仿，可避免細菌對核酸的污染。染。vRNARNA的儲存的儲存 RNA RNA溶于溶于0.3mol/L0.3mol/L的的NaAcNaAc溶液或三溶液或三蒸水中，在蒸水中，在-70-70保存。如用保存。如用DEPCDEPC處理水溶解處理水溶解RNARNA或者在或者在RNARNA溶液中加入溶液中加入RNasinRNasin，保存時間更，保存時間更可長。注意凍融產生的剪切力。可長。注意凍融產生的剪切力。

12、16第二節第二節 質粒質粒DNADNA的提取與純化的提取與純化17質粒基本知識質粒基本知識l定義：質粒（定義：質粒（plasmidplasmid）是核外基因，雙鏈、）是核外基因，雙鏈、共價閉環的共價閉環的DNADNA，大小范圍從，大小范圍從1kb1kb至至200kb200kb以上以上不等。不等。 l特點：自主復制特點：自主復制 穩定遺傳穩定遺傳 質粒不相容性質粒不相容性 賦賦予宿主性狀。予宿主性狀。l載體（載體（vectorvector）：體外重組）：體外重組DNADNA實驗中，將外實驗中，將外源源DNADNA片段運送進宿主細胞進行擴增或表達的片段運送進宿主細胞進行擴增或表達的運載工具。運載工

13、具。18質粒質粒DNADNA提取提取3 3個步驟個步驟l培養細菌培養細菌 對數生長晚期。對數生長晚期。l收集和裂解細菌收集和裂解細菌 離心離心 DNA DNA質粒的大小、大腸質粒的大小、大腸桿菌菌株及裂解后用于純化質粒桿菌菌株及裂解后用于純化質粒DNADNA的技術。的技術。 l純化質粒純化質粒 離子交換層析、凝膠過濾層析、分離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀及純化級沉淀及純化KITKIT、氯化銫、氯化銫- -溴化乙錠梯度平溴化乙錠梯度平衡離心。衡離心。19分離質粒分離質粒DNADNA方法方法從大腸桿菌中分離質粒從大腸桿菌中分離質粒DNADNA常用的方常用的方法眾多：法眾多：堿變性法；堿變性法

14、；煮沸法；煮沸法；SDSSDS法；法；羥基磷灰石層析法等羥基磷灰石層析法等各方法分離是依據宿主菌株類型、各方法分離是依據宿主菌株類型、質粒分子大小、堿基組成及結構等質粒分子大小、堿基組成及結構等特點加以選擇的特點加以選擇的OripUC18Amp rMCSLacZ20一、堿裂解法一、堿裂解法v在在NaOHNaOH存在的強堿條件下，用存在的強堿條件下，用SDSSDS破壞細胞壁，并破壞細胞壁，并使細胞的蛋白質與使細胞的蛋白質與DNADNA發生變性，釋放出質粒發生變性，釋放出質粒DNADNA。細胞壁碎片、蛋白質和染色體細胞壁碎片、蛋白質和染色體DNADNA形成大的復合物，形成大的復合物，沉淀，質粒沉淀

15、，質粒DNADNA保留在上清液中。使用預冷無水乙保留在上清液中。使用預冷無水乙醇沉淀上清液中的質粒醇沉淀上清液中的質粒DNADNA，再用，再用70%70%的乙醇洗滌。的乙醇洗滌。質粒質粒DNADNA就可新恢復天然的超螺旋。就可新恢復天然的超螺旋。21二二. . 煮沸裂解法煮沸裂解法v煮沸裂解法是將細菌懸浮于含煮沸裂解法是將細菌懸浮于含TritonX-100TritonX-100和溶菌和溶菌酶的緩沖液中，再用沸水浴裂解細胞，并使宿主細酶的緩沖液中，再用沸水浴裂解細胞，并使宿主細胞的蛋白質與胞的蛋白質與DNADNA變性。質粒變性。質粒DNADNA因結構緊密不會解因結構緊密不會解鏈，當溫度下降后，可

16、重新恢復其天然超螺旋結構。鏈，當溫度下降后，可重新恢復其天然超螺旋結構。通過離心去除變性的蛋白質和染色體通過離心去除變性的蛋白質和染色體DNADNA。然后回。然后回收上清液中的質粒收上清液中的質粒DNADNA。22三、三、SDSSDS裂解法裂解法vSDSSDS裂解法是將細菌懸浮于等滲的蔗糖溶液裂解法是將細菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和中，用溶菌酶和EDTAEDTA處理以破壞細胞壁，再處理以破壞細胞壁，再用用SDSSDS裂解細胞，從而溫和地釋放質粒到等裂解細胞，從而溫和地釋放質粒到等滲液中，然后酚滲液中，然后酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀、洗氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質粒滌質粒DNADNA。v由

17、于條件溫和，該法特別適用于大質粒由于條件溫和，該法特別適用于大質粒DNADNA（15kb15kb）的提取。）的提取。23四、其它方法四、其它方法v小量一步提取法是直接將酚小量一步提取法是直接將酚/ /氯仿與細菌培養物混氯仿與細菌培養物混合，同時完成細胞裂解與蛋白質變性兩個過程，然合，同時完成細胞裂解與蛋白質變性兩個過程，然后離心去除大部分蛋白質和染色體后離心去除大部分蛋白質和染色體DNADNA，從上清液，從上清液中回收質粒中回收質粒DNADNA。v牙簽少量制備法：牙簽直接挑取菌落制備質粒牙簽少量制備法：牙簽直接挑取菌落制備質粒DN ADN A，制備的質粒制備的質粒DNADNA有較多污染，不能用

18、于分子克隆中有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學反應，但可用于質粒的鑒定。的酶學反應，但可用于質粒的鑒定。24常見問題常見問題v1.沒有提取到質粒沒有提取到質粒 v2.質粒產量低質粒產量低 v3.質粒酶切效果不好質粒酶切效果不好 v4.基因組基因組DNA污染污染 v5.細胞裂解差細胞裂解差 v6. DNA在上樣電泳時溢出點樣孔在上樣電泳時溢出點樣孔 第三節真核基因組第三節真核基因組DNA的分離純化的分離純化26DNADNA提取方法：常規苯酚提取方法：常規苯酚- -氯仿方法、試劑盒方法氯仿方法、試劑盒方法- -；RNARNA提取：所用器皿和試劑必需經高溫滅菌或提取：所用器皿和試劑必需經高溫滅菌或

19、DEPCDEPC處理處理Genome DNATotal RNA生物體組織細胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組 DNA粗品PFGE分離特定的DNA片段AGE分離PAGE分離乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品精分離 粗分離前處理離子交換層析純化有機溶劑抽提細胞裂解蛋白質變性沉淀降解DNA釋放甲酰胺解聚法哺乳動物基因組哺乳動物基因組DNA分離純化的一般技術路線分離純化的一般技術路線一、酚抽提法一、酚抽提法v該法于該法于19761976年由年由StaffordStafford及其同事創立，現在使及其同事創立，現在使用的是改進的方法：以含用的是改進的方法：以含EDTAEDTA、SDSSDS及無及無DNaseDNase

20、的的RNaseRNase裂解液裂解細胞，經蛋白酶裂解液裂解細胞，經蛋白酶K K處理后，用處理后，用pH8.0pH8.0的的TrisTris飽和酚抽提飽和酚抽提DNADNA，依據不同需要進行，依據不同需要進行透析或沉淀處理，獲得透析或沉淀處理，獲得DNADNA粗制品。粗制品。二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法v19871987年年KupiecKupiec等報道了甲酰胺（等報道了甲酰胺（formamideformamide）解）解聚法，其中細胞裂解和蛋白質水解步驟同酚抽提聚法，其中細胞裂解和蛋白質水解步驟同酚抽提法，但不進行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺法，但不進行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺裂解

21、染色質中裂解染色質中DNADNA與蛋白質，最后使用火棉膠袋進與蛋白質，最后使用火棉膠袋進行充分透析去除蛋白酶行充分透析去除蛋白酶K K及有機溶劑。及有機溶劑。 三、玻棒纏繞法三、玻棒纏繞法v現今使用的纏繞法是以現今使用的纏繞法是以19871987年年BowtellBowtell的方法經改的方法經改進而來。本法有兩個關鍵步驟：一是基因組進而來。本法有兩個關鍵步驟：一是基因組DNADNA沉沉淀在細胞裂解液和乙醇的交界面；二是將淀在細胞裂解液和乙醇的交界面；二是將DNADNA沉淀沉淀纏繞在帶鉤玻棒上。帶鉤玻棒將大片段纏繞在帶鉤玻棒上。帶鉤玻棒將大片段DNADNA從無水從無水乙醇中轉移至乙醇中轉移至p

22、H8.0pH8.0的的TETE緩沖液中。緩沖液中。四、其它方法四、其它方法v常用的一些分子生物學技術及分子診斷，并不需要常用的一些分子生物學技術及分子診斷，并不需要高分子量的高分子量的DNADNA樣品，樣品，202050kb50kb大小的大小的DNADNA足以。足以。v因此步驟簡化、操作簡便的因此步驟簡化、操作簡便的DNADNA快速提取法運用而快速提取法運用而生并廣泛使用。如異丙醇沉淀法，玻璃珠吸附法。生并廣泛使用。如異丙醇沉淀法，玻璃珠吸附法。v一般而言，蛋白酶一般而言，蛋白酶K K的使用可以提高的使用可以提高DNADNA的純度和產的純度和產量，但對要求不高的某些量，但對要求不高的某些PCR

23、PCR診斷并非必需。診斷并非必需。五、基因組五、基因組DNADNA片段的純化片段的純化（一）純化的原則與要求（一）純化的原則與要求純化與回收純化與回收DNADNA片段原則：一是提高回收率；二片段原則：一是提高回收率；二要清除雜質。要清除雜質。1. 1. 回收率回收率 為提高為提高DNADNA片段的回收率，可通過片段的回收率，可通過提高提高DNADNA樣品的上樣量和選擇適宜的方法與材樣品的上樣量和選擇適宜的方法與材料而實現。料而實現。（二）（二） 瓊脂糖凝膠回收瓊脂糖凝膠回收DNADNA片段片段v從瓊脂糖凝膠中純化從瓊脂糖凝膠中純化DNADNA片段的方法主要有二片段的方法主要有二乙基氨基乙基（乙

24、基氨基乙基（DEAEDEAE）- -纖維素（纖維素（cellulosecellulose）膜插片電泳法、電泳洗脫法、冷凍擠壓法及低膜插片電泳法、電泳洗脫法、冷凍擠壓法及低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法等。熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法等。（三）（三） 聚丙烯酰胺凝膠回收聚丙烯酰胺凝膠回收DNADNA片段片段v它是將含待回收它是將含待回收DNADNA條帶的凝膠塊切出，用條帶的凝膠塊切出，用吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖液吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖液浸泡，使浸泡，使DNADNA洗脫出來。該方法能很好地回洗脫出來。該方法能很好地回收小于收小于1 kb1 kb的的ssss或或ds-DNAds-DN

25、A第四節第四節 真核細胞真核細胞RNA的分離純的分離純化化一、一、RNARNA制備的條件與環境制備的條件與環境vRNARNA極易被極易被RNaseRNase水解，除胞內的水解，除胞內的RNaseRNase外，它外，它還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環境中；環境中；vRNaseRNase分子結構中二硫鍵的存在使其生物學活分子結構中二硫鍵的存在使其生物學活性非常穩定，加熱煮沸及一般的變性劑均不能性非常穩定，加熱煮沸及一般的變性劑均不能使其完全滅活。使其完全滅活。36玻璃器皿使用前于180的高溫下干烤6h以上，塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡。有機

26、玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22m濾膜過濾除菌。371.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性。高溫條件下分解。2.異硫氰酸胍：目前最有效的RNA酶抑制劑，在裂解組織的同時也使RNA酶失活。3.RNA酶抑制劑（RNasin）：一種酸性糖蛋白。RNa

27、sin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。 二、常用的二、常用的RNA酶抑制劑酶抑制劑38TrizolTrizol試劑法分離總試劑法分離總RNARNA 首先用含有異硫氰酸胍和酚的一種單相液來裂解細胞，首先用含有異硫氰酸胍和酚的一種單相液來裂解細胞，加入氯仿產生第二相，離心后，加入氯仿產生第二相，離心后，RNARNA存在于水相，經存在于水相，經異丙醇沉淀水相中的異丙醇沉淀水相中的RNARNA可用于可用于NorthernNorthern雜交分析、雜交分析、RT-PCRRT-PCR等；存在于有機相的等；存在于有機相的DNADNA和蛋白質用乙醇和異和蛋白質用乙醇和異丙醇連

28、續沉淀而分別分離，得到的丙醇連續沉淀而分別分離，得到的DNADNA大小約大小約20Kb20Kb，適用于適用于PCRPCR的模板；回收的蛋白質主要用于免疫印跡的模板；回收的蛋白質主要用于免疫印跡分析。分析。三、商品化的單相裂解試劑法分離三、商品化的單相裂解試劑法分離RNARNA39 1取30mg組織置勻漿器中，加入1ml Trizol冰上勻漿， 將勻漿液轉至Ep管中，靜置min。2加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。34離心，12000g15min，取上清，沉淀用于DNA提純。4加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫置10min。54離心，12000g10min，棄上清。6加入1ml 75%

29、乙醇，洗滌沉淀。棄上清。7. 晾干，加入30l雙蒸水溶解。 （15l用于紫外測定；10l用于變性電泳；1l用于RT-PCR） 操作步驟操作步驟四、四、mRNAmRNA的分離純化的分離純化v與序列明確的與序列明確的rRNArRNA、tRNAtRNA、snRNAsnRNA、scRNAscRNA不同，真核生物不同，真核生物的的mRNAmRNA在細胞中含量少，種類多且分子量大小不一。除血在細胞中含量少，種類多且分子量大小不一。除血紅蛋白及組蛋白的紅蛋白及組蛋白的mRNAmRNA外，絕大多數外，絕大多數mRNAmRNA在其在其3 3 末端帶有末端帶有長短不同的長短不同的polypoly（A A）尾巴。依

30、據）尾巴。依據mRNAmRNA的結構特征，利用的結構特征，利用堿基配對原則，通過堿基配對原則，通過oligooligo（dTdT）- -纖維素或纖維素或polypoly（U U）- -瓊瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地從總脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地從總RNARNA制品中分離制品中分離純化純化mRNAmRNA。v（一）（一）oligooligo（dTdT）- -纖維素柱層析法纖維素柱層析法v（二）（二）oligooligo（dTdT）- -纖維素柱離心法纖維素柱離心法v（三）（三）oligooligo（dTdT）- -纖維素液相結合離心法纖維素液相結合離心法v（四）磁性球珠分離法（四）磁

31、性球珠分離法v 該法聯合利用了該法聯合利用了oligooligo（dTdT）與）與polypoly（A A）的）的互補配對、生物素（互補配對、生物素（biotinbiotin）與鏈親和素）與鏈親和素（streptavidinstreptavidin）的結合特異性以及磁性分離原）的結合特異性以及磁性分離原理，可對理，可對polypoly（A A）+RNA+RNA進行高效、靈敏及快捷進行高效、靈敏及快捷的分離。的分離。5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+總RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成雜交體 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TT

32、TTTTTTTTTT-Biotin5鏈親和素標記的磁珠+Streptavidin- 磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁生物素與鏈親和素的特異性結合 磁性分離5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁鐵3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁洗滌與洗脫水相(含純化的mRNA)固相生物素標記的oligo(dT)磁鐵5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁磁珠分離法純化poly(A) +RNA的原理第五節第五節蛋白質的分離與

33、純化蛋白質的分離與純化v蛋白質的分離純化是研究蛋白質化學組成、結蛋白質的分離純化是研究蛋白質化學組成、結構及生物學功能、新蛋白質的發現和疾病分子構及生物學功能、新蛋白質的發現和疾病分子診斷的基礎。診斷的基礎。v分子克隆中，下游的處理和分析鑒定，基因工分子克隆中，下游的處理和分析鑒定，基因工程產品的制備，也需要蛋白質的分離和純化。程產品的制備，也需要蛋白質的分離和純化。一、蛋白質分離純化的技術路線設計及條件一、蛋白質分離純化的技術路線設計及條件v蛋白質分離純化的總目標是增加制品的純度蛋白質分離純化的總目標是增加制品的純度（puritypurity）或比活（）或比活（specific activi

34、tyspecific activity），），以增加單位蛋白質重量中靶蛋白的含量或生物以增加單位蛋白質重量中靶蛋白的含量或生物學活性，學活性，v即從蛋白混合物中設法去除不要的雜蛋白和變即從蛋白混合物中設法去除不要的雜蛋白和變性的靶蛋白，使靶蛋白的產量達到最高值。性的靶蛋白，使靶蛋白的產量達到最高值。v靶蛋白（靶蛋白（target proteintarget protein）的種類、性質、所存在）的種類、性質、所存在的體系（細胞內含物、細胞外分泌物還是真核細胞的體系（細胞內含物、細胞外分泌物還是真核細胞的細胞器等）以及分離純化的目的不同，因此，不的細胞器等）以及分離純化的目的不同，因此，不可能有

35、一個固定的程序適用于各種蛋白質的分離制可能有一個固定的程序適用于各種蛋白質的分離制備工作。備工作。v但這并非意味著蛋白質的分離純化沒有一定的規律，但這并非意味著蛋白質的分離純化沒有一定的規律，實際中，多數分離純化工作都使用基本的技術手段、實際中，多數分離純化工作都使用基本的技術手段、涉及相似的技術步驟。涉及相似的技術步驟。親和層析電泳分離蛋白純品精分離粗分離前處理凝膠層析生物體組織細胞離心分離鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法蛋白質粗制品蛋白質粗抽提液組織粉碎細胞裂解蛋白釋放DNA釋放離子交換層析蛋白質分離純化的一般技術路線（一）技術路線的設計（一）技術路線的設計首先要建立一個適當的分析方法，這

36、樣才能評估每一首先要建立一個適當的分析方法，這樣才能評估每一步的提純程度。步的提純程度。第二，材料的選擇與預處理。第二，材料的選擇與預處理。第三，蛋白質的粗分離。第三，蛋白質的粗分離。第四，蛋白質的細分離。第四，蛋白質的細分離。第五，靶蛋白的濃縮、冷凍干燥和保存。第五，靶蛋白的濃縮、冷凍干燥和保存。（二）分離純化的總體原則（二）分離純化的總體原則無論采用哪種或哪些具體的分離方法，設計怎樣的無論采用哪種或哪些具體的分離方法，設計怎樣的純化技術路線，都應遵循總的原則：一是保證純化技術路線，都應遵循總的原則：一是保證靶蛋白結構的完整，防止降解和活性蛋白質的靶蛋白結構的完整，防止降解和活性蛋白質的變性

37、；二是盡量滿足研究與診斷對靶蛋白純度變性；二是盡量滿足研究與診斷對靶蛋白純度的要求。的要求。（三）蛋白質分離純化的條件（三）蛋白質分離純化的條件蛋白質是一類結構復雜具有生物活性的生物大分蛋白質是一類結構復雜具有生物活性的生物大分子，離開天然的存在體系，其結構與活性變子，離開天然的存在體系，其結構與活性變得極不穩定，因此，從生物材料中提純各種得極不穩定，因此，從生物材料中提純各種靶蛋白均需要特定的條件。靶蛋白均需要特定的條件。v1. 1. 緩沖液緩沖液 緩沖液可抗衡蛋白質溶液中緩沖液可抗衡蛋白質溶液中pHpH的改的改變，保證蛋白質的穩定及保證實驗的重復性。變，保證蛋白質的穩定及保證實驗的重復性。

38、v2. 2. 鹽、金屬離子和螯合劑鹽、金屬離子和螯合劑. .v3. 3. 還原劑還原劑 加入它們是用來還原靶蛋白中的二加入它們是用來還原靶蛋白中的二硫鍵，尿素，硫鍵，尿素，DDTDDT，包涵體純化中應用很廣。，包涵體純化中應用很廣。v4. 4. 增溶劑增溶劑 樣品溶解的不好會減少分離到的蛋白樣品溶解的不好會減少分離到的蛋白質數量，同時會造成等電聚焦時某些蛋白質的沉淀，質數量，同時會造成等電聚焦時某些蛋白質的沉淀，從而減少轉移到第二向電泳的蛋白質數量從而減少轉移到第二向電泳的蛋白質數量. .v5. 5. 蛋白酶抑制劑（蛋白酶抑制劑（pronase inhibitorpronase inhibit

39、or） 裂解細裂解細胞（菌）提取蛋白質的同時，會釋放出多種蛋白酶，胞（菌）提取蛋白質的同時，會釋放出多種蛋白酶，需要迅速有效地抑制它們的活性方能保持靶蛋白的需要迅速有效地抑制它們的活性方能保持靶蛋白的完整性。完整性。 蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑被抑制的蛋白酶被抑制的蛋白酶 苯甲基磺酰氟（苯甲基磺酰氟（PMSFPMSF）絲氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、絲氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶等）巰基蛋胰蛋白酶、凝血酶等）巰基蛋白酶、木瓜蛋白酶等白酶、木瓜蛋白酶等苯甲醚（苯甲醚（benzamidinebenzamidine） 絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶亮抑蛋白酶肽（亮抑蛋白酶肽（leupeptinle

40、upeptin） 絲氨酸和巰基蛋白酶絲氨酸和巰基蛋白酶 EDTA/EGTAEDTA/EGTA金屬蛋白水解酶金屬蛋白水解酶 胰蛋白酶抑制（胰蛋白酶抑制（aprotininaprotinin） 絲氨酸蛋白酶（血漿酶、血管絲氨酸蛋白酶（血漿酶、血管舒緩素、胰蛋白酶等）舒緩素、胰蛋白酶等） v6. 6. 蛋白質的環境因素蛋白質的環境因素 v表面效應的影響：蛋白質的稀溶液易使蛋白質變表面效應的影響：蛋白質的稀溶液易使蛋白質變性失活，這可能是玻璃容器表面效應所致結果。性失活，這可能是玻璃容器表面效應所致結果。v溫度的影響：除了極少數酶在低溫條件下失活，溫度的影響：除了極少數酶在低溫條件下失活，大多數蛋白質

41、會由于熱變性而失活，故分離純化時大多數蛋白質會由于熱變性而失活，故分離純化時應注意低溫操作。應注意低溫操作。v儲存：最好的辦法是將蛋白質以凍干的粉末保存，儲存：最好的辦法是將蛋白質以凍干的粉末保存，保存時間會更長。另外，在保存的蛋白質中加入甘保存時間會更長。另外，在保存的蛋白質中加入甘油、白蛋白等惰性穩定劑，由于它們能降低溶液的油、白蛋白等惰性穩定劑，由于它們能降低溶液的極性，造成疏水環境，有利于蛋白質的長期穩定。極性，造成疏水環境，有利于蛋白質的長期穩定。二、材料的選擇及預處理二、材料的選擇及預處理v分離純化蛋白質應先考慮選擇適當的材料。動物、分離純化蛋白質應先考慮選擇適當的材料。動物、植物

42、、培養的微生物與細胞及臨床分子檢驗診斷植物、培養的微生物與細胞及臨床分子檢驗診斷的標本（如血液、分泌物、組織等）均為靶蛋白的標本（如血液、分泌物、組織等）均為靶蛋白的主要材料來源。的主要材料來源。v選材要依據研究、診斷的目的及遵循以下原則：選材要依據研究、診斷的目的及遵循以下原則：所含靶蛋白量高；材料易得。所含靶蛋白量高；材料易得。（一）材料的選擇（一）材料的選擇1、細胞破碎的方法、細胞破碎的方法細胞破碎方法細胞破碎方法 應用應用 機械法機械法1 1勻漿法勻漿法機體軟組織機體軟組織2 2搗碎法搗碎法動物韌性組織動物韌性組織3 3研磨法研磨法細菌、酵母細菌、酵母 物理法物理法1 1超聲法超聲法細

43、胞混懸液細胞混懸液2 2反復凍融法反復凍融法培養細胞培養細胞3 3冷熱交替法冷熱交替法細菌、病毒細菌、病毒4 4低滲裂解低滲裂解紅細胞紅細胞 化學法化學法1 1有機溶劑有機溶劑細菌、酵母細菌、酵母2 2去垢劑去垢劑組織、培養細胞組織、培養細胞（二）預處理（二）預處理572 2、抽提、抽提pHpH：選擇合適：選擇合適pHpH的緩沖液，如的緩沖液，如TrisTris，磷酸鹽，磷酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸鹽緩沖體系，保證待分離醋酸鹽，檸檬酸鹽緩沖體系，保證待分離蛋白在此蛋白在此pHpH條件下穩定。一般緩沖液濃度條件下穩定。一般緩沖液濃度為為202050mM50mM。溫度：低溫如溫度：低溫如4 41010，

44、蛋白酶活性較低。，蛋白酶活性較低。離子強度：如離子強度：如0.10.10.2 M NaCl0.2 M NaCl或或KCl.KCl.其他成分：還原劑如其他成分：還原劑如NaHSO3NaHSO3，維生素，維生素C C；巰；巰基保護劑基保護劑DTTDTT，巰基乙醇；金屬螯合劑，巰基乙醇；金屬螯合劑EDTAEDTA，EGTAEGTA；蛋白酶抑制劑；蛋白酶抑制劑PMSFPMSF。三、蛋白質的分離純化三、蛋白質的分離純化v蛋白質的分離純化是依據其溶解性、分子質量大小及形狀、蛋白質的分離純化是依據其溶解性、分子質量大小及形狀、電離性質和生物學功能的差異而進行，分類如下：電離性質和生物學功能的差異而進行，分類

45、如下：v以溶解度的差異為依據的方法：鹽析、分配層析、有機溶以溶解度的差異為依據的方法：鹽析、分配層析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀和結晶等；劑沉淀、選擇性沉淀和結晶等；v以分子大小及形狀差異為依據的方法：差速離心、區帶離以分子大小及形狀差異為依據的方法：差速離心、區帶離心、超濾、透析和凝膠過濾層析等；心、超濾、透析和凝膠過濾層析等；v以電離性質差異為依據的方法：電泳、離子交換層析等；以電離性質差異為依據的方法：電泳、離子交換層析等；v以生物學功能專一性為依據的方法：親和層析。以生物學功能專一性為依據的方法：親和層析。59 1. 1.分離細胞、細胞器：離心，超離心分離細胞、細胞器：離心，超離心 2.

46、 2.除核酸：酶法除核酸：酶法DNase,RNaseDNase,RNase；超聲；超聲 3. 3.除脂肪：丙酮，脂肪酶除脂肪：丙酮，脂肪酶 4. 4.鹽析：鹽析：NaClNaCl，(NH4)2SO4(NH4)2SO4沉淀沉淀 5. 5.有機溶劑抽提：甲醇，乙醇，丙酮有機溶劑抽提：甲醇，乙醇，丙酮 6. 6.等電點沉淀：除去雜蛋白等電點沉淀：除去雜蛋白 7. 7.熱變性：除去雜蛋白熱變性：除去雜蛋白 8. 8.超濾：除去分子量差異很大的雜質，濃縮超濾：除去分子量差異很大的雜質，濃縮 （一）粗分級（一）粗分級60破壞水化膜和中和表面電荷，當高濃度鹽存在時，破壞水化膜和中和表面電荷，當高濃度鹽存在時

47、，蛋白質往往會凝聚并析出沉淀。這一技術被稱蛋白質往往會凝聚并析出沉淀。這一技術被稱為為“鹽析鹽析”。不同的蛋白質在不同的鹽濃度時。不同的蛋白質在不同的鹽濃度時形成沉淀，所以鹽析常用于蛋白質的分離純化。形成沉淀，所以鹽析常用于蛋白質的分離純化。硫酸銨沉淀是最常用的鹽析方法硫酸銨沉淀是最常用的鹽析方法 1、鹽、鹽 析硫酸銨沉淀法析硫酸銨沉淀法612 2、有機溶劑沉淀法、有機溶劑沉淀法 v脫水作用和降低介電常數，不同的蛋白質在各種脫水作用和降低介電常數，不同的蛋白質在各種溶劑中的溶解度有很大不同，從基本不溶（溶劑中的溶解度有很大不同，從基本不溶（10g/ml）直至極大溶解（）直至極大溶解（300mg

48、/ml）不等。）不等。故控制有機溶劑的濃度可分離蛋白質。故控制有機溶劑的濃度可分離蛋白質。 v優點：沉淀效率高，不增加電導優點：沉淀效率高，不增加電導v缺點：條件較鹽析劇烈，有時會導致蛋白變性，缺點：條件較鹽析劇烈，有時會導致蛋白變性，需嚴格控制溫度需嚴格控制溫度623 3、透析、透析(dialysis)(dialysis)v用途：一般用于脫鹽及置換緩用途：一般用于脫鹽及置換緩沖液、有機溶劑、低分子量的沖液、有機溶劑、低分子量的抑制劑等。透析膜的截留分子抑制劑等。透析膜的截留分子量為量為5000-80005000-8000左右。左右。 v優點：所需設備簡單可行優點：所需設備簡單可行v缺點：速度

49、慢，效率低，無法處理大體積樣品缺點：速度慢，效率低，無法處理大體積樣品634 4、超濾、超濾(ultrafiltration )(ultrafiltration )v用途：用于濃縮、脫鹽及置換緩沖液、有用途：用于濃縮、脫鹽及置換緩沖液、有機溶劑、去熱源等。超濾膜的截留分子量機溶劑、去熱源等。超濾膜的截留分子量規格極多，從規格極多，從3000-1000003000-100000均有。常見有均有。常見有離心管式，中空纖維式，切向流式。離心管式，中空纖維式，切向流式。 v優點：可以處理濃縮大體積樣品，速度快，優點：可以處理濃縮大體積樣品，速度快，效率高。效率高。v缺點：需專用設備，用于純化蛋白有時并

50、缺點：需專用設備，用于純化蛋白有時并不一定能達到預期效果。不一定能達到預期效果。645 5、超速離心、超速離心* * 超速離心法超速離心法(ultracentrifugation)(ultracentrifugation)既既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。定蛋白質的分子量。 * *蛋白質在離心場中的行為用沉降系數蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(sedimentation coefficient, S)(sedimentation coefficient, S)表示表示, ,沉降系數與蛋白質的密度和形狀相關沉降系數與蛋白質的密度和形狀相關

51、 。65因為沉降系數因為沉降系數S大體上和分子量成正比大體上和分子量成正比關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數纖量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數纖維狀蛋白質不適用。維狀蛋白質不適用。66（二）精分離（二）精分離分子篩：分子篩的排阻效應分子篩：分子篩的排阻效應離子交換：離子基團的交換離子交換：離子基團的交換親和層析：蛋白質與配體之間有特殊親和力親和層析：蛋白質與配體之間有特殊親和力疏水層析：與水的親疏程度疏水層析：與水的親疏程度反相層析：不同溶劑中溶解程度反相層析：不同溶劑中溶解程度 67層析填料層析填料68層析一般

52、步驟：層析一般步驟： 處理介質處理介質裝柱裝柱平衡平衡上樣上樣洗滌洗滌洗脫洗脫介質再生介質再生691 1、凝膠過濾層析、凝膠過濾層析分離機制：將蛋白質按照分子量的大小分開分離機制：將蛋白質按照分子量的大小分開常用介質：常用介質： (1)Sephadex: ( (1)Sephadex: (交聯葡聚糖交聯葡聚糖) G25, G50, G75, ) G25, G50, G75, G100G100 Bio-gel: ( Bio-gel: (聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺) P-6) P-6，P-30P-30，P-60P-60，P-100P-100 Sepharose: ( Sepharose: (瓊脂糖瓊脂糖)

53、 2B, 4B, 6B) 2B, 4B, 6B (2) Sephacryl: S100, S200, S300 (2) Sephacryl: S100, S200, S300 (3) Superose: HPLC (3) Superose: HPLC (4) superdex: HPLC (4) superdex: HPLC 70分子篩層析的機理分子篩層析的機理7172分離度與分辨率分離度與分辨率73影響分辨率的因素影響分辨率的因素v填料形狀與粒徑（耐壓否）填料形狀與粒徑（耐壓否）v高徑比高徑比v裝柱效果（是否壓實）裝柱效果（是否壓實）v流速流速v樣品粘度樣品粘度v樣品體積樣品體積747576

54、舉例：從雞蛋殼膜中制備溶菌酶舉例：從雞蛋殼膜中制備溶菌酶 溶菌酶：分子量為溶菌酶：分子量為14KD14KD，等電點為，等電點為1111，耐熱，耐熱， 能夠水解革蘭氏陽性細菌的細胞壁，雞能夠水解革蘭氏陽性細菌的細胞壁，雞 蛋清中含量豐富。蛋清中含量豐富。77純化步驟：純化步驟：150150克雞蛋清，克雞蛋清，1 1 NaCl0.05 N HCl ,40 NaCl0.05 N HCl ,40抽提抽提2020醋酸調醋酸調pH4.6pH4.6，7575處理處理3 3分鐘，離心取上分鐘，離心取上清清加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量5050的的CaCl2CaCl

55、2，離心取上清，離心取上清在上清中加在上清中加NaClNaCl至終濃度至終濃度5 5，將樣品加到，將樣品加到Sephadex G-50Sephadex G-50層析柱中層析柱中(5X25cm)(5X25cm)，0.6% NaCl0.6% NaCl洗脫，流速洗脫，流速4040毫升毫升/ /小時，收集洗脫液小時，收集洗脫液5ml/5ml/管管測活，合并含溶菌酶部分測活，合并含溶菌酶部分聚乙二醇濃縮聚乙二醇濃縮結晶結晶782 2、離子交換層析（、離子交換層析（IEXIEX）1 1 原理：根據蛋白質等電點的差異將不同蛋白質分開。原理：根據蛋白質等電點的差異將不同蛋白質分開。2 2 離子交換介質：離子交

56、換介質： (1) (1)離子交換樹脂離子交換樹脂 (2) (2)離子交換纖維素離子交換纖維素 (3)Sepharose Fast Flow: (3)Sepharose Fast Flow: (4)Sepharose High Performance (4)Sepharose High Performance：分辨率較：分辨率較F.F.F.F.高高 (5)Mono: HPLC (5)Mono: HPLC (6)RESOURCE (6)RESOURCE，SOURCESOURCE79離子交換基團離子交換基團I I 分類：分類： 陰離子交換陰離子交換 強度強度 功能功能基團基團 + + DEAE DE

57、AE 中等中等 OCH2CH2NH(CH2CH3)2OCH2CH2NH(CH2CH3)2 + + QAE QAE 強強 OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3 陽離子交換陽離子交換 強度強度 功能功能基團基團 CM CM 弱弱 OCH2COO-OCH2COO- SP SP 強強 CH2CH2CH2SO3-CH2CH2CH2SO3-II II 選擇：選擇： 根據目標蛋白與主要雜蛋白的等電點選擇基團根據目標蛋白與主要雜蛋白的等電點選擇基團80 錄錄81 注意問題：注意問題： (1) (1) 緩沖液的選擇：緩沖液的選擇： 陽離子：磷酸鹽，檸檬

58、酸鹽陽離子：磷酸鹽，檸檬酸鹽 陰離子：陰離子：TrisTris (2) (2) 介質處理：介質處理： 陽離子：陽離子： Na+ Na+ 型型 陰離子：陰離子： Cl- Cl- 型型 (3) (3) 洗脫：洗脫：原理：原理：i i改變鹽濃度改變鹽濃度 ii ii改變改變pHpH值值方式：方式：i i連續洗脫連續洗脫 ii ii梯度洗脫梯度洗脫 (4) (4) 介質再生介質再生82IEX的步驟的步驟833 3、疏水相互作用層析（、疏水相互作用層析（HICHIC）1 1 原理：利用蛋白質疏水性的差異進行分離。原理：利用蛋白質疏水性的差異進行分離。2 2 介質：介質：常用介質：常用介質：Sepharo

59、se Fast Flow,SourceSepharose Fast Flow,Source疏水基團：疏水性由弱到強，丙烷基疏水基團：疏水性由弱到強，丙烷基 戊烷基戊烷基 苯基苯基 辛烷基辛烷基3 3 層析方式：高鹽結合，低鹽洗脫層析方式：高鹽結合，低鹽洗脫 84HICHIC原理原理85影響因素影響因素v疏水基團（疏水基團（ligand）的性質）的性質v介質的種類介質的種類v鹽的種類和濃度鹽的種類和濃度v緩沖液緩沖液pHv溫度溫度864 4、親和層析、親和層析原理：利用配基與配體間特異性的親和力原理：利用配基與配體間特異性的親和力親和層析是最有效的生物活性物質純化方法，親和層析是最有效的生物活性物質純化方法，它對生物分子選擇性的吸附可以取得很高的純化它對生物分子選擇性的吸附可以取得很高的純化倍數。倍數。蛋白在純化過程中得到濃縮，結合到親和配基蛋白在純化過程中得到濃縮，結合到親和配基后，性質更加穩定，其結果提高了活性回收率。后，性質更加穩定，其結果提高了活性回收率。87載體選擇：載體選擇：Sepharose CL 4B, Sepharose Fast Sephar