1、第一節 遺傳變異的物質基礎第二節 質粒第三節 基因突變的規律及類型1. 突變的定義2.基因突變的特點(規律)自發性不對應性獨立性稀有性可誘變性穩定性可逆性3.證明基因突變自發性和不對應性的實驗證據4.基因突變的類型第四節 基因突變的機制1.基因突變的分子基礎自發突變誘發突變(化學誘變/物理誘變/生物誘變)2.誘變及化學致癌物質的檢測Ames實驗3.DNA損傷的修復第五節 微生物的誘變育種一、誘變育種中的幾個原則一、誘變育種中的幾個原則 指利用物理或化學誘變劑處理微生物群體細胞，促進其突變指利用物理或化學誘變劑處理微生物群體細胞，促進其突變率顯著提高，然后設法從中選取少數符合育種目的的突變株。率

2、顯著提高，然后設法從中選取少數符合育種目的的突變株。2個主要環節：個主要環節：誘變（隨機）誘變（隨機）選用合適的誘變劑和誘變劑量處理大量均勻選用合適的誘變劑和誘變劑量處理大量均勻、分散的微生物細胞，以引起絕大多數細胞、分散的微生物細胞，以引起絕大多數細胞致死的同時，使存活個體中的突變頻率大大致死的同時，使存活個體中的突變頻率大大提高。提高。篩選（定向）篩選（定向）設計有效的篩選方法，將少量正變株中的設計有效的篩選方法，將少量正變株中的優良菌株挑選出來。優良菌株挑選出來。（一）（一） 出發菌株（出發菌株（original strain）出發菌株出發菌株指用于誘變育種的起始菌株。指用于誘變育種的起

3、始菌株。 具有有利性狀（如高產、生長速度快、營養要求粗放、具有有利性狀（如高產、生長速度快、營養要求粗放、 標記明顯等）；標記明顯等）； 對誘變劑敏感對誘變劑敏感野生型菌株；野生型菌株；從生產中選育的自發突變菌株；從生產中選育的自發突變菌株；誘變獲得的高產菌株誘變獲得的高產菌株出發菌株的選擇標準：出發菌株的選擇標準：出發菌株的來源：出發菌株的來源：（二）（二） 菌懸液的制備菌懸液的制備1. 選用單細胞或單孢子懸液選用單細胞或單孢子懸液（均勻、分散）（均勻、分散）目的：目的：使每個細胞能均勻接觸誘變劑；使每個細胞能均勻接觸誘變劑； 減少表型延遲現象（誘變后性狀的分離及退化現象）減少表型延遲現象（

4、誘變后性狀的分離及退化現象）2. 同步培養同步培養（生理狀態一致）（生理狀態一致）3. 菌齡：對誘變劑最敏感時期菌齡：對誘變劑最敏感時期 營養細胞：對數期營養細胞：對數期 孢子或芽孢：萌發前期孢子或芽孢：萌發前期4.4.菌懸液的制備方法菌懸液的制備方法 物理誘變：生理鹽水配制物理誘變：生理鹽水配制 化學誘變：緩沖液配制化學誘變：緩沖液配制5. 菌懸液的濃度菌懸液的濃度 酵母菌，霉菌的孢子：酵母菌，霉菌的孢子：10106 6個個/ /mLmL 細菌，放線菌孢子：細菌，放線菌孢子：10108 8個個/ /mLmL （三）誘變劑的選擇及處理方法（三）誘變劑的選擇及處理方法1. 誘變劑的選擇（誘變劑的

5、選擇（高效，簡便高效，簡便） 物理誘變劑：物理誘變劑：頻度低，大損傷，難修復，且操作簡便；頻度低，大損傷，難修復，且操作簡便； 化學誘變劑：化學誘變劑：頻度高，點突變，易回復突變，操作麻煩。頻度高，點突變，易回復突變，操作麻煩。 ( NTG超誘變劑）超誘變劑）UV是最常用的一種誘變劑是最常用的一種誘變劑2. 劑量的選擇劑量的選擇 突變率隨劑量的增加而提高，但到達一定程度后，再提突變率隨劑量的增加而提高，但到達一定程度后，再提高劑量高劑量, 反而會使突變率下降。反而會使突變率下降。 正變較多出現在偏低劑量中，而負變較多出現在偏高劑正變較多出現在偏低劑量中，而負變較多出現在偏高劑量中。量中。 在產

6、量變異工作中，常采用相對殺菌率為在產量變異工作中，常采用相對殺菌率為7075%, 甚至甚至3070%的劑量的劑量。 UV的劑量: 固定UV功率和照射距離,以照射時間長短來確定劑量多少。最適劑量：最適劑量：在提高突變率的基礎上，既能擴大變異幅度，在提高突變率的基礎上，既能擴大變異幅度， 又能使變異向正突變范圍移動的劑量。又能使變異向正突變范圍移動的劑量。常以殺菌率來表示相對劑量（劑量-存活率曲線）3. 誘變處理方法誘變處理方法單因素處理或多因素的復合處理：單因素處理或多因素的復合處理：同一誘變劑的重復使用；同一誘變劑的重復使用；兩種或多種誘變劑的先后使用；兩種或多種誘變劑的先后使用；兩種或多種誘

7、變劑的同時使用兩種或多種誘變劑的同時使用. .（四）（四） 中間培養（中間培養（CM，培養過夜）培養過夜）目的：目的：克服表型延遲克服表型延遲表型延遲表型延遲（phenotypic lag）：表型的改變落后于基因型改變的表型的改變落后于基因型改變的 現象現象. 分離性延遲：分離性延遲： 突變的基因經突變的基因經DNA復制和細胞分裂后變成純復制和細胞分裂后變成純 合狀態，表型才能表現出來合狀態，表型才能表現出來。 生理性延遲：生理性延遲： 由雜合狀態變為純合狀態，突變表型仍不能由雜合狀態變為純合狀態，突變表型仍不能 表現出來。表現出來。分離性延遲的原因分離性延遲的原因: 對數生長期中，單核細胞常

8、出現雙核對數生長期中，單核細胞常出現雙核現象，多核細胞的核也成倍增加，誘變對數期的細胞時，突現象，多核細胞的核也成倍增加，誘變對數期的細胞時，突變通常發生在一個核上，故其變異或非變異的細胞必須經過變通常發生在一個核上，故其變異或非變異的細胞必須經過一代或幾代繁殖才能分離，這種純種變異細胞出現的推遲現一代或幾代繁殖才能分離，這種純種變異細胞出現的推遲現象稱為分離延遲現象。象稱為分離延遲現象。生理性延遲的原因生理性延遲的原因: 當變異細胞由雜合狀態變為純合狀態當變異細胞由雜合狀態變為純合狀態時時, ,由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發揮作用由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發揮作用, ,

9、必必須經過細胞多代分離后須經過細胞多代分離后, ,才能將這些非變異的酶稀釋掉才能將這些非變異的酶稀釋掉, ,最終最終達到變異后應該表現的形態達到變異后應該表現的形態, ,如營養缺陷型突變株的篩選過如營養缺陷型突變株的篩選過程。程。 生理性延遲生理性延遲:（五）突變株的篩選（五）突變株的篩選 初篩初篩 復篩復篩1. 初篩（以量為主）初篩（以量為主）（1 1）利用形態變異：）利用形態變異：需預先測定形態與產量的相關性需預先測定形態與產量的相關性（2 2）根據平板顏色反應直接挑選）根據平板顏色反應直接挑選 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）；透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）； 抑菌圈法（抗生素

10、）；抑菌圈法（抗生素）； 變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）；變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素）沉淀圈法（外毒素）透明圈直徑（透明圈直徑（H H）/ /菌落直徑（菌落直徑（C C）：）：產量高低（初篩指標）產量高低（初篩指標）2. 復篩（以質為主，定量測定）復篩（以質為主，定量測定）搖瓶培養，直接檢測所需產物搖瓶培養，直接檢測所需產物方法需簡便、快速2步步誘變育種的基本原則：誘變育種的基本原則： 選擇簡便有效的誘變劑；選擇簡便有效的誘變劑； 挑選優良的出發菌株；挑選優良的出發菌株； 處理單細胞或單孢子懸液；處理單細胞或單孢子懸液； 選用最適的誘變劑量；選用最適的誘變劑

11、量； 充分利用復合處理的協同效應；充分利用復合處理的協同效應； 利用和創造形態、生理與產量間的相關指標；利用和創造形態、生理與產量間的相關指標； 設計高效篩選方案；設計高效篩選方案； 創造新型篩選方法。創造新型篩選方法。二、幾種重要突變株的篩選方法二、幾種重要突變株的篩選方法 1. 抗性突變株的篩選抗性突變株的篩選 (1) 抗終代謝物結構類似物突變株的篩選抗終代謝物結構類似物突變株的篩選 (2) 抗藥性突變株篩選抗藥性突變株篩選 2. 營養缺陷型的篩選營養缺陷型的篩選 1. 抗性突變株的篩選抗性突變株的篩選 （1）抗終代謝物結構類似物的突變株）抗終代謝物結構類似物的突變株 用途：篩選相應代謝物

12、的高產菌株用途：篩選相應代謝物的高產菌株 （2）抗藥性突變株）抗藥性突變株 用途：篩選相應藥物用途：篩選相應藥物(抗生素抗生素) 的高產菌株或遺傳標記制作的高產菌株或遺傳標記制作 篩選的方法篩選的方法: a. 高于臨界濃度的平板進行分離； b. 梯度平板法 敏感敏感菌苔菌苔 抗性抗性菌落菌落加入含異煙肼的上層加入含異煙肼的上層 加入不含異煙肼的底層加入不含異煙肼的底層 所謂結構類似物（又稱代謝拮抗物）是指那些在結構上和代謝終產物（氨基酸、嘌呤、維生素等）相似的物質。 如：異煙肼（“雷米封”）是吡哆醇的結構類似物，利用含異煙肼梯度平板篩選異煙肼抗性突變株，可達到定向培育吡哆醇高產突變株的目的。

13、為什么在篩選突變株時,不能直接用代謝產物,而必須用其結構類似物?2. 營養缺陷型突變株的篩選營養缺陷型突變株的篩選（1）幾個概念：）幾個概念：三類培養基：三類培養基：基本培養基（基本培養基（MM, minimal mediumMM, minimal medium）-：某野生型能生長的最低成分的組合培養基。某野生型能生長的最低成分的組合培養基。完全培養基（完全培養基（CM,complete mediumCM,complete medium）+：各種營養缺陷型能生長的天然或半組合培養基各種營養缺陷型能生長的天然或半組合培養基補充培養基（補充培養基（SM, supplemental mediumSM

14、, supplemental medium）A:-+AA:-+A B:-+B B:-+B相應營養缺陷型能生長的組合或半組合培養基相應營養缺陷型能生長的組合或半組合培養基三種遺傳型：三種遺傳型：野生型（野生型（wild typewild type） 從自然界分離到的、發生營養缺陷型突變前的原始菌株。從自然界分離到的、發生營養缺陷型突變前的原始菌株。 A A+ +B B+ +, 可在可在-生長。生長。營養缺陷型（營養缺陷型（auxotrophauxotroph） 野生型菌株經誘變劑處理后，由于發生了喪失某種酶合成能野生型菌株經誘變劑處理后，由于發生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成

15、產物的培養基中才能生長的力的突變，因而只能在加有該酶合成產物的培養基中才能生長的突變菌株突變菌株（主要指合成維生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）（主要指合成維生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。 A A+ +B B- - ：能在能在+、 BB生長生長 A A- -B B+ + ：能在能在+、 AA生長生長 A A- -B B- - ：能在能在+生長生長原養型（原養型（prototrophprototroph） 營養缺陷型經回復突變或重組，回到原來野生型的營養要求營養缺陷型經回復突變或重組，回到原來野生型的營養要求 A A+ +B B+ +, 可在可在-生長生長（2）篩選步驟（）篩選步驟（5步）步）

16、誘變處理誘變處理中間培養中間培養淘汰野生型淘汰野生型檢出缺陷型檢出缺陷型鑒定缺陷型鑒定缺陷型中間培養中間培養CMCM或或SMSM培養基培養基，培養過夜培養過夜。克服表型延遲。克服表型延遲。淘汰野生型淘汰野生型即濃縮缺陷型，以提高檢出率即濃縮缺陷型，以提高檢出率方法方法 抗生素法抗生素法（G G+ +細菌細菌：青霉素；青霉素；酵母菌和霉菌：酵母菌和霉菌：制霉菌素）制霉菌素） 菌絲過濾法菌絲過濾法（絲狀真菌、放線菌）（絲狀真菌、放線菌） 饑餓培養（無饑餓培養（無N N）MM 6 612 h12 h 2N 2N培養培養(2(2N)MMN)MM 1 12 h2 h 加抗生素加抗生素( (或菌絲過濾或菌

17、絲過濾) )，培養過夜，培養過夜 營養缺陷型的檢出營養缺陷型的檢出方法夾層培養法限量補充培養法逐個檢出法影印平板法 營養缺陷型的鑒定營養缺陷型的鑒定生長譜法：生長譜法：快速，直觀快速，直觀分兩步：分兩步：a.a.三大類營養要求（氨基酸、維生素、核苷酸）的鑒定三大類營養要求（氨基酸、維生素、核苷酸）的鑒定b.b.具體到某一種營養要求的鑒定具體到某一種營養要求的鑒定( (哪一種氨基酸哪一種氨基酸, ,哪一種哪一種 維生素維生素, ,或哪一種堿基或哪一種堿基) )具體操作具體操作: :一般采用一般采用“濾紙片法濾紙片法” a. 不含維生素的酪素水解液或氨基酸混合液或蛋白胨 b. 水溶性維生素混合液

18、c. 0.1%堿水解酵母核酸液a b c三大類營養要求的鑒定：三大類營養要求的鑒定：以氨基酸缺陷為例進行說明以氨基酸缺陷為例進行說明將將1818種氨基酸按右表分為種氨基酸按右表分為6 6組組特點：特點：每每2 2組只有一種共同物質組只有一種共同物質單一營養物質要求的鑒定：單一營養物質要求的鑒定：組組別別化合物代號化合物代號115678922510111213336101415164471114171858121517691316181 3 52 4 6（3）營養缺陷型的用途）營養缺陷型的用途 生產菌 (氨基酸、核苷酸、維生素等高產菌需求)； 研究代謝途徑和雜交、轉化等遺傳規律的遺傳標記。 誘變

19、育種的程序：實驗講義誘變育種的程序：實驗講義p174 出發菌株出發菌株（純化）（純化） 前培養前培養（ CM ，培養至對數期），培養至對數期） 菌懸液制備菌懸液制備 活菌計數活菌計數 誘變預備實驗（劑量存活率曲線）誘變預備實驗（劑量存活率曲線） 誘變處理誘變處理（相對殺菌率為（相對殺菌率為70-75%，30-70%） 活菌計數活菌計數 中間培養中間培養（CM，培養過夜，克服表型延遲）培養過夜，克服表型延遲） 突變株分離突變株分離 初篩初篩 復篩復篩 生產性能試驗生產性能試驗 菌種（鑒定與）保藏菌種（鑒定與）保藏 1. 從生產中選育從生產中選育 2. 定向培育優良品種定向培育優良品種 一般指用特

20、定因素長期處理微生物群體，同時不斷地對它們進行移種傳代，以達到積累并選擇相應的自發突變株的目的。 例：卡介苗（牛型結核分枝桿菌的減毒活菌苗）三、自發突變與育種三、自發突變與育種第六節第六節 原核生物的基因重組原核生物的基因重組基因重組基因重組（gene recombination）： 將兩個不同性狀個體的基因通過一定的方式轉移到一起，并發生重新組合，產生新的遺傳性狀的過程，稱為基因重組(gene recombination)或遺傳重組。 重組重組：遺傳物質在分子水平分子水平上發生的交換；雜交雜交：在細胞水平細胞水平上遺傳物質的交換. 雜交必然包含著重組，但重組不僅限于雜交這一形式。原核生物的基

21、因重組類型原核生物的基因重組類型 4種形式：種形式：1）轉化）轉化 2）轉導）轉導 3）接合）接合 4）原生質體融合）原生質體融合一、一、 轉化（轉化（transformation）定義定義：受體細胞直接吸收供體細胞的受體細胞直接吸收供體細胞的DNA片段片段, 并與其染色體并與其染色體同源片段進行遺傳物質交換，從而使受體細胞獲得新的遺傳性同源片段進行遺傳物質交換，從而使受體細胞獲得新的遺傳性狀的現象。狀的現象。 轉化子（轉化子（ transformant）：經轉化后出現了供體性狀的受體細經轉化后出現了供體性狀的受體細胞稱為胞稱為轉化子轉化子，即轉化成功的菌落。即轉化成功的菌落。 目前已知有二十

22、多個種的G+和G-細菌具有自然轉化的能力此過程可以發生在土壤和海洋環境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。自然遺傳轉化（自然遺傳轉化（natural genetic transformation）人工轉化（人工轉化（artificial transformation）感受態細胞（competent cell） ：具有攝取外源具有攝取外源DNA能力的細胞能力的細胞1. 感受態感受態感受態：是指受體細胞最易接受外源感受態：是指受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現轉化片段并能實現轉化的一種生理狀態。一個細菌能否出現感受態是由其遺傳性決的一種生理狀態。一個細菌能否出現感受態是由其遺傳性決定的，但受環

23、境條件的影響也很大，因而表現差別很大。定的，但受環境條件的影響也很大，因而表現差別很大。 感受態因子：感受態因子：調節感受態的一類特異蛋白，它包括三種主要成分：膜相關DNA結合蛋白、細胞壁自溶素和幾種核酸酶。 自然感受態與人工感受態的不同？自然感受態與人工感受態的不同？自然感受態的出現是細胞一定生長階段的生理特性 （如肺炎鏈球菌的感受態出現在對數生長期） 受細菌自身的基因控制人工感受態則是通過人為誘導的方法，使細胞具有 攝取DNA的能力，或人為地將DNA導入細胞內。 （該過程與細菌自身的遺傳控制無關！該過程與細菌自身的遺傳控制無關！）進行自然轉化，需要二方面必要的條件：（1）建立了感受態的受體

24、細胞感受態的受體細胞（2）外源游離）外源游離DNA分子分子感受態的機理研究：感受態的機理研究：局部原生質體化假說：局部原生質體化假說：處于感受態的細胞局部失去了細胞壁，使外源處于感受態的細胞局部失去了細胞壁，使外源DNA能順利經膜能順利經膜進入菌體。進入菌體。酶受體假說：酶受體假說：受體細胞表面出現了一種能結合受體細胞表面出現了一種能結合DNA并使之進入細胞的酶。并使之進入細胞的酶。2. 轉化模型轉化模型 （1）轉化因子）轉化因子 本質是離體的本質是離體的DNA片斷或質粒片斷或質粒DNA DNA 。轉化因子進入細胞前。轉化因子進入細胞前還會被酶解成更小的片段，約還會被酶解成更小的片段，約8kb

25、。在不同的微生物中，轉化因在不同的微生物中，轉化因子的形式不同，子的形式不同，dsDNA,ssDNA.dsDNA,ssDNA. 革蘭氏陰性的嗜血桿菌中，細胞只吸收革蘭氏陰性的嗜血桿菌中，細胞只吸收dsDNAdsDNA形式的轉化因形式的轉化因子，但進入細胞后需經酶解為子，但進入細胞后需經酶解為ssDNAssDNA，才能與受體菌的基因組整，才能與受體菌的基因組整合；合； 革蘭氏陽性的鏈球菌和芽孢桿菌中，革蘭氏陽性的鏈球菌和芽孢桿菌中，dsDNAdsDNA的一條鏈必須在的一條鏈必須在胞外降解，只有胞外降解，只有ssDNAssDNA形式的轉化因子才能進入細胞。形式的轉化因子才能進入細胞。 但不管何種情況，最易與細胞表面結合的仍是但不管何種情況，最易與細胞表面結合的仍是dsDNAdsDNA。 由于每個細胞表面能與轉化因子相結合的位點有限（如肺由于每個細胞表面能與轉化因子相結合的位點有限（如肺炎鏈球菌約炎鏈球菌約1010個），因此，從外界加入無關的個），因此，從外界加入無關的dsDNAdsDNA就可競爭并就可競爭并干擾轉化作用。干擾轉化作用。 質粒質粒DNA也是良好的轉化因子，但它們通常并不能與核染也是良好的轉化因子，但它們通常并不能與核染色體組發生重組。色體組發生重組。 轉化的頻率通常為轉化的頻率通常