1、HPLC法測定民族藥露水草中-蛻皮激素的含量HPLC法測定民族藥露水草中-蛻皮激素的含量2349202103-0070-0520-羥基蛻皮甾酮20-Hydroxy ecdysterone又稱-蛻皮激素-ecdysone，是一種昆蟲的變態(tài)激素，可用于防治害蟲及提高蝦蟹產(chǎn)量1。化學(xué)式為C27H44O72。其不僅能促進昆蟲變態(tài)，還具有許多藥理活性3。具有促進細(xì)胞生長、刺激真皮細(xì)胞分裂、產(chǎn)生新的生命細(xì)胞和生殖細(xì)胞的作用4。還可促進動物的生長發(fā)育，促進細(xì)胞增殖分化，促進蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪代謝，愛護神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝臟等成效5。其主要作用是促進核酸和蛋白質(zhì)的合成，影響糖代謝和脂類代謝，免疫調(diào)整

2、機體。高劑量的蛻皮激素能擾亂昆蟲體內(nèi)的正常代謝過程，所以用于防治害蟲6。在運動保健方面，-蛻皮激素具有顯著的通過增加氨基酸裝配成蛋白鏈，從而刺激肌肉細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)合成的能力，而且該能力回溯至蛋白質(zhì)生長的轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)移的過程7。蛻皮甾酮類甾體化合物廣泛的存在于不同科屬的植物中8。迄今為止，露水草是昆明植物所聶瑞麟先生發(fā)覺的自然界中含植物甾酮類成分最豐富的藥用植物之一9。本次試驗選用露水草為提取原料。露水草Cyanotis C.B.Clark又名珠寶露水草、換肺散、雞冠參等，為鴨跖草科Commelinacede藍(lán)耳草屬多年生宿根性草本，分布于中國、印度、斯里蘭卡及中南半島，我國主要分布于云南、貴州、廣

3、西、廣東、福建、臺灣等省區(qū)海拔11001700 m的山溝、山坡林緣或林中10。綜合試驗室條件等各種緣由，此次試驗接受高效液相色譜法HPLC測定-蛻皮激素的含量。1儀器與試藥1.1儀器梅特勒托利多萬分之一電子天平型號 MS204;電熱鼓風(fēng)枯燥箱型號 101-0EBS;超聲清洗儀器型號 CPXS800H-C;安捷倫高效液相色譜儀型號 1260 DAD UV檢測器。1.2試藥露水草全草干草;-蛻皮甾酮對比品批號：111638-202104，含量以按95.8%計，中國食品藥品檢定討論院;乙腈、甲醇色譜純;其他化學(xué)試劑為分析純;水為超純水。2方法條件的選擇與結(jié)果2.1檢測波長確實定周密稱取-蛻皮甾酮對比

4、品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，搖勻，即得濃度為每1 mL含-蛻皮甾酮0.5001 mg的對比品貯備液。周密吸取上述溶液3 mL置50 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對比品溶液濃度為30 g/mL。取樣品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超聲40 min，取出，放冷至室溫，定容至刻度，作為供試品溶液。取上述供試品溶液及對比品溶液，在乙腈-水15：85、乙腈-甲醇-水14：28：58、甲醇-水40：60三種流淌相中分別進樣，DAD UV HPLC色譜儀在波長200600 nm掃描，得出最大汲取波長。結(jié)果顯示對比品溶液及供試品溶液均在=248 nm處有最大汲取

5、，且無雜峰干擾，因此后續(xù)試驗檢測波長確定為248 nm。2.2色譜柱的選擇選用4.6 mm×250 mm，粒徑5 m色譜柱測量時，保存時間接近半小時，用時過長，且保存時間波動較大，峰面積不穩(wěn)定，所以選擇4.6 mm×150 mm，粒徑5 m色譜柱，短柱保存時間在5 min左右，相比之下，縮短了試驗時間，且峰面積與長柱相比較穩(wěn)定。選擇出4.6 mm×150mm色譜柱。2.3樣品提取方法的選擇本試驗接受超聲提取40 min、振蕩提取40 min及索式提取至無色三種方式進行提取，結(jié)果顯示接受索式提取-蛻皮甾酮含量相對較高;但預(yù)試驗時索式提取四份樣品周密度較差，提取近14

6、 h才至無色比較費時且存在溫度難控等因素，相較于超聲及振蕩提取，-蛻皮甾酮含量相近，但考慮到操作性，最終接受超聲提取。2.4提取溶劑確實定本試驗接受甲醇、乙醇兩種溶劑通過超聲提取40 min、振蕩提取40 min及索式提取至無色三種提取方式提取，三種提取方式結(jié)果都顯示甲醇溶劑提取時含量相對較高，最終確定接受甲醇溶劑提取。2.5流淌相確實定預(yù)試驗時標(biāo)準(zhǔn)品以及三種方法提取所得的樣品都分別在檢測波長248 nm，三種流淌相乙腈-水15：8511、乙腈-甲醇-水14：28：58、甲醇-水40：6011條件下進樣。通過對比保存時間、色譜汲取峰峰型以及峰面積，乙腈-水15：85為流淌相時出峰時間相對另外兩

7、種較長;乙腈-甲醇-水14：28：58為流淌相時分別度達(dá)不到要求;甲醇-水40：60為流淌相時保存時間相對較短，峰形較好，峰面積較穩(wěn)定，所以確定以甲醇-水40：60為流淌相。 2.6柱溫確實定試驗期間，環(huán)境溫度的改變對保存時間影響較大，不同的環(huán)境溫度會導(dǎo)致保存時間的波動。溫度降低時，保存時間提前，溫度升高時保存時間往后延，最大與最小保存時間相差超過0.5 min，所以將柱溫從30 調(diào)為35 ，且保持進樣過程中環(huán)境溫度波動較小，此條件下進樣，保存時間仍有改變，但在0.4 min范圍內(nèi)，峰面積改變有較大改觀。3溶液的配制3.1樣品溶液樣品前處理：將露水草植物樣品打粉后過3號篩50目，備用。取露水草

8、樣品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超聲40 min，取出，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 m微孔濾膜濾過，即得。3.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液3.2.1濃度為0.5000mg/mL對比品溶液周密稱取-蛻皮甾酮對比品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，搖勻，即得濃度為每1 mL含-蛻皮甾酮0.5001 mg的對比品貯備液。3.2.2濃度為0.2000mg/mL對比品溶液周密稱取-蛻皮甾酮對比品41.75 mg，甲醇定容至200 mL量瓶，得0.2000 mg/mL對比品溶液。3.3陰性對比溶液取不含-蛻皮甾酮的空白樣品，照供試品溶液制備方法制備，即得陰性對比溶液

9、。4色譜條件色譜柱：Agilent Extend-C18柱4.6 mm×150 mm，粒徑5 m，柱溫：35 ;流淌相：甲醇-水40：60;流速1 mL/min;進樣量5L;檢測波長：248nm。5檢測方法及結(jié)果5.1專屬性考察根據(jù)上述色譜條件，分別吸取三一、二、三項下溶液即供試品溶液、對比品溶液陰性對比溶液，各5 L注入色譜柱，采集色譜圖。陰性對比品色譜在對比品出峰位置上無干擾峰，即本試驗條件下對測定干擾較小，系統(tǒng)誤差較小。對比品圖譜-蛻皮甾酮Rt=5.166 min。樣品圖譜-蛻皮甾酮Rt=5.091 min，且它們的分別效果都良好。5.2線性范圍考察取三.二.1中0.5001

10、mg/mL的對比品貯備液，周密量取8 mL置10 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，照此方法依次稀釋，得到濃度為0.400 mg/mL、0.300 mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.050 mg/mL、0.025 mg/mL對照品溶液。吸取上述各濃度的對比品溶液及0.5001 mg/mL的對比品溶液分別進樣5 L;按上述色譜條件測定峰面積，每個濃度各進樣2針。結(jié)果見表1。以-蛻皮甾酮濃度Cmg/mL為橫坐標(biāo)，平均峰面積A為縱坐標(biāo)，進行線性回來。線性回來方程為：y=7569x+9.858，r=0.9999x：mg/mL，結(jié)果說明，在0.025 mg/mL0.5 mg

11、/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。5.3重復(fù)性按3.1項下操作，平行配制6份供試品溶液，按上述色譜條件測定，每份進樣2次。結(jié)果-蛻皮甾酮的峰面積無顯著差異，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.4%RSD值2%，說明該方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表2。5.4周密度按3.2.1項下操作分別配制兩份濃度為0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，每份重復(fù)進樣5次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD值分別為0.2%和0.3%，小于2%，故本試驗的周密度滿足要求的規(guī)定。結(jié)果見表3。5.5穩(wěn)定性取同一供試品溶液按上述色譜條件在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進樣5 L，測定峰面積及RSD，結(jié)果峰

12、面積改變不大，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.6%，小于2%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)沒有明顯的改變是穩(wěn)定的。結(jié)果見表4。5.6樣品含量測定按3.1項下操作制備供試品溶液3份，按上述色譜條件測定，每份進樣2次，計算含量本品含量按枯燥品計算結(jié)果如表5。5.7加樣回收率試驗周密稱取已知含量的露水草樣品6份每份約取0.1 g，再分別周密加入3.2.2項下對比品溶液25 mL，超聲40 min，取出，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過，按上述色譜條件測定，每份進樣2次，測得回收率介于100.0%105.0%之間，RSD值為1.0%2%，說明回收率良好，結(jié)果見表6。6結(jié)論本試驗接受DAD UV HPLC色譜法測定樣

13、品中-蛻皮甾酮的含量，本檢驗方法得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)為0.9999，周密度的RSD值小于2%，重復(fù)性的RSD值0.4%，樣品含量為0.0543g/g，加標(biāo)回收率在100.0%105.0%間。該方法適用于-蛻皮甾酮的含量測定7商量7.1檢測波長確實定測定進行前，汲取波長的選擇至關(guān)重要。為確定-蛻皮甾酮含量測定的檢測波長，通過DAD UV高效液相色譜儀及紫外可見分光光度計掃描確定。紫外可見分光光度計檢測以甲醇為空白對比，取對比品溶液及供試品溶液，在200400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果對比品溶液在240 nm處有最大汲取波長，供試品在248 nm處有最大汲取;DAD UV高效液相色譜儀測定時在200600 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果對比品溶液及供試品溶液均在248 nm處有最大汲取。此時存在差異，但由于時間緣由及本試驗