1、植物熱激蛋白90的分子作用機理及其利用研究進展裴麗麗1,2，徐兆師1*，鄭天慧尹麗娟1，李連城1，陳 明1，郭玉華2*，馬有志1（1中國農業科學院作物科學研究所/國家農作物基因資源與基因改良重大科學工程/農業部作物遺傳育種重點開放實驗室，北京 100081；2沈陽農業大學農學院，遼寧沈陽 110866）摘要：熱激蛋白90（heat shock protein 90，HSP正文HSP都是大寫，參考文獻有的是Hsp？ 兩種表示方法都是正確的90）廣泛介導了脅迫信號的傳遞，在控制人體細胞正常生長和促進腫瘤細胞發育中起著重要作用；目前，HSP90已成為細胞免疫、信號轉導以及抗腫瘤研究的前沿課題。植物H

2、SP90的生理功能研究起步較晚，最近的研究發現，HSP90在植物發育、脅迫環境的應答以及抗病性中起著重要作用。本文從HSP90的分子生物學角度功能進行討論，系統地綜述了近幾年植物HSP90分子作用機理研究的最新進展，以及在改良植物抗性上的功能應用，以期為通過基因工程方法改良作物抗性提供理論基礎參考。關鍵詞：植物熱激蛋白90HSP90；分子特性；作用機理；抗病性；非生物脅迫抗性Molecular Mechanism and Application of HSP90 in PlantsPEI Li-li1,2, XU Zhao-shi1, ZHENG Tian-huiYIN Li-juan1, L

3、I Lian-cheng1, CHEN Ming1, GUO Yu-hua2, MA You-zhi1（1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding of Ministry of Agriculture, Beijing 100081; 2College of Agronomy

4、, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866）Abstract: Heat shock protein 90 (HSP90) widely mediated stress signal transduction, and plays an important role in the control of normal growth of human cells and in the promoting tumor cell development. At present, HSP90 has become forefront proje

5、cts of cellular immunity, signal transduction and anti-cancer investigation. The physiological function of HSP90 start later in plant than in animal and fungi. Recent researches revealed that plant HSP90 plays an important role in development, environmental stress response and disease resistance. Th

6、is paper discussed the molecular functions of HSP90, and systematically reviews latest progresses on molecular mechanism of plant HSP90 as well as improvement of plant resistance to facalitate broaden work.Key words: Plant HSP90; Molecular characteristic; Mechanism of action; Disease tolerance; Abio

7、tic stress resistance收稿日期：基金項目：國家自然科學基金項目（31171546）；轉基因生物新品種培育重大專項（2009ZX08009-083B）。作者簡介：裴麗麗（1986-），女，山西平遙人，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。通訊作者：徐兆師（1976-），男，山東膠南人，副研究員，博士，碩士生導師，研究方向為植物抗逆分子生物學。TelE-mail：xuzhaoshi；郭玉華（1957-），女，遼寧沈陽人，教授，博士，博士生導師，研究方向為水稻遺傳育種。TelE-mail：guoyuhua2006。Mo

8、lecular Mechanism and Application of HSP90 in PlantsPEI Li-Li1,2, XU Zhao-Shi1*, ZHENG Tian-Hui1, LI Lian-Cheng1, CHEN Ming1, GUO Yu-Hua2*, and MA You-Zhi11Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key La

9、boratory of Crop Genetics and Breeding of Ministry of Agriculture, Beijing 100081; 2College of Agronomy, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866.Abstract: Heat shock protein 90 (HSP90) widely mediated stress signal transduction, and plays an important role in the control of normal growth o

10、f human cells and in the promoting tumor cell development. At present, HSP90 has become forefront projects of cellular immunity, signal transduction and anti-cancer investigation. The physiological function of HSP90 start later in plant than in animal and fungi. Recent researches revealed that plant

11、 HSP90 plays an important role in development, environmental stress response and disease resistance. This paper discussed the molecular functions of HSP90, and systematically reviews latest progresses on molecular mechanism of plant HSP90 as well as improvement of plant resistance to facalitate broa

12、den work.Key words: Plant HSP90; Molecular characteristic; Mechanism of action; Disease tolerance; Abiotic stress resistance熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）廣泛分布于真菌、動物和植物細胞中，在高溫脅迫環境下，熱激蛋白合成顯著增加，在生物細胞熱應激反應中發揮重要作用1。在正常生理狀態下，HSPs主要存在于細胞質中；應激狀態時，HSPs迅速進入細胞核和核仁行使功能。按照分子量大小可以分為不同的家族，包括HSP110、HSP90、HSP70/HSP8

13、0、HSP60和小分子量HSP（smHSP）等2。Horwit31992年最早提出smHSP作為分子伴侶（molecular chaperones）的理論?，F已證明HSP90、HSP70和HSP60都具有分子伴侶的作用。最近的研究結果顯示，高分子量HSP90可能在生物脅迫應答反應中起重要作用。HSP90在分子進化上高度保守，參與調控、維持細胞內多種蛋白的構象和功能，使細胞在脅迫環境下正常存活4。在真菌和動物中，HSP90廣泛介導了脅迫信號的傳遞，參與類固醇激素受體、激酶和轉錄因子的折疊、并激活底物，起始脅迫信號的傳遞5-8。最新研究發現，HSP90在控制人體細胞正常生長和促進腫瘤細胞發育中起著

14、重要作用8-9。很多癌基因蛋白均為HSP90的作用靶點，單一抑制HSP90能同時產生多路徑抗腫瘤效應10-11；抑制HSP90的活性能促進癌基因蛋白的降解，有助于癌癥治療6,8,12,-14參考文獻13未列出！。HSP90抑制劑有助于阻斷細胞分裂，減慢腫瘤擴散；目前，臨床上正在測試HSP90抑制劑治療腫瘤的效果15。HSP90已成為抗腫瘤研究的前沿課題。然而，植物HSP90的生理功能研究起步較晚，。目前，HSP90在植物中的脅迫應答機理、分子伴侶的作用及其在提高植物抗逆性的功能尚不明確。最近，在擬南芥、煙草和水稻上的研究發現，HSP90在植物發育、對脅迫環境的應答以及抗病性中起著重要作用16。

15、據報道，HSP90可能在植物基因型變異到形態變化的轉換中處于核心位置17。因此，深入研究植物HSP90在逆境條件下的功能，對正確認識脅迫信號的傳導、抗逆相關基因的調控以及提高作物的抗逆性有著重要的指導意義和實際應用價值。本文綜述了近幾年植物HSP90分子作用機理研究的最新進展，以期推動植物熱激蛋白研究工作的展開。1 HSP90的結構機理HSP90是一種高度保守并普遍存在于原核以及真核生物細胞中的分子伴侶，為真核生物生長發育所必需，。正常條件下HSP90約占總蛋白的1%2%，脅迫條件下可高達4%-6%5,18。HSP90能輔助蛋白的折疊、激活和成熟，并改變和維持參與信號轉導的蛋白構象，在細胞的生

16、長過程中起著重要的作用4，因此HSP90功能的喪失會造成細胞的多種生理活性缺陷。HSP90是一個受ATP調節的二聚體分子伴侶，幾乎所有HSP90家族成員的結構都很保守（圖1），每個單體含有3個結構域：，即N端高度保守的ATPase結構域、，中間結構域（M）和介導HSP90二聚化的C端結構域18-, 3118-31?。ATP bindingNCharged regiondimerizationMCSubstrate binding圖 1 HSP90的結構模型Fig. 1 A structural model of HSP90N：HSP90 N端結構域；M：HSP90中間結構域；C：HSP90 C

17、端結構域HSPsp90 consists of three domains: an N-terminal ATP-binding domain (N); a middle domain (M); and a C-terminal dimerization domain (C) with the pentapeptide MEEVD sequence. A charged region exists between the N and M domains. All three domains are reported to interact with substrate proteins.HSP

18、90的N端ATPase結構域是ATP/ADP結合位點，具有內源ATPase活性；。在ATP存在的情況下會發生構象變化，進而參與信號轉導、蛋白折疊以及形態進化等（圖3）。突變的結果顯示ATPase活性是HSP90執行生物功能所必須需的31-32。一些自天然物質，如格爾德霉素（Geldanamycin）與這個位置高度親和，干擾HSP90的功能，并且促進蛋白激酶的迅速降解33。HSP90中間結構域在HSP90結合底物蛋白過程中起了關鍵的作用。HSP90與二型拓撲異構酶DNA促旋酶B（GyrB）構成機理的相似性也說明了中間結構域是底物蛋白的主要結合位點。中間結構域有一個接觸反應環可以感知ATP-磷酸鹽

19、的存在并進攻。研究表明，單獨的N端結構域是沒有ATPase活性的，維持其完整活性需要中間結構域的參與34-35。HSP90的C端結構域是自身的二聚化位點、鈣調蛋白結合位點和底物蛋白結合位點。真核生物細胞質HSP90的C端有一個保守的五肽結構（MEEVD），含有tetratricopeptide repeat （TPR）結構域的蛋白就是通過五肽結構識別HSP90并與之結合，從而使HSP90發揮不同的作用，這與HSP70末端8八個氨基酸殘基（GPTIEEVD）與TPR的互作機理非常相似 6,31。另外，真核細胞HSP90的N端結構域和中間結構域之間有一段荷電區，由大約50個氨基酸殘基組成36參考文

20、獻37未列出！。荷電區對于HSP90的功能可有可無，主要是起到共價連接、協作助N端結構域和中間結構域的作用，以維持HSP90的ATP結合狀態的構象。據報道，HSP90的3個結構域（N端、M端和C端）都參與了與底物蛋白的互作31。最近，Terasawa等31和Zuehlke和Johnson等8總結了HSP90與底物蛋白互作的一般原理，認為沒有結合ATP的HSP90二聚體處于開放狀態，可以通過分開的兩個單體N端結構域來捕獲底物蛋白；當N端結合ATP后蛋白構象發生變化，兩個分開的N端會短暫的聯合，HSP90分子夾閉合，形成環狀結構，底物蛋白也被包裹在夾內。HSP90通過與底物蛋白結合，維持所謂“無活

21、性穩態”。真核生物HSP90需要輔蛋白和調控因子來調節自身與底物蛋白之間的相互作用，并賦予HSP90各種生理活性（圖2）。HSP90的底物絕大多數是參與信號傳遞的激酶和或轉錄因子6，底物構象的維持都需要HSP90的參與。動物HSP90廣泛參與了信號傳遞蛋白的合成、折疊以及DNA的修復，其重要性日益突顯4,6,8,37-38。尤其HSP90作為抗腫瘤藥物格爾德霉素的靶基因被報道以來33，在臨床上受到越來越多的關注。然而，對植物HSP90的生物功能的研究較少，普遍認為與細菌、酵母及動物中的HSP90相似，主要參與協助蛋白折疊、蛋白復合體的裝配和降解、激活底物或底物蛋白的生物活性等。TPR prot

22、ein(Hop/Stil, CHIP, UNC-45, FKBP51/52, CyP40, PP5, XAP2)HSP70/40P23Cdc37AhalKinasesTranscription factorsEnzymesCytoskeletonCell cycleGrowthApoptosisCancerStressDevelopmentEvolutionGenetic variationHSP90Co-chaperonesClientsProcessors圖2 HSP90和輔蛋白通過與底物蛋白之間的互作在不同細胞發育過程中發揮作用4,6,28Fig. 2 Functions of HSP9

23、0 and co-chaperones by interaction with substrates in different developmental phases in cells 4,6,282 HSP90廣泛參與植物生長發育過程HSP90主要定位于細胞質，也有少部分存在于內質網、線粒體和葉綠體等亞細胞器中19。HSP90通常以同源二聚體形式存在，在應急狀態下合成增加，。目前已經從多種植物中克隆出HSP90基因。Marrs等20從玉米中分離到兩個HSP90基因，對其表達模式和啟動子進行了分析，然而其功能和作用模式未見報道。目前對擬南芥HSP90家族研究的較多，擬南芥中存在7個HSP90

24、成員：AtHSP90-1/-2/-3/-4/-5/-6/-7。其中，AtHSP90-2/-3/-4之間的蛋白序列高度相似，同源性高達96%，在功能上可能是冗余的。AtHSP90-1/-2/-3/-4在氨基酸序列的C末端含有特異的定位信號MEEVD，定位于細胞質；AtHSP90-5/-6/-7由N端的信號肽引導分別定位于葉綠體和線粒體中；AtHSP90-7含有C端KDEL內質網定位信號序列，定位于內質網上21-22。HSP90在植物生長發育進程中起著至關重要的作用，其功能殘缺會引起植物生長形態畸形和生理特性的改變4,6。Queitsch等23用格爾德霉素（geldanamycin，GA）抑制擬南

25、芥HSP90的表達，導致擬南芥的表現型發生了變化，包括偏上性的子葉、圓盤或放射狀對稱的子葉及生長不正常的根毛23。擬南芥的HSP90-RNAi株系的的擬南芥子葉中積累較多的紫色素，真葉發育時間延遲而且葉形變窄，成株則表現為頂端優勢喪失，多個原初花序同時發生，莖分生組織發育異常，蓮座葉數量增多，開花時間延遲24。AtHSP90-5突變導致擬南芥對紅光應答、氯酸鹽抗性的改變和cr88突變體中組成型的葉綠體發育？的延遲25。AtHSP90-7的缺失導致擬南芥莖尖分生組織和花頂端分生組織膨大，根尖分生組織呈雜亂無序狀，花粉管不能伸長。推測AtHSP90-7參與CLAVATA蛋白的折疊與組裝，從而調控植

26、物CLV基因的活動，進而參與擬南芥分生組織的活動26。HSP90參與了植物胚的發育和種子萌發過程。Prasinos等27研究發現，AtHSP90-1在種子胚發育接近成熟時表達量劇烈增加，而AtHSP90-3則是在角果伸長期呈微弱穩定增長趨勢，在胚接近成熟時略有下降，。說明HSP90在種子胚的形成和種子萌發過程中起調節作用，在不同的發育時期各成員的主次地位和作用各不相同。最近發現，HSP90還影響擬南芥下胚軸的伸長28。綜上，HSP90可能廣泛參與了植物的生長發育過程。在動物細胞質中的HSP90有兩種亞型：，HSP90和HSP90。其中，HSP90易受熱誘導，而HSP90易受有絲分裂誘導。在AT

27、P協助下，HSP90主要幫助受損蛋白的轉運、折疊，防止聚集并恢復其正常構象；HSP90與類固醇激素利用有關29。HSP90在原核生物中的功能與真核生物不同，HSP90在但對原核生物的生長發育過程中也是不必要的30。3 HSP90介導了植物抗性在正常生理狀態下，細胞蛋白的折疊并不需要HSP90的參與；，脅迫條件下HSP90可以促使損傷蛋白的修復。熱激逆境會導致包括HSP90在內的很多HSP基因大量瞬時表達，這種表達受熱激因子（Heat shock factor，HSF）的調控。HSP誘導的調控主要是在轉錄水平上。在HSP基因啟動子上有熱激元件（Heat shock element，HSE），為H

28、SF結合位點。在正常狀態下，HSF以單體和HSP90二聚體相結合；在脅迫環境下，HSP與HSF分離去處理變形蛋白，激活的HSF結構發生變化，轉化為三聚體形式緊密結合于HSE元件上，從而啟動使HSP基因的轉錄39-40。不僅熱激能誘導HSF的表達，其它如氧化、重金屬和病蟲害等許多逆境都能激活HSF的轉錄，從而進一步調控HSP的表達41。3.1 HSP90與植物抗病蟲性近幾年來發現，HSP90介導了植物的抗病信號傳導途徑。植物免疫由可識別病原體分子的Resistance（R）蛋白介導。植物HSP90與SGT1(suppressor of G2 allele of suppressor of kin

29、etochore proteinl)及RAR1(required for MLAl2 resistanceI)間的互作對R蛋白的活性穩定及植物對病原菌的識別起了很重要的作用。植物SGTl通過CS區域和TPR區域分別同HSP90的ATP酶區域和C末端互作，通過富含亮氨酸的重復區域(1eucine rich repeat，LRR)和R蛋白互作；RARl則同HSP90的ATP酶區域相互作用42。擬南芥HSP90復合物直接調控了抗病蛋白的活性，在R基因介導的抗病性中起著關鍵作用43。AtHSP90-2突變體植株都表現出R蛋白RPM1介導的抗病性受到削弱的現象44。HSP90在對番茄R基因Pto介導的丁

30、香假單胞桿菌抗性是必需的45。煙草HSP90與RAR1和TIR-NB-LRR蛋白互作，賦予植株煙草花葉病毒（TMV）抗性46。用BSMV-VIGS技術證實，SGTl、RARl和HSP90是否要斜體？基因分別在大麥Mla13介導的白粉病抗性和小麥Lr21介導葉銹病抗性中是必需的47-49。據推測，植物的抗病性可能也受FKBPs（FK506 binding proteins）和具有TPR結構域的輔蛋白的影響50。近幾年發現，HSP90還參與了植物的抗蟲信號傳導途徑。番茄Mi-1蛋白含有核苷酸結合位點（nucleotide-binding site，NBS）和LRR基序，介導了對根結線蟲、馬鈴薯蚜蟲

31、和白粉虱的抗性。用VIGS技術分別敲除降低SGTl、RARl和或HSP90的表達后，發現敲除降低SGTl和HSP90的表達減弱了番茄Mi-1介導的對根結線蟲和馬鈴薯蚜蟲的抗性，而RARl對這種抗性不是必需的51，這為SGTl和HSP90在番茄Mi-1介導的抗病蟲中提供了資料。3.2 HSP90與植物非生物脅迫抗性植物HSP90的轉錄表達受各種逆境脅迫的誘導。在受到熱、鹽和重金屬脅迫后，擬南芥HSP90表達量顯著增加52-53；水稻HSP90受到鹽、干旱、低溫和ABA的誘導后也出現大量積累52,54-55。這表明植物HSP90介導參與了植物對非生物脅迫中信號途徑的響應過程，但是具體的抗逆機制還不

32、清楚。最近研究表明，胞質HSP90特異性阻斷劑誘導了擬南芥熱誘導基因的累積和熱適應性56-57。在正常環境下，胞質HSP90.2通過抑制HSF的功能，負向調控熱誘導基因的轉錄；。熱激環境下，胞質HSP90.2瞬時失活，HSF被激活，從而調控含有HSE（heat shock response element）元件的下游基因的表達56。隨后，Nishizawa-Yokoi等57證實HSP90.2的過表達抑制了HsfA2轉錄；。相反，HSP90.2的抑制誘導了HsfA2轉錄，以適應氧化脅迫。McLellan等58得出了類似的結論，根基菌產生的HSP90抑制劑（radicalisin ？mo

33、nocillin I, MON）影響了植物的生長發育，增強了擬南芥的耐熱性58。上述研究表明，植物HSP90在植物適應逆境環境過程中起著重要的作用。雖然植物HSP90參與了非生物脅迫響應，但是轉基因改良植物抗性的研究并不多。劉大麗等59利用差異顯示法從水稻中克隆的到HSP90熱激蛋白90基因rHSP90，rHSP9基因？的過表達明顯提高了煙草在鹽脅迫下的生長勢。在酵母中，HSP90通過HOG和MAPK途徑分別參與酵母高滲和細胞壁脅迫過程60。植物中也存在MAPK脅迫信號途徑，但是HSP90是否通過這條途徑參與抗非生物逆境過程尚不清楚。與動物作用機理類似，植物輔蛋白調控了胞質HSP90的ATP酶

34、活性，協同HSP90與底物蛋白互作。擬南芥FKBP(FK506 binding protein)家族成員ROF1(FKBP62)通過TPR結構域與HSP90.1結合61。正常環境下，ROF1-HSP90.1復合體定位到細胞質中；，而在熱脅迫環境下，ROF1-HSP90.1與HsfA2互作形成ROF1-HSP90.1-HsfA2復合體遷移到細胞核中，調控sHSP的轉錄表達，增強耐熱性62。與ROF1作用模式相反，基因沉默ROF2(FKBP65，ROF1同源蛋白)基因增強了植株的耐熱性，ROF2的核定位活性不依賴于HSP90.1或HsfA2，負向調控HsfA2的激活活性，抑制sHSP的轉錄表達63

35、。4 植物HSP90的研究展望在動物和真菌中，HSP90廣泛介導了脅迫信號的傳遞，參與轉錄因子和蛋白激酶的折疊；。人類HSP90的高表達與腫瘤的發生、發展密切相關，其機制可能是增強了腫瘤細胞抗凋亡能力，。HSP的抗體或反義HSP為癌癥的治療提供了新的思路。越來越多的證據表明，HSP90受磷酸化的調控，然而目前對調控的作用機理尚不明確。近年來人們對HSP90分子結構和功能有了深入了解，發現了一些酵母和動物HSP90的互作蛋白，這對深入了解HSP90的功能及其作用機制是非常有益的。真核生物HSP90需要輔蛋白和調控因子來調節自身與底物蛋白之間的相互作用，并賦予HSP90各種生理活性。輔蛋白對于胞質

36、HSP90的功能起著關鍵作用，調控胞質HSP90的ATP酶活性，協同HSP90與底物蛋白的互作8, 37。與HSP90互作的輔蛋白大部分為TPR蛋白，主要依賴于TPR結構域與HSP90的C端保守五肽MEEVD結合。盡管植物中存在大量的TPR蛋白，但尚未見過與HSP90互作的植物TPR蛋白的報道。最近發現，Hsp90-p23與hTERT（telomerase reverse transcriptase）互作調控了端粒酶的活性功能，以維持端粒的正常運行64。另外，HSP90與親環素A（CypA）選擇性促進靶蛋白的遷移，但具體機理尚不清楚65。（此段不清楚展望什么？）植物HSP90的功能和作用機制的

37、研究起步較晚，雖然HSP90以及HSP90伴侶復合體在酵母、動物和植物中的功能非常保守，但實驗證明，底物不盡相同。目前，HSP90在植物中的脅迫應答機理、分子伴侶的作用及其在提高植物抗逆性過程中的功能尚不明確，極少見到HSP90伴侶復合體生理學功能的報道。近幾年發現，HSP90具有抵御植物疾病害以及遺傳緩沖機制的作用，此發現拓寬了人們對HSP90的認識并引起了研究者們的極大興趣。但植物HSP90潛在的具有普遍意義的重要作用尚未發現；，特別是植物HSP90系統的特性、定位于不同細胞器的HSP90功能和作用機制，以及HSP90在植物抗病蟲和非生物脅迫過程中的具體途徑還有待于進一步研究。環境脅迫、植

38、物抗性與HSP90之間的相互作用及分子機制的解析，對深入理解植物抗逆分子機理和作物抗逆分子育種具有重要的理論和實踐意義。References參考文獻SP有小寫也有大寫是根據原文章的題目而定。補充參考文獻標識代碼，期刊名不要斜體,參考文獻59改為中文1 Lindquist S. The heat-shock responseJ. Annu Rev Biochem, 1986, 55: 1151-11911151-11912 Lindquist S, Craig E A. The heat-shock proteinsJ. Annu Rev Genetics, 1988, 22: 6316773

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