1、運城職業技術學院課程教學設計實施方案項 目3.細菌的檢驗任 務2.飲料中菌落總數檢驗授課教師成少寧、喬冬授課地點綜B106 授課方法理實一體化課 時2.0教學內容國標的查找方法、所需滅菌物品數量的確定方法、方案的制定方法實施步驟1.“六個一”企業案例（微生物快速檢測系統）介紹 5min 微生物快速檢測系統，可以檢測固態、液態、表面、膏狀、漿狀樣本；樣品檢測時無需任何的前處理過程，直接丟入檢測瓶即可，檢測后的檢測瓶自帶殺菌功能；檢測樣品只需0.1-1mL(0.1-1g);靈敏度高達可檢測1目標微生物，特異性高達99.999%;操作步驟簡單，只需三個操作步驟，無需專業技術人員；儀器便攜式，可直接連

2、電腦出定量分析檢測報告。檢測范圍：活菌總數、大腸桿菌、大腸菌群、腸道桿菌科、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、腸球菌、乳酸桿菌、亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌、霉菌（曲霉屬真菌、曲霉菌）、酵母菌，共13種菌。應用范圍：食品、廚房、工具、表面、水質、疾病控制、進出口檢驗檢疫、藥品及化妝品。可以在咖啡館、餐廳、農產品及相關的加工公司、分析實驗室、藥廠、藥房、化妝品廠、環境檢測機構、水配送公司、制水廠等。2.下發任務書，布置任務： 5min 學生分組，每5-6人為一組進行飲料中菌落總數檢驗國標的查找、討論實驗方案、制定實驗實施方案。3.教師介紹國標的查找方法，學生查找國標（課前完

3、成） 5min食品伙伴網標準下載輸入關鍵詞“食品 菌落總數”點擊“搜索”“現行有效”與“已作廢”選擇 “現行有效”標準進行下載4.學生分組討論實驗方案，每組寫出一份實驗實施方案 50min要求：（1）確定需滅菌的玻璃器皿的種類與數量，需要從實驗步驟中進行提煉（共需內裝9毫升生理鹽水的試管4支、1毫升吸管4支、25毫升吸管1支、內裝225毫升生理鹽水的三角瓶1個，培養皿8套）；（2）根據培養皿的套數計算所需的培養基的量，并相應計算培養基中各個成分的含量；（3）計算需配制生理鹽水的量，并計算氯化鈉的含量；（4）根據實際操作過程寫出詳細的實驗實施方案。5.學生分組上交實驗實施方案，教師對每組的方案進

4、行評價和補充 25min（1）共需內裝9毫升生理鹽水的試管4支、1毫升吸管4支、25毫升吸管1支、內裝225毫升生理鹽水的三角瓶1個，培養皿8套；（2）培養基250ml，其中胰蛋白胨1.25 g；酵母浸膏0.625 g；葡萄糖0.25 g；瓊脂3.75g；蒸餾水250mL；（3）生理鹽水500ml，氯化鈉4.25克；（4）實際操作過程：培養基制備生理鹽水制備玻璃器皿包扎滅菌稀釋樣品倒平板培養注：本次任務未結束，在任務結束后布置作業。設備、工具及材料教案，教學設計方案，課程標準，教學案例考 核備 注運城職業技術學院課程教學設計實施方案項 目3.細菌的檢驗任 務2.飲料中菌落總數檢驗授課教師成少寧

5、、喬冬授課地點綜B106 授課方法理實一體化課 時2.0教學內容培養基的制備方法和滅菌方法實施步驟1.“六個一”企業案例（微生物快速檢測方法）介紹 5min 此類方法是在比相應的傳統方法在短的時間內可以得出結果。此類方法的典型例子是：膜過濾一微菌落一熒光法。具體方法是將一定量的樣品(或樣品稀釋液)經膜過濾(過濾膜045m)，再將過濾膜放在培養基上或放在浸過液體培養基的厚紙板上，在適宜溫度條件下培養一段時間，然后將膜放在浸過0.1ANS(8一苯胺基萘磺酸鎂)溶液的紙片上作用10分鐘，將膜揭下，在80條件下干燥 510分鐘，最后在100倍的熒光顯微鏡(入=340 380nm)下計數藍綠色菌落的數目

6、。 對于不同樣品，膜過濾一微菌落一熒光法使用的培養基和培養時間不同。檢驗凝乳中酵母菌時，可采用含瓊脂的固體培養基，也可放在2ml雙料液體培養基浸潤的紙片上培養1524小時。檢驗食品中需氧性細菌數時，可用瓊脂計數平板，也可用營養肉湯或酪蛋白胨一豆粉蛋白胨液體培養基，培養8小時。食品中酵母和霉菌的選擇性檢測可使用添加100ppm氯霉素的麥芽汁提取物瓊脂培養基，或添加100ppm氯霉素的雙料麥芽汁提取物液體培養基。糖果中耐滲透酵母的檢測可采用50%葡萄糖液體培養基，培養時間為48小時(菌數>10個克)72小時(菌數10個克)。2. 下發任務書，布置任務：學生每5-6人為一組按照制定的實驗實施方

7、案進行培養基的制備和需滅菌相關物品的準備和包扎。3.學生討論任務流程，進行任務分工 20min任務流程：秤取藥品-溶化-調節pH值-分裝-加塞-包扎；配制生理鹽水分裝包扎；吸管包扎4.學生分組按照實施方案進行培養基的熬煮、分裝、包扎以及相應的玻璃器皿的包扎 60min（1）、秤取藥品：配方：胰蛋白胨5.0 g；酵母浸膏2.5 g；葡萄糖1.0 g；瓊 脂15.0 g；蒸餾水1000 mL、pH 7.0±0.2，按照培養基配方比例依次準確地秤取酵母浸膏、胰蛋白胨、葡萄糖放入燒杯中。注意事項：酵母浸膏比較粘稠，秤取時可先在稱上減去燒杯和藥匙的重量，再用藥匙去蘸取酵母浸膏，一起放到稱上秤取

8、。胰蛋白胨秤取時要迅速，因蛋白胨很容易吸潮。（2）、溶化：將燒杯中加入水，加熱溶化后加入瓊脂，繼續加熱，瓊脂溶化后，補足損失水分。注意事項：瓊脂溶化過程中，應控制火力，小火加熱，以免培養基溢出；不斷攪拌，以防培養基燒焦；配制培養基時，不要用銅或鐵鍋加熱，以免離子進入培養基中，影響細菌生長。（3）、調節pH值先用精密pH試紙測量培養基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培養基中逐滴加入1mol/L氫氧化鈉，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直到pH值達到7.0±0.2，若偏堿，則用1mol/L鹽酸調節。注意事項：pH值不要調過頭，以免回調影響培養基內各離子的濃度。（4）、分裝分裝試管

9、的量不要超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，分裝三角瓶的量不要超過三角瓶的1/2。注意事項：分裝時不要讓培養基沾在管口上，以免沾染棉塞而引起污染。（5）、加塞：在分裝好的試管和三角瓶上加上棉塞，阻止外界微生物的進入而污染，并保證有良好的通氣性能。（6）、包扎在試管的棉塞外，三角瓶的棉塞外加上兩層報紙，防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外用棉繩扎好。5.學生在課下進行培養基的滅菌。5. 教師在學生做的過程中進行指導和評價，隨時指出和解決學生在操作過程中出現的問題注：本次任務未結束，在任務結束后布置作業。設備、工具及材料教案，教學設計方案，課程標準，教學案例，電爐、恒溫培養箱、試管、培養皿、移液管（移液槍

10、）、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、試劑考 核備 注運城職業技術學院課程教學設計實施方案項 目3.細菌的檢驗任 務2.飲料中菌落總數檢驗授課教師成少寧、喬冬授課地點綜B106 授課方法理實一體化課 時2.0教學內容菌落總數檢驗的采樣方法、稀釋方法、接種方法、培養方法實施步驟1.“六個一”企業案例(微生物快速測定方法)介紹 5min Limulus測試法用于革蘭氏陰性菌脂多糖的測定。這種方法可以在30分鐘1小時內定量測定食品中存在的死去的和活著的革蘭氏陰性菌的細胞壁組成部分。因為內毒素與革蘭氏陰性菌含量呈線性關系，所以可以根據革蘭氏陰性菌的污染程度確定內毒素的含量。 這個方法可用于食品中內毒素的快速檢測

11、，特別是新鮮易腐敗的如牛奶、肉、魚和蛋等食品，因為這些食品上的細菌多為革蘭氏陰性菌。此方法還用于鑒定加工食品原料中革蘭氏陰性菌（包括死菌在內）的含量，蛋白制品的衛生細菌學質量檢測、肉類食品的細菌學質量檢測，以及醫學范圍內的注射液質量檢測等多個方面。2. 下發任務書，布置任務： 5min學生分組，每5-6人為一組進行飲料（食品坊提供）中菌落總數檢驗的飲料的選擇、取樣、稀釋和接種。要求：嚴格遵循無菌操作，嚴格按照實驗方案進行操作。3.學生分組討論任務流程,進行任務分工，教師檢查學生討論和分工情況 10min4.每三個組找一名學生進行操作演示，其他學生指出操作過程的問題 15min5.教師補充,強調

12、操作過程中應注意的問題 5min加熱培養基時電爐火一定要小,以防培養基溢出;稀釋樣品的過程中一定要注意同時往培養皿中加樣;一定要先做好標記。6.學生分組無菌操作進行飲料中菌落總數檢驗的取樣、接種和培養 45min熔化培養基標記稀釋樣品加樣倒平板混勻恒溫培養液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混

13、合均勻，制成1:100的樣品勻液。按以上操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1 mL無菌吸管或吸頭。根據對樣品污染狀況的估計，選擇2個3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。及時將15 mL20 mL冷卻至46 的平板計數瓊脂培養基（可放置于46 ±1 恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉，36 ±1 培養48 h±2 h。水產品30 ±1

14、培養72 h±3 h。如果樣品中可能含有在瓊脂培養基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養基（約4 mL），凝固后翻轉平板，按上述條件進行培養。7.教師在學生做的過程中進行指導和評價8.布置作業：查找飲料中菌落總數的合格范圍（每組一份，批改率100%）9.學生實驗完成后清潔整理實驗室 5min設備、工具及材料教案，教學設計方案，課程標準，教學案例，電爐、恒溫培養箱、試管、培養皿、移液管（移液槍）、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、試劑、飲料（食品坊提供）考 核備 注運城職業技術學院課程教學設計實施方案項 目3.細菌的檢驗任 務2.飲料中菌落總數檢驗授課教師成少寧、喬冬授課

15、地點綜B106 授課方法理實一體化課 時2.0教學內容飲料中菌落總數檢驗的計數方法和報告方法實施步驟1.“六個一”企業案例(微生物快速測定方法)介紹 5min食品中微生物快速檢測的方法一般可以在1-3小時內得出結果，其中較為典型的方法有：Limulus測試法，ATP測定法，直接表面熒光過濾技術以及氧氣消耗測定法等。 ATP測定法是利用生物發光法，應用熒光素熒光素酶制劑進行的，在活細胞中ATP含量近乎是恒定的，利用特殊的酶試劑水解掉細菌膜，使ATP釋放，ATP與熒光素熒光素酶制劑反應變成AMP和光，產生的光強度與ATP成正比，通過測定光強度可確定細菌濃度。這種方法可用于鮮肉、鮮魚、牛奶、啤酒、礦

16、泉水以及無菌藥品的檢測等多種領域。 ATP+熒光素+熒光素酶（Mg2+）熒光素熒光素酶AmP+焦磷酸 熒光素熒光素酶AMP（O）氧化熒光素+熒光素酶+AMP+CO2+光2.下發任務書，布置任務： 5min學生分組，每5-6人為一組進行飲料中菌落總數檢驗平板的菌落計數和報告。要求：計數正確，報告方法正確3.平板計數 15min 學生組內討論，對本組的平板進行計數，選出代表進行匯報，教師匯總，與學生共同評價。菌落計數方法：可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。選取菌落數在30 CFU3

17、00 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數，大于300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數。當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。4.菌落總數的計算方法 35min學生組內討論，對本組平板的菌落總數進行計算，選出代表進行匯報，教師匯總，與學生共同評價。 菌落總數計算方法：若只有一個稀釋度平板

18、上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g（mL）樣品中菌落總數結果。若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按公式計算。若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。若所有稀釋度的平板菌落數均小于30 CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。若所有稀釋度的平板菌落數均不在30 CFU300 CFU之間，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU時，則以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。5.菌落總數的報告方法 10min 學生組內討論，對本組平板的菌落總數進行報告，選出代表進行匯報，教師匯總，與學生共同評價。(1) 菌落數小于100 CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數報告。(2) 菌落數大于或等于100 CFU時，第3位數字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數字，后面用0代替位數；也可用10的指數形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數字。(3) 若所有平板上為蔓延