1、酶免測試的工作原理吸光度測試的準確性對于酶免測試結果的重要性 酶標儀的組成部分和工作原理第一節比色分析的基本理論許多化學物質具有顏色，有些無色的化合物也可以和顯色劑作用而生成有色物質。事實證明，當有色溶液的濃度改變時， 顏色的深淺也隨著改變。 濃度越大，顏色越深；濃度越小， 顏色越淺。因此，可以通過比較溶液顏色深淺的方法來確定有色溶液的濃度，對溶液中所含的物質進行定量分析。如納氏管比色法，它是按濃度由高到低，配好一系列標準濃度管，然后拿待測樣品和標準管逐個比較，看和哪一個標準管的顏色最相近，便讀取該標準管的濃度值為待測樣品的濃度值，這就是（目視）比色法。這種方法雖然比較簡便，但是系列標準管 不

2、易保存，誤差較大。后來改用光電檢測元件代替目視來測量被測溶液中物質的含量，這種方法叫光電比色法。利用這種方法制成的儀器叫光電比色計。光電比色計屬于吸收光譜儀器范圍。、光的性質從物理學中我們知道，光具有波動和微粒兩種性質， 通稱光的波粒兩象性。 在一些場合, 光的波動性比較明顯；在另一些場合，光則主要表現為微粒性。0、波長（力、速度400760nm之間的電磁 不同波長的光被人眼所首先，光是一種電磁波。可以用描述電磁波的術語，如振動頻率（ （c ）、周期（T ）來描述它。我們日常所見到的白光，便是波長在 波，它是由紅橙黃綠青藍紫等色，按照一定比例混合而成的復合光。感受到的顏色是不同的。 在可見光之

3、外是紅外線和紫外線。各種色光及紅外線、 紫外線的近似波長范圍如表1所示。表1各種色光及紅外線、紫外線的近似近波范圍單位：nm顏色波長范圍顏色波長范圍遠紅外線100011000000綠501 ,-560中紅外線2501-10001青481 ,-500近紅外線761-2500藍431 ,-480紅621760紫401 ,-430橙591620普通紫外線191 ,-400黃561590真空紫外線1-190除了波動性外，光還具有微粒性。在輻射能量時，光是以單個的、一份一份的能量（E= hu）的形式輻射的。式中U是光的頻率，h為普朗克常量。同樣，光被吸收時，其能量一 份一份地被吸收的。因此，我們可以說，

4、光是由具有能量（ hu）的微粒所組成的，這種微粒 被稱為光子。由式中可知，不同波長的光子具有不同的能量。波長越短，即頻率越高，能量 越大。反之亦然。光子的存在可以從光電效應中得到充分的證明。、光的互補及有色物質的顯色原理若把某兩種顏色的光按照一定的比例混合，能夠得到白色光的話，則這兩種顏色的光就叫做互補色。圖1中處于直線關系的兩種光為互補色。如綠光和紫光為互補色，黃光和藍光為互補色等等。圖1互補色光示意圖圖2高鎰酸鉀溶液的光吸收曲線物質的顏色與光的吸收、 透過、反射有關。由于物質的性質和形態不同，所以呈現出不 同的顏色。透明物質的顏色就是它透過光波的顏色。不透明物質的顏色是其反射光波的顏色。有

5、色溶液對光的吸收是有選擇性的。各種溶液之所以會呈現不同的顏色，其原因是因為溶液中的有色質點（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光所致。實踐證明，溶液所呈現的顏色是它的主要吸收光的互補色。如一束白光通過高鎰酸鉀溶液時，綠光大部分被選擇吸收， 其他的光透過溶液。從互補色示意圖可以看出， 透過光中除紫色外，其他顏色的光兩兩互補。 透過光中只剩下紫色光，所以高鎰酸鉀呈紫色。通常用吸收曲線來描述溶液對各種波長的光的吸收情況。讓不同波長的光通過一定濃度的有色溶液，分別測出它對各種波長的光的吸收程度（用吸光度A來表示），以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，所得到的曲線稱為溶液的吸收曲線或吸收光譜圖。例如，高

6、鎰酸 鉀吸收曲線如圖所示。圖 2中Ci、。、。分別代表不同的濃度，Ci < C2 < C3。從圖2中可以看出，在可見光范圍內，高鎰酸鉀溶液對波長為 525nm左右的綠色光吸收 程度最大，而對紫色和紅色光很少吸收。對于任何一種有色溶液， 都可以測繪出它的吸收曲線。 光吸收最大處所對應的波長叫最 大吸收波長。濃度不同的同一種溶液， 其吸收光譜的形狀和最大吸收波長是一樣的，也就是說，不同的物質都具有其特定的吸收光譜。如同根據指紋可以辨認眾人一樣，在光譜分析中，可以根據吸收光譜的不同來鑒別物質。從圖2中還可以看出，溶液的濃度越大，對（綠）光的吸收程度越大。因此，可以利用這部分光線通過溶液后

7、被吸收的程度來確定溶液的濃度。如可用綠色光來對高鎰酸鉀溶液進行比色測定。由于有色物質對光的吸收具有選擇性，因此，在進行比色測定時，只能用光波中能被有色溶液吸收的那部分光線，即應該有單色光進行比色測定。至于不被有色溶液吸收的光線， 則應設定在未透過有色溶液之前或之后將其消除掉。濾光片就起這個作用。 根據前面所敘述的理由可知，選擇濾光片的原則應是：濾光片的顏色應與待測溶液的顏色為互補色。三、朗伯-比爾（Lamber-Beer ）定律溶液顏色的深淺與濃度之間的數量關系可以用吸收定律來描述。它是由朗伯定律和比爾定律相結合而成的，所以又稱朗伯-比爾定律。當一束平行單色光照射到均勻、非散射的溶液時，光的一

8、部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被比色皿的表面所反射。設入射光的強度為I。，吸光度的強度為Ia ,反射光I r ，透過光的強度為 I t 。則它們之間有如下關系：I o = I a+I r+ 11在實際比色分析時，所用的比色皿都是同質料、同規格的，因此反射光的強度為一定值，不會引起誤差，即反射光的影響可以不考慮。這樣，上式可簡化為：Io=I a + 11當入射光的強度一定時，被吸收的光的強度越大，透過光的強度就越小。這就是說，光強的減弱僅僅與有色溶液對光的吸收有關。在比色分析中，常把透過光的強度占入射光的強度的百分比 ( I t / I o) 稱為透過率或透射比，用T表示，即T= (It /

9、 Io) %。T越大，表明有色溶液的透光程度越大。當一束平行單色光通過有色溶液時，由于溶液吸收了一部分光線，光線的強度就要減弱。溶液的濃度越大、透過的液層越厚、入射的光線越強，則對光線的吸收就越多。如果入射光的強度不同， 則光的吸收只與液層厚度及溶液的濃度有關。 它們之間的關系可以用下式 表示：A= K C- L式中， A 為吸光度； K 為吸(消)光系數； C 為溶液的濃度； L 為液層厚度。此公式說明： 在入射光一定時， 溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度成正比。 此式就是光的吸收定律的數學表達式，又叫朗伯 - 比爾定律。這一定律是比色分析和其他吸收光譜分析的理論基 礎。吸光系數 K= A

10、/ (C- L),它表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時的吸光度。在入射光的波長、溶液的種類和溫度一定的條件下， K 為定值。 K 值越大，說明比色分析時的靈敏度越高。吸光度A與透射比T的關系如下：A= lgT即吸光度 A與透射比T的負對數成正比。四、定量方法用光電比色計和分光光度計測定有色溶液的濃度有計算法和標準曲線法兩種。計算法必須嚴格遵守朗伯 - 比爾定律的應用條件，方能得到準確的結果。(一)計算法根據被測溶液濃度的大致范圍，先配制一已知濃度的標準溶液。用同樣的方法處理標準與被測溶液，使其成色后，在同樣的實驗條件下，用同一臺儀器分別測出它們的吸光度。在標準溶液中：As= Ks '

11、Cs ' Ls在待測溶液中：A = Kx G Lx將兩式相除可得：As /A x =Ks CS - Ls/ (Kx - CX - Lx)如果測定時選用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波長的單色光，再保持溫度相同，則K也相等。這樣上式可簡化為：As /A x=G/ C x由此可見，在滿足上述條件下， 溶液的吸光度與其濃度成正比。這一關系式是設計光電比色計和分光光度計的基礎，也是比色分析的基本計算公式之一。式中標準溶液的濃度已知，As和Ax可以用光電比色計測量出來，這樣，待測溶液的濃度便可以由下式求出：G= Cs Ax/ a s由于儀器的性能和工作環境都是在不斷變化的，因此，在采用計算

12、機時，必須每次都要對標準液和被測液進行測量，然后利用上式進行計算， 否則，會帶來較大的測量誤差。 再者,光電比色計在使用時，一般都或多或少會偏離朗伯-比爾定律，故欲得到準確的測量結果，常采用標準曲線法。(二)標準曲線法這種方法分以下幾步進行：(1)先配制5種以上標準濃度的溶液；(2)測出每種溶液的吸光度 A;(3)做A、C標準曲線圖，如圖3所示。圖3標準曲線有了標準曲線圖，便可以對溶液進行測量。在同樣工作條件下，用儀器測出A后，查標準曲線，即可求得被測溶液的濃度值cx。為了方便工作，現代光電比色計大都加有對數運算放大器，使用時只要選用一種合適的標準溶液進行定標，然后便可以直接讀取溶液的濃度值，

13、使工作效率大大提高。第二節光電比色計的基本結構利用光電池或光電管等光電元件作檢測器，來測量通過有色溶液的透射比或吸光度，進而求出物質含量的方法叫光電比色法。基于這種方法而設計成的儀器叫光電比色計。一般的光電比色計由光源、濾光片、比色皿、光電檢測器、放大和顯示等6部分組成。光電比色計的方框圖如圖4所示。圖4光電比色計方框圖光源發出的復合光經濾光片濾除后，變為近似的單色光。此單色光通過比色皿時，被比色皿中盛放的樣品液吸收掉一部分，然后照在光電檢測器上。光電檢測器將照在它上面的光信號的強弱轉變為電信號的大小，最后由顯示部分將測量結果顯示出來。一、光源理想的光源應在整個所需要的波長范圍內具有均勻的發光

14、強度，也就是說，它的光譜 應該包括所用的波長范圍內有波長的光，光的強度應該足夠大， 并且在整個光譜區中， 其強度不應隨波長有顯示的變化。實際上，這種理想的光源并不存在，所有光源的光強都隨波長 而變。在可見光范圍內常用的光源有鴇絲燈和鹵鴇燈。（一）鴇絲燈鴇絲燈是可見光區和近紅外區最常用的光源，它適應的波長范圍在3202500nm之間，如圖5所示。鴇絲燈靠電能將鴇絲加熱至白熾而發光，它的光譜分布與燈絲的工作溫度有關。鴇絲燈的特點是結構簡單、價格便宜、壽命較長，通常可以工作1000h以上。圖5鴇絲燈的能量曲線其不足之處是，在點燃時鴇絲會不斷向外蒸發出鴇分子。燈絲的溫度越高，蒸發速度越快。鴇絲的蒸發會

15、使燈絲變細， 縮短壽命，更重要的影響是蒸發出的鴇分子到達燈泡的內壁時，會沉積在內壁上， 隨著工作時間的延長，內壁沉積的鴇會越來越厚，使燈泡透出來的 光越來越弱。嚴重的會使燈壁發黑，無法使用。使用鹵鴇燈可以解決這一問題。（二）鹵鴇燈鹵鴇燈是在鴇燈中加入適量的鹵素或鹵化物（如碘鴇燈內加入純碘，澳鴇燈中加入澳 化氫）而制成的，有時也稱作鴇鹵素燈和鹵素燈。其燈壁多采用石英或高硅氧玻璃。鹵鴇燈有比普通鴇燈高得多的發光效率和長得多的壽命，這主要是因為在鹵鴇燈中，鴇蒸氣在靠近燈壁的低溫區與鹵素相結合，生成了揮發性的鹵化鴇氣體。由于燈泡內的熱對流，使鹵化鴇氣體產生流動。當鹵化鴇碰上高溫燈絲時，又分解成鹵素和鴇

16、。鴇沉積在燈絲上，而鹵素再繼續擴散到溫度較低的燈壁區與鴇化合。這一過程一般稱為鹵鴇循環或鴇的再生循環。這一循環大大減少了鴇在燈泡內壁的沉積，它不但延長了燈泡的壽命，還提高了燈泡的性能。 鹵鴇燈的壽命通常可達 2000h以上，它的另一優點是體積比同功率的鴇絲燈要小得多。鴇燈（包括鹵鴇燈）的發光穩定度與所加的電壓有密切的關系。已知在可見光區，其 能量輸出的波動約為所加電壓波動的4次方倍。為了獲得穩定的測量結果，保持光源燈發光的穩定性是非常重要的，這就要求給光源燈提供穩定的供電電壓。這兩種鴇燈既可以用交流供電，也可以用直流供電。在交流供電時，通常采用磁飽和 穩壓器供電。在直流供電時，通常采用電子穩壓

17、電路供電。目前，絕大部分采用直流供電。二、濾光片濾光片又叫濾色片，其作用是控制波長或能量的分布，即它只讓一定波長范圍內的光 通過，而將其余不需要的波長的光濾去，相當于電路中的帶通濾波器。濾光片通過的波長范圍越窄、透射比越大，說明其質量越好。濾光片通過單色光的純度，通常用其光譜特性曲線的半寬度表示。圖6是一塊藍色濾光片的透射比曲線。曲線上與最大透射比Tm對應的波長（480nm）,叫峰值波長。與最大透射比的一半（Tm/2）相對應的 A B兩點之間的波長差，叫半寬度。即：半寬度=入2-入。圖6中的半寬度=530-430 = 100ns半寬度越小，表示透過的單色光越純。常用的波光片有吸收濾光片、干涉濾

18、光片、復合濾光片等。圖6吸收濾光片的透光曲線（一）吸收濾光片吸收濾光片又叫玻璃濾光片，它是在熔化的玻璃中摻以不同的添加劑制成的。這種濾光片所呈現的顏色就是其透過光的顏色。其優點是熱穩定性較好、 價格便宜，是普通光電比色計最常用的濾光片。根據其性能的不同，吸收濾光片又可分為帶通濾光片和截止濾光片兩類。 帶通濾光片的透光特性如圖 6所示。這類濾光片的半寬度較寬，通常在100nm左右；最大透射比較小，通常在 20左右。（二）截止和復合濾光片截止濾光片的特性是其透光部分的透射比接近100,而其他部分的透射比則迅速下降為0,透光部分不存在兩端截止的通頻帶，因此，它沒有半寬度的概念，其透光特性如圖7所 示

19、。從圖7還可以看出，兩塊截止濾光片、 兩塊帶通濾光片，或一塊截止與一塊帶通濾光片， 可以組成一塊新的帶通濾光片， 這樣的濾光片叫復合濾光片。復合濾光片可以得到比玻璃濾光片窄得多的半寬度。圖7截止濾光片的透光特性圖8截止濾光片的名義值截止濾光片的名義值用半高波長和陡度表示，如圖8。半高波長是指曲線前沿Tm /2處所對應的波長，圖中用入1表示。透射比下降到 5%時所對應的波長稱為截止波長，圖中8用加表示。陡度定義為：陡度=半高波長/（爪粉。國產比色計中62、65、67號3塊濾光片為截止濾光片。目前，國內生產的光電比色計一般只附有常用的42號、50號和65號3塊波光片。濾光片的編號是其峰值（或半高）

20、波長的代號。如 42號和50號的峰值波長分別為 420nm和 500nm, 65號的半高波長為 650ns如需要其他波長的濾光片，可以自行購買。濾光片的透光特性與溫度有關。溫度升高時，不但它的半寬度會加寬， 峰值波長也會起變化。溫度變化還從其他途徑影響比色分析。因此，在光源燈和濾光片之間常加上一塊隔熱玻璃，以減少溫度的影響。此外，雖然一般不認為透明玻璃是濾光片，但是普通玻璃確實不能透過波長小于300nm而大于2600nm的光波。故工作在紅外和紫外波段的光學儀器必須使用特殊的透光材料，如 紫外區使用石英玻璃，紅外區使用巖鹽、氟化鈣等。（三）干涉濾光片由光的干涉原理可知， 來自同一光源的兩束光線，

21、在空間不同的路徑而相互疊加時，若光程差為波長的整數倍，則互相加強；若光程差為半個波長的奇數倍，則互相減弱。干涉濾光片就是利用光的干涉原理來產生窄譜帶光束的元件。它大多采用多層鍍膜等復雜的工藝制成。干涉濾光片的半寬度可以做得很窄， 如可達幾個納米，透射比可以做得很大， 如70%以上。干涉濾光片雖然性能優越，但其價格昂貴。峰值波長和最大透射比會隨著時間而發生改 變，甚至失效。另外還有一種濾光片叫中性濾光片，可以用它作吸光度的標準。它實際上是一個衰減器， 在所使用的波長范圍內，它對所有的波長進行大致相同程度的吸收。需要說明的是，這種濾可能與實際值有偏差，使用時要以實際使用的波長下的測定值為準。光片上

22、的標稱吸光度值，、比色皿比色皿又叫比色環、 比色池、比色槽、吸收池等，它主要用來盛裝比色分析時的樣品液。在可見光范圍內，比色皿常用無色光學玻璃或塑料制成；在紫外區，常用石英玻璃來制作。比色皿的形狀一般為方形，圓形的比較少。此外，還有流動比色皿、微量比色皿、可拆卸比色皿等，如圖 9所示。除了盛放液體的比色皿之外，還有用來盛裝氣體的比色皿。氣體比色皿需加有蓋子。圖9比色皿的形狀示意圖由于經常用來盛裝各種化學溶液，比色皿除了要求具有良好的透光特性之外，還應有較強的耐腐蝕性。盡管可以做成各種形狀和尺寸，但國際上規定，液層厚度為10mm勺比色皿為標準比色皿。在使用中應該注意的是， 每臺儀器所配的比色皿都

23、是成套的，所以臺與臺之間所帶的比色皿不能混用，否則會帶來較大的測量誤差。在同一測定中所使用的所有比色皿的光徑（內徑）必須一致。檢驗比色皿是否符合要求的方法是：先在各比色皿中放入相同的溶液，然后放入儀器進行測量。在其他條件不變的情況下，讀出的透射比誤差應小于0.5%。否則說明誤差太大，不應再使用。比色皿的內壁和透光外壁都應注意清潔，不能用硬質纖維或用手去摸。其不透光的兩壁是供拿取的。不透光的兩壁被磨成毛沙面或其他不透光面，以示區別。使用比色皿時，其放置方向也應注意。 因為透光方向換向后，其透光性可能會發生改變。 有的比色皿上標有箭頭，用來指示光的方向。使用時，溶液不要放得太滿，以防液體溢出。一般

24、加液量只要稍多于 1/2即可。若有液體溢出，一定要把其外表的水分擦干。否則，會產生光的反射和折射，嚴重影響測量結果。四、光電檢測器前面已經述及，光電檢測器是用來將光能轉換成電能的器件。在檢驗儀器中常用的光電檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。光電檢測器必須滿足以下 3個條件：（1）光電轉換須滿足恒定的函數關系；（2）波長響應范圍寬；（3）靈敏度高，響應速度快，產生的電信號易于檢測和放大，噪聲低。（一）光電池某些半導體材料受光照射時， 受光面和背光面之間會產生電位差， 如果在這兩面之間連 接上檢流計，會看到有電流通過， 這種光電轉換器件稱為光電池。 如硒光電池、硅光電池等, 其中硒光電池應用較

25、廣，它的結果如圖 10所示。A圖10硒光電池結構示意圖在作為電極之一的金屬板（如厚12mm的鐵、銅、鋁板）上，涂上一層厚約 0.1mm的P型半導體硒。然后，再在硒上濺鍍一層半透明的金屬薄膜（如銀或氧化鎘等），作為另一極。經過熱處理后，在硒半導體和金屬薄膜的分界面上形成一層阻擋層一一PN結，其附加電場的方向由金屬膜指向硒。這一阻擋層既能夠阻止硒半導體中的空穴向金屬膜中擴散， 也能夠阻止金屬膜中的電子向硒半導體中擴散。當光通過金屬膜照射到半導體上時，半導體中處于束縛狀態的電子吸收了光子的能量后，成為自由電子，這時可以順利地通過阻擋層到金屬膜上。因此，在金屬膜電極上便積累了較多的電子。另一極由于失去

26、了電子， 積累了較多的空穴，這樣就產生了 “光生電動勢”。這種現象由于是在物體內部產生的，有時也把它叫做“內光電效應”。如果有外電路將兩電極接通，便有（光）電流流經外回路。所產生的 光電流與入射光強成正比。 從其工作原理我們可以看出，光電池不用外接電源， 只要受光照射，便能產生電流。應用起來很方便。不同材料的光電池，其光譜靈敏范圍不一樣。硒光電池的工作范圍在380750nmi包含了整個可見光范圍。圖 11是硒光電池和人眼對不同波長的光的感應曲線。圖11 硒光電池和人眼對不同波長光的感應曲線在普通室內照明的條件下，硒光電池產生的光電流有幾十至幾百微安。用三用表就可以測量出來。方法是先將表置于10

27、0 g或50隱檔，有正表棒接硒光電池的正極 一一背面鋁片， 負表棒接負極一一正面集電環。在一般的室內照明條件下，測得的電流為幾十微安以上。當 光電流非常微弱或沒有時，說明光電池已經失效。硒光電池受光連續照射的時間過長或受強光照射后，光電流會很快上升至一個較高的數值，然后逐漸下降，這一現象叫做光電池的疲勞現象，其表現為儀器上的指針或反射光點慢慢后退。因此，光電池不要連續使用過久。在插入濾光片之前，不要開亮燈泡，以免強光照射。如果光電池已經疲勞，最簡單的恢復辦法是把它置于暗處一段時間，使其慢慢恢復靈敏度。另外，光電池很容易受潮而致使其產生的電流大小不穩定，平時保存要防潮、防光，最 好用深色紙包起來

28、放入干燥器皿中。光電池的優點是結實、便宜、使用方便，不需外接電源就可以直接送到微安表或檢流計上去顯示。其缺點是對光的響應速度慢，不能檢測脈沖光束；內阻小，不便進行信號放大等。常用的光電池除了硒光電池外，還有硅光電池。和硒光電池相比， 硅光電池最大的優點是使用壽命長一一可使用10年以上。它幾乎無疲勞現象，是很受歡迎的一種新型光電池。不同廠家生產的硅光電池，其光譜靈敏范圍不一樣。如有的工作在3001100nm,有的工作在5001000nmi還有的工作在 380780nmo所以，使用硅光電池時，一定要事先弄清 楚其工作波長，即光譜靈敏第范圍。除了光譜靈敏范圍之外，光電檢測元件的另一個重要指標是積分靈

29、敏度，簡稱靈敏度。靈敏度是指在單位光通量照射下，光電轉換元件所產生的光電流的大小。一般光電池的靈敏度為幾百微安/流明。酶標儀的工作原理及基本結構一、酶標聯免疫吸附實驗法酶標聯免疫吸附實驗法采用酶標記技術，使待測標本與事先包被在塑料凹孔板內的相 應抗原或抗體相結合，形成免疫復合物。酶標抗原或抗體與此結合形成酶標記的免疫復合物。 當加入酶的相應底物時，由于酶的催化作用， 呈現顏色反應。顏色的深淺與相應的抗原或抗體的量成正比。這樣，原來人體中無色的抗原或抗體，與酶聯接后仍保持免疫和酶的活性。當加入底 物后，能使底物顯色。抗原或抗體的含量越高，顏色就越深。這樣，便可根據所生成的顏色 的深淺，來分析抗原

30、或抗體的含量。酶標法（并稱固相酶免疫測定）可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3個必要的試劑：固相的抗原或抗體、 酶標記的抗原或抗體和酶反應的底物。 根據試 劑的來源和標本的性狀以檢測的具體條件， 可設計出各種不同的檢測方法。現介紹3種最常 用的方法。（一）抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，圖10為其示意圖。具體操作步驟如下：圖10雙抗體夾心法測抗原示意圖(1)將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。然后洗滌除去未結合的抗體及雜質。(2)加受檢標本使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。然后洗滌除去其他未結合的物質。(

31、3)加酶標抗體，使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。然后徹底洗滌未結合 的酶標抗體。此時，固相載體上帶有的酶量就代表標本中受檢抗原的量。(4)加底物顯色。夾心式復合物中的酶催化底物變為有色產物。根據顏色反應的程度 進行該抗原的定性或定量。本法只適用于二價或二價以上大分子抗原的檢出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的測定。(二)間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，圖11為其示意圖。其原理為利用酶標記的抗體來檢測已與固相抗原結合的受檢抗體。操作步驟如下： 圖11間接法測抗體示意圖(1)將特異體抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。然后洗滌除去未結合的抗原及雜質。(2)加稀釋的受檢血清，使血清中的

32、特異性抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體 復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由于不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。(3)加酶標抗免疫球蛋白 (酶標抗體)，它與固相復合物中的抗體相結合，從而使該抗 體間接地標記上酶。清洗后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。(4)加底物顯色，顏色深度代表標本中受檢抗體量。(三)競爭法競爭法可用于測定抗原， 也可用于測定抗體。 以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競 爭與固相抗體結合，因此，結合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量成正比， 其示意圖如圖 12所示。具體操作步驟為：恁昧仁也OE O£QO 9M

33、（青O：圖12競爭法測抗原示意圖(1)將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。然后洗滌。(2)在待測管中加入受檢標本與一定量的酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。若受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。若受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合。這樣，受檢標本中抗原量越高， 則由于這些抗原與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相抗體結合的機會，使酶標抗原與固相抗體的結合量越少。“參考管”中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分 的量。然后洗滌。(3)加底物顯色。參考管中由于結合的酶標抗原量最多，故顏色最深。參考管中顏色 深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本中抗原的量。待測管越淡，表示標本中抗原量越多。二、酶標儀的工作原理及結構由酶標聯免疫吸附實驗法可知，酶標義應該用比色法來分析抗原或抗體的含量，即它應依照比色原理進行工作。 實際上，酶標儀就是一臺變相的光電比色計或分光光度