1、病毒包裝相關(guān)知識(shí)匯總應(yīng)用領(lǐng)域隨著分子生物學(xué)的理論及技術(shù)方法（特別是重組DNA技術(shù)）的迅速發(fā)展，人們可以在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建各種載體、克隆及分析目標(biāo)基因，使疾病深入至分子水平研究，于是誕生了基因診斷、基因治療技術(shù)。基因治療從基因角度理解是對(duì)缺陷的基因進(jìn)行修復(fù)增補(bǔ)，或?qū)⒄９δ艿幕蛑脫Q的方法。從治療角度理解是一種基于導(dǎo)入遺傳物質(zhì)以改變患者細(xì)胞的基因表達(dá)從而達(dá)到治療或預(yù)防疾病的目標(biāo)的新措施。當(dāng)代基因治療研究的熱門(mén)方法是將外源DNARNA片段導(dǎo)入靶細(xì)胞或組織，研究靶基因的上調(diào)或抑制情況。例如，有些異常基因（癌基因、病毒基因），可通過(guò)技術(shù)引入外源片段將其抑制；有些基因本身有治療作用，體外合成該基因?qū)塍w內(nèi)使其

2、表達(dá)豐度提高。故選擇合適高效的基因?qū)虢橘|(zhì)系統(tǒng)尤為關(guān)鍵。而病毒載體已成為當(dāng)前基因治療載體研究的熱點(diǎn)。病毒載體的優(yōu)勢(shì)：1、利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，感染效率高；2、病毒的宿主范圍廣，可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；3、病毒基因組的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子背景比較清楚，穩(wěn)定易于改造、易于制備；4、復(fù)雜的裝配過(guò)程由細(xì)胞完成；5、不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)；6、通過(guò)載體改造的方式形成了復(fù)制缺陷型結(jié)構(gòu)，安全性高；7、病毒包裝技術(shù)經(jīng)歷了多年的研究，已趨于成熟，可用于產(chǎn)業(yè)化大量生產(chǎn)慢病毒包裝技術(shù)背景：慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類(lèi)免疫缺

3、陷1型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的病毒載體。具有感染譜廣泛、可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)，成為導(dǎo)入外源基因的有力工具。目前慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細(xì)胞系的基因過(guò)表達(dá)、RNA干擾等研究以及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。技術(shù)原理：慢病毒載體系統(tǒng)包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，且能提供慢病毒所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。第三代四質(zhì)粒慢病毒載體系統(tǒng)，相較于前代慢病毒載體，安全性大大提升。其包括如下成分：a.基因轉(zhuǎn)移/表達(dá)載體；b.輔助載體。利用表達(dá)載體和

4、輔助載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取上清液后純化病毒，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。技術(shù)特點(diǎn)：1、直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用。2、可以通過(guò)簡(jiǎn)單方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。3、可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。4、無(wú)需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡(jiǎn)便。5、可以根據(jù)需要選擇多種標(biāo)記。技術(shù)應(yīng)用：1、將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒/干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞；2、將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒/干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入動(dòng)物組織，以期

5、獲得長(zhǎng)期表達(dá)；3、構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)/干擾細(xì)胞系，再用exvivo的方法導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)；4、基因治療；5、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；6、基因敲除；7、藥物研究：構(gòu)建表達(dá)受體蛋白的細(xì)胞系，研究藥物的作用；8、快速建立生產(chǎn)目的蛋白的細(xì)胞系，非常有前途的真核細(xì)胞表達(dá)方法。技術(shù)流程概述：1、基因合成及病場(chǎng)載體構(gòu)建2、轉(zhuǎn)染及驗(yàn)證3、細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒包裝4、收秋病是液及病是純化5、病毒滴度檢測(cè)6、感染效果WB qPC斛價(jià)慢病毒包裝常用質(zhì)粒圖譜：nwi whIL i L X/ / am技術(shù)背景：卜 ' AIQ10g EpC&H CW MCS £ F i -iGfip + fhjn>L VI

6、9;V I XM 網(wǎng)明腺病毒包裝腺病毒（Adenovirus,AdV是一種非整合型雙鏈DNAW毒，在自然界中廣泛分布。雖然一些類(lèi)型的腺病毒會(huì)引起人胃腸道、上呼吸道或眼部上皮細(xì)胞的急性感染；但是應(yīng)用于基因治療研究的腺病毒是安全的，對(duì)人無(wú)致病、致畸、致癌的潛在危害。根據(jù)JournalofGeneMedicine的統(tǒng)計(jì)，截至2006年，在全球1192項(xiàng)基因治療臨床試驗(yàn)方案中，有305項(xiàng)（26%）使用腺病毒載體，首次超過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒，居第一位。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道，所以它所介導(dǎo)的基因治療可以靜脈注射，還可以通過(guò)口服經(jīng)腸道吸收，或通過(guò)噴霧、滴注經(jīng)呼吸道吸收，使得基因治療方案易于推廣應(yīng)用。技術(shù)原

7、理：腺病毒（Adenovirus）是一種無(wú)包膜的雙鏈線性DNAW毒，基因組長(zhǎng)約36kb,衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)。腺病毒外源基因裝載容量大，且能夠感染絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括分裂和不分裂的細(xì)胞；除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞。腺病毒適用于在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行RNA干擾、過(guò)表達(dá)中I定基因和invivo實(shí)驗(yàn)。常用重組腺病毒系統(tǒng)組成：腺病毒骨架載體（攜帶腺病毒主要功能基因）、穿梭載體（轉(zhuǎn)移外源基因表達(dá)盒到骨架載體上）。目前應(yīng)用最為廣泛的是AdMax腺病毒載體系統(tǒng)，骨架質(zhì)粒和穿梭載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)中通過(guò)Cre/loxP實(shí)現(xiàn)載體重組，進(jìn)而產(chǎn)生重組腺病毒。通過(guò)裂解細(xì)胞收獲病毒粒子，病毒

8、粒子經(jīng)過(guò)反復(fù)擴(kuò)增與純化可得到高滴度的腺病毒。技術(shù)特點(diǎn)1、幾乎可以感染所有類(lèi)型的細(xì)胞，包括分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；2、可以獲得復(fù)制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒；3、病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過(guò)濃縮后可以達(dá)到1012PFU/mL；4、 腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡(jiǎn)單；5、感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，生物安全性高。技術(shù)應(yīng)用1、 應(yīng)用于體內(nèi)接種疫苗。用攜帶免疫調(diào)節(jié)基因或腫瘤特異抗原已近的腺病毒載體轉(zhuǎn)入相應(yīng)腫瘤細(xì)胞以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，可制成具有抗腫瘤活性的瘤苗。2、 應(yīng)用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因轉(zhuǎn)位，coIP，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，干細(xì)胞研究等科研實(shí)驗(yàn)。3、 可以完

9、成較高難度的克隆構(gòu)建，包括具有細(xì)胞毒性作用基因的腺病毒構(gòu)建，在短時(shí)間內(nèi)完成從原始質(zhì)粒到病毒DNA勺構(gòu)建工作。4、 產(chǎn)生滴度高，非常適于基因治療。技術(shù)流程1、構(gòu)建穿梭質(zhì)粒以含目的基因的質(zhì)粒為模板，分別在兩個(gè)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因，雙酶切后插入穿梭質(zhì)粒。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染將取骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。3、將PacI消化后的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。4、將病毒粗提液感染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。5、收集病毒顆粒分裝，-80C保存。腺病毒包裝常用質(zhì)粒圖譜腺相關(guān)病毒包裝技術(shù)背景：腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus,AAV）,屬于微小病毒

10、科（parvovirus）,為無(wú)包膜的單鏈線狀DNA病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒）參與復(fù)制。AAV的基因組約4800bp,兩個(gè)ITR序列和兩個(gè)開(kāi)放閱讀框。AAV具有多種常見(jiàn)血清型，100多種病毒變種。其中AAV2是目前應(yīng)用最廣的腺相關(guān)病毒，對(duì)多數(shù)常見(jiàn)細(xì)胞均有較好效果。重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV）源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣（分裂和非分裂細(xì)胞）、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，被廣泛用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，且腺相關(guān)病毒載體已成為世界上最常用的基因治療載體之一。腺相關(guān)病毒載體整合率遠(yuǎn)低于慢病毒載體，但其可以以染色體外形式長(zhǎng)期（數(shù)月至數(shù)年）存在于非分裂細(xì)胞

11、中，從而實(shí)現(xiàn)外源基因長(zhǎng)期表達(dá)。技術(shù)原理：常用腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)AAVHelper-FreeSystem,能產(chǎn)生AAV2血清型病毒而無(wú)需輔助病毒。該系統(tǒng)包含3個(gè)質(zhì)粒：1個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒和2個(gè)輔助質(zhì)粒。將目的基因克隆至重組pAAV載體上；將AAV感染必須的腺病毒基因（E2AE4及VA等）構(gòu)建至輔助質(zhì)粒pHepler上，將AAV復(fù)制基因rep和capsid結(jié)構(gòu)基因cap構(gòu)建至質(zhì)粒pAAV-RC上。三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)腺病毒E1基因細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝。通過(guò)裂解細(xì)胞，離心取得上清液后進(jìn)一步濃縮純化，收集病毒。技術(shù)特點(diǎn)：1、安全，AAV不參與任何疾病的發(fā)生，已經(jīng)用于臨床疾病治療；2、感染范圍廣，可以用

12、于神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛、心肌、肝臟、肌肉和肺部定位注射或定向給藥；2、滴度高，顆粒小，擴(kuò)散能力強(qiáng)；3、表達(dá)穩(wěn)定，可持續(xù)半年以上；4、外源基因定向重組，免疫原性低，極少發(fā)生非特異反應(yīng)和免疫抑制，適合于進(jìn)行基因治療研究。技術(shù)流程：1、病毒載體構(gòu)建2、腺相關(guān)病毒包裝3、腺相關(guān)病毒濃縮與純化4、病毒滴度檢測(cè)腺相關(guān)病毒包裝常用質(zhì)粒圖譜：附1:12種不同血清型AAV對(duì)各組織器官細(xì)胞的親和性血清型組織親和性AAV1肌肉，心臟，骨骼肌（包括心肌），神經(jīng)組織AAV2中樞神經(jīng)，肌肉，肝臟，腦組織，眼，AAV3肌肉，肝臟，肺，眼AAV4中樞神經(jīng)，肌肉，眼，腦AAV5肺，眼，中樞神經(jīng)，關(guān)節(jié)滑膜，胰腺AAV6肺，心臟AAV7

13、肌肉，肝臟AAV8肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉AAV9心臟，肌肉，肺（肺泡），肝臟，中樞神經(jīng)DJ肝臟，視網(wǎng)膜，肺，腎臟DJ/8肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉Rh10肺，心臟，肌肉，中樞神經(jīng)，肝臟附2:常見(jiàn)的病毒載體及生物學(xué)特性比較：隨著基因治療的廣泛應(yīng)用，科學(xué)家們陸續(xù)開(kāi)發(fā)出多種病毒載體，用于外源基因?qū)氚屑?xì)胞或組織。這些病毒載體各有優(yōu)點(diǎn)，其中，慢病毒包裝簡(jiǎn)單、周期短、可穩(wěn)定表達(dá)；腺病毒滴度高、感染及表達(dá)蛋白的能力強(qiáng)；腺相關(guān)病毒安全性高、表達(dá)穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)中，均需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行實(shí)際選擇。特將這三種病毒的生物學(xué)特性整理如下：慢病毒LLentivirus)腺相關(guān)病毒（AAV）腺病毒(Adenovirus

14、)病毒類(lèi)型RNAssDNAdsDNA包裝容量8kb<5kb8kb包膜有無(wú)無(wú)顆粒直徑90-100nm20-30nm60-90nm包膜有無(wú)無(wú)基因組dsRNAssDNAdsDNA表達(dá)起始時(shí)間48-72h72-96h24-48h表達(dá)持續(xù)時(shí)間>2months>6months1month宿主基因組整合方式隨機(jī)高頻整合定向低頻整合或非整合非整合親噬性感染譜廣感染譜廣感染譜廣免疫原性低低高主要缺點(diǎn)隨機(jī)整合存在引發(fā)包裝容量小免疫原性低，無(wú)致病性腫瘤的可能性主要優(yōu)點(diǎn)在大部分組織中獲得穩(wěn)定表達(dá)免疫原性強(qiáng)大部分組織都可以獲得較局感染效率附3:如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的病毒載體項(xiàng)目慢病毒（LV）腺病毒

15、（Ad）腺相關(guān)病毒（AAV）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)靜脈注射-+定點(diǎn)注射+細(xì)胞回輸+-體外實(shí)驗(yàn)過(guò)表達(dá)+-干擾+-MicroRNA+-前沿研究CRISPR/Cas9+-CAR-T+-自噬+-光遺傳+-+附4:病毒包裝常見(jiàn)問(wèn)題與解答綜合問(wèn)題1、病毒包裝的關(guān)鍵是什么？病毒包裝的幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)就是細(xì)胞因素、載體系統(tǒng)（盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng)）、構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制（24、48小時(shí)的細(xì)胞及熒光狀態(tài)判斷）、目的基因?qū)Σ《景b影響（基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會(huì)影響到是否能包裝成功）。2、病毒載體種類(lèi)應(yīng)如何選擇？答：穩(wěn)定長(zhǎng)時(shí)表達(dá)研究選擇慢病毒，比如穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選；病毒使用量大選擇

16、腺病毒，比如老鼠實(shí)驗(yàn)；基因治療選擇腺相關(guān)病毒。操作難度上慢病毒與腺病毒都差不多，是指重組病毒的制備和純化角度來(lái)說(shuō)的，AAV的制備就更復(fù)雜更難一些。從載體毒性而言，慢病毒毒性較大，但它相對(duì)較少引起受體的免疫原性，而腺病毒則有較大的免疫原性。腺相關(guān)病毒載體是比較理想的基因治療載體，免疫原性較低，而且對(duì)受體傷害較少。從插入目的基因角度考慮，慢病毒最大插入基因長(zhǎng)度是5k,腺病毒最大插入基因長(zhǎng)度是8k,腺相關(guān)病毒最大插入長(zhǎng)度是3k。（具體可參考附2:常見(jiàn)的病毒載體及生物學(xué)特性比較）至于具體是選擇腺病毒好，還是慢病毒或別的病毒載體好，主要還看你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模浯尾攀强茨哪欠N病毒載體容易做。金開(kāi)瑞的研究人員有

17、豐富的病毒研究和使用經(jīng)驗(yàn)，咨詢我們的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)，您可以獲取更多幫助。3、病毒載體對(duì)目的基因的長(zhǎng)度是否有要求？AAV的總包裝容量是4.7kb,載體中ITRs（兩個(gè)ITR共290bp）+hCMV約750bp）+polyA（約150bp）約1200bp，所以如果用AAV包裝載體，目的基因長(zhǎng)度要求不超過(guò)3.5kb。相對(duì)應(yīng)慢病毒目的基因長(zhǎng)度不超過(guò)5kb，腺病毒載體目的基因長(zhǎng)度要求不超過(guò)8kb。4、如何選擇合適的啟動(dòng)子用于體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)？部分質(zhì)粒載體的啟動(dòng)子所含GC含量比較高，所以進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)表觀遺傳學(xué)信號(hào)通路，對(duì)其進(jìn)行甲基化修飾或者在染色體整合位點(diǎn)進(jìn)行去乙酰化修飾從而抑制基因的表達(dá)。體外細(xì)

18、胞的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)偶爾發(fā)生類(lèi)似修飾，但比較罕見(jiàn)。所以，針對(duì)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尤其是利用病毒載體制備轉(zhuǎn)基因或者基因敲除、RNA干擾小鼠等，需要選擇恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子才能表達(dá)外源插入片段。我們擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，我們的啟動(dòng)子庫(kù)可以幫助研究人員選擇合適的啟動(dòng)子用于特定的實(shí)驗(yàn)。5、什么時(shí)候需要使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)？誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)無(wú)論是對(duì)于體外基因功能研究還是體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，都是非常有用的一套系統(tǒng)，當(dāng)研究遇到以下情況時(shí)，建議使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：a、 所表達(dá)基因或者外源片段具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、引起細(xì)胞毒性等特性；b、 需要在特定時(shí)間開(kāi)啟或關(guān)閉外源片段的表達(dá)。6、成功構(gòu)建誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵是什么？一個(gè)成功的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，需要達(dá)到以下效

19、果：a、對(duì)于誘導(dǎo)激活系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，需要在未激活前保持很低的表達(dá)水平，而激活后，能迅速地高水平并且穩(wěn)定表達(dá)。b、對(duì)于誘導(dǎo)關(guān)閉系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，需要在關(guān)閉前可以維持正常的表達(dá)水平，而添加誘導(dǎo)關(guān)閉物后，能迅速?gòu)氐椎仃P(guān)閉基因的表達(dá)。而影響誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功的因素主要有以下幾點(diǎn)：a、誘導(dǎo)表達(dá)載體自身調(diào)控元件：包括啟動(dòng)子的強(qiáng)弱、啟動(dòng)子對(duì)誘導(dǎo)物的響應(yīng)效果、載體啟動(dòng)子外其它調(diào)控元件對(duì)插入片段表達(dá)的影響。解決方案包括使用組合誘導(dǎo)物以達(dá)到更佳效果，改造其它調(diào)控元件以減少泄露表達(dá)。b、穩(wěn)定整合位點(diǎn)：由于構(gòu)建誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)必須在穩(wěn)定細(xì)胞株中實(shí)現(xiàn)，所以，穩(wěn)定整合位點(diǎn)附近的轉(zhuǎn)錄活性對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)影響很大。轉(zhuǎn)錄活性過(guò)低，導(dǎo)致誘導(dǎo)激活效

20、果不佳，轉(zhuǎn)錄活性過(guò)高，導(dǎo)致誘導(dǎo)激活前表達(dá)水平過(guò)高或者誘導(dǎo)關(guān)閉后仍然有殘留表達(dá)。因此需要構(gòu)建多株穩(wěn)定細(xì)胞株，并進(jìn)行比較，挑取誘導(dǎo)前后均符合預(yù)期的一株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3）穩(wěn)定整合后拷貝數(shù)：拷貝數(shù)過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)激活前表達(dá)水平過(guò)高或者誘導(dǎo)關(guān)閉后仍然有殘留表達(dá)。所以建議使用逆轉(zhuǎn)錄（包括慢病毒）載體獲得單拷貝細(xì)胞穩(wěn)定株。7、如何使用病毒液去感染靶細(xì)胞？不同的重組病毒載體，不同的細(xì)胞，以及動(dòng)物體內(nèi)組織細(xì)胞侵染，其具體的操作步驟都有所不同。所以建議研究人員依據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)選擇不同的操作步驟。8、病毒可以高效感染任何靶細(xì)胞嗎？理論上，現(xiàn)有的病毒載體可以在任何條件下高效感染任何靶細(xì)胞。其依據(jù)是，病毒載體高效感染細(xì)胞主要

21、受三個(gè)參數(shù)影響：細(xì)胞特性：分裂和非分裂細(xì)胞、體內(nèi)所處環(huán)境是否存在血腦屏障等阻礙。現(xiàn)有的病毒載體，綜合起來(lái)，既可以侵染分裂細(xì)胞，也可以侵染非分裂細(xì)胞，而且還可以突破血腦屏障高效侵染腦神經(jīng)細(xì)胞。細(xì)胞種類(lèi)：不同組織細(xì)胞。雖然不同載體對(duì)不同組織細(xì)胞的侵染有傾向性，但通過(guò)改造病毒載體決定病毒表面糖蛋白的序列，即使針對(duì)同一類(lèi)病毒，也可以獲得最高達(dá)數(shù)百種不同侵染特性的載體系列，從而可以滿足不同細(xì)胞類(lèi)型的侵染需求。病毒載體的滴度。除不同類(lèi)病毒其滴度會(huì)不同外，病毒載體的滴度還受包裝片段的特性影響，包括插入片段的毒性和大小。外源片段的毒性可以通過(guò)使用誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)或者改造病毒包裝細(xì)胞系來(lái)減輕毒性影響，而插入片段的大

22、小的影響可以通過(guò)選擇對(duì)外源片段具不同容納能力的病毒載體來(lái)避免。金開(kāi)瑞擁有龐大的病毒載體庫(kù)，可以最廣程度地覆蓋各種組織細(xì)胞，同時(shí)可以覆蓋不同特性的細(xì)胞，還擁有各種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和經(jīng)過(guò)改造的病毒包裝細(xì)胞系可以包裝具有細(xì)胞毒性的外源插入片段。9、如何才能用重組病毒載體在細(xì)胞上做出滿意的結(jié)果？病毒載體在細(xì)胞試驗(yàn)中要想取得滿意的結(jié)果，主要在以下幾個(gè)方面：病毒載體在不同的細(xì)胞由于細(xì)胞表面受體的差異而不同轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不同，盡量選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高的細(xì)胞，可用參考文獻(xiàn)報(bào)道和轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)告基因進(jìn)行篩選。良好的細(xì)胞狀態(tài)。最好在細(xì)胞狀態(tài)最佳時(shí)感染病毒。特別是不要在消化細(xì)胞后不久就感染，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞膜上的病毒受體往往受到了暫時(shí)的破壞，

23、應(yīng)該培養(yǎng)過(guò)夜后再感染病毒，效果較好。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)MOI（病毒基因組數(shù)/細(xì)胞的比），一般可用105上下做倍比稀釋。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)體積，如24孔板可用200ul,6孔板0.5ml。轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間為1-2h，每25分鐘晃動(dòng)培養(yǎng)板混勻一次。（轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，最好換用無(wú)血清培養(yǎng)基，因?yàn)檠鍖?duì)病毒的感染有些許不利影響）可加合適輔助藥物刺激，增強(qiáng)表達(dá)。適當(dāng)表達(dá)檢測(cè)時(shí)間，如是分泌蛋白可每24h連續(xù)取培養(yǎng)上清檢測(cè)。通常蛋白表達(dá)量在幾百納克至幾微克/ml水平。10、如何才能用病毒載體在動(dòng)物體內(nèi)做出滿意的結(jié)果？病毒載體在動(dòng)物試驗(yàn)中要想取得滿意的結(jié)果，主要注意以下幾個(gè)方面：選擇適當(dāng)?shù)难逍停豪绮煌腁AV血清型在動(dòng)物體內(nèi)同一組織有不同

24、的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，如AAV1在肌肉組織中、AAV5在肺組織中有很高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。選擇適當(dāng)?shù)陌衅鞴伲和谎逍虯AV在不同的組織具有不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，盡量選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高的靶器官。轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：盡量選擇局部直接多點(diǎn)注射靶器官。轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒量：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，所加病毒量太多表達(dá)量反而會(huì)降低。檢測(cè)時(shí)間：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)不同基因的表達(dá)高峰時(shí)間是不同的，一般在2周可檢測(cè)到基因表達(dá)，如無(wú)抗體產(chǎn)生的影響，基因的表達(dá)可持續(xù)表達(dá)半年以上的時(shí)間。11、用于體內(nèi)試驗(yàn)的重組病毒，是否要求純化？是的，病毒純化很有必要。因?yàn)榧?xì)胞裂解液包含有缺損顆粒、大量的病毒外殼和penton蛋白（細(xì)胞毒素）、培養(yǎng)基、血清以及細(xì)胞碎片。這些雜質(zhì)如果被注入動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)引起

25、宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。另外，純化的作用還包括可以將病毒濃縮至一定濃度便于注射、使病毒懸浮于適于體內(nèi)注射的緩沖液中等。12、病毒可以濃縮或稀釋嗎？方法如何？可以濃縮：對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室用戶，可以采用高速離心辦法濃縮。目前市面上的病毒濃縮純化辦法很多，有不少商業(yè)化產(chǎn)品。不同的病毒純化辦法不同。腺病毒載體可以用300K以下的濃縮離心管（PALL公司產(chǎn)品）進(jìn)行濃縮。一般來(lái)說(shuō)濃縮后的滴度以不超過(guò)3X1012v.p/ml為宜，過(guò)濃可能導(dǎo)致病毒聚集而產(chǎn)生沉淀。可以稀釋?zhuān)涸趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中稀釋病毒產(chǎn)品的等滲溶液沒(méi)有其他特殊要求，常規(guī)的動(dòng)物試驗(yàn)用等滲溶液即可，如PBS生理鹽水等。稀釋后的樣品盡量一次用完。13、病毒一定要濃

26、縮么？病毒一般可以收兩次，可以在48h和72h各收一次。如果你不想麻煩濃縮病毒的話，也可以不濃縮，直接將收集的病毒上清作為要感染的細(xì)胞的培養(yǎng)基，但是可能效果會(huì)不太好。并且一般收病毒時(shí)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)損耗了很多，那樣直接培養(yǎng)感染細(xì)胞會(huì)損害細(xì)胞，所以建議還是進(jìn)行濃縮后再感染。14、VP，PFU，IFU的區(qū)別？哪一個(gè)能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？VP：病毒顆粒（viralparticle）,是“活”（有感染性）和“死”（無(wú)感染性）的腺病毒顆粒的總量。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，它代表了進(jìn)入肌體可能引起宿主針對(duì)腺病毒的免疫反應(yīng)的腺病毒顆粒總量。測(cè)定方法是OD260法，只有經(jīng)過(guò)純化的腺病毒才能通過(guò)此方法測(cè)定

27、VP/ml值。PFU空斑形成單位（plaqueformationunit）,是有感染性的“活”的腺病毒的總量，即腺病毒得活性單位。測(cè)定方法是將腺病毒樣品經(jīng)過(guò)一系列梯度稀釋后，感染293細(xì)胞并培養(yǎng)，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞病變空斑數(shù)得到腺病毒樣品中PFU/ml值。IU:感染單位（infectiousunit）,和PFU一樣，是另一種腺病毒活性單位。測(cè)定方法是TCID50法。VP/PFU或VP/IU的值是判斷腺病毒純品中活病毒所占比例的重要依據(jù)。如果該病毒產(chǎn)品要用于人體實(shí)驗(yàn)，按中國(guó)生物制品質(zhì)量要求，該比值應(yīng)該在33以下。用于普通實(shí)驗(yàn)研究，該比值要求可以適當(dāng)放寬。15、感染細(xì)胞最佳MOI的測(cè)定？MOI（Mult

28、iplicityofInfection，感染復(fù)數(shù)）是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達(dá)量越高。對(duì)于分裂活躍的細(xì)胞，比如HeLa、293細(xì)胞，MOI=1時(shí)，80%以上的細(xì)胞均表達(dá)目的基因。而對(duì)于非分裂細(xì)胞，比如原代細(xì)胞，感染效率較低。我們建議通過(guò)比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），選擇適合的MOI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（可以考慮選用攜帶報(bào)告基因的病毒，比如Lenti-EGFP）。16、重組病毒產(chǎn)品如何運(yùn)輸和保存？病毒產(chǎn)品一般采取干冰運(yùn)輸。避免重組病毒反復(fù)凍融，請(qǐng)酌情分裝后于-80保存，建議不要在-20下長(zhǎng)期保存。在我們提供的保存液中，病毒產(chǎn)品-

29、80保存期為半年。建議保存612個(gè)月以上的樣品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，重新測(cè)一次滴度。病毒產(chǎn)品解凍后最好保持在冰浴中，并盡快使用。如果解凍后的病毒一時(shí)用不完，滴度足夠高時(shí)，4可保存12周。但最好盡快用完，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，4放置1周，滴度會(huì)有45倍的下降。17、所提供這些病毒產(chǎn)品的安全性如何？使用病毒載體的危險(xiǎn)性主要有以下幾個(gè)考慮因素：a、是否能重組產(chǎn)生致病性病毒；b、是否具備復(fù)制能力；c、是否能整合，并導(dǎo)致癌基因激活或者抑癌基因失活；d、免疫原性。金開(kāi)瑞所使用的病毒載體，全部經(jīng)過(guò)改造，去除了致病性元件和復(fù)制功能區(qū)，因此重組產(chǎn)生功能性病毒的概率極低。一部分病毒（腺病毒和腺相關(guān)病毒載體），其整合幾率低，因此

30、安全性高。同時(shí)，針對(duì)部分具備整合能力的病毒載體（慢病毒載體），還去除了其3LTR內(nèi)的激活元件，排除了其激活下游基因的能力。因此，這些病毒載體用于體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)使用者而言都具有極高的安全性。有的病毒載體，比如腺相關(guān)病毒載體，即使用于人體，也被認(rèn)為是安全性非常高的一類(lèi)基因治療載體。盡管如此，我們建議，使用病毒載體進(jìn)行細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要遵循標(biāo)準(zhǔn)廢棄病毒載體操作流程。18、如何保證病毒包裝實(shí)驗(yàn)室安全？病毒載體已經(jīng)被全世界許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)任何意外，但仍具有潛在的產(chǎn)生復(fù)制型病毒（RCD和致癌的風(fēng)險(xiǎn)，操作者在實(shí)驗(yàn)中仍需要保持高度警惕！所有操作均應(yīng)盡量在BSL2級(jí)生物安全柜中進(jìn)行，并佩戴一次

31、性口罩和手套，尤其要避免病毒接觸口、眼、鼻、耳、傷口等身體開(kāi)放性區(qū)域，避免產(chǎn)生氣溶膠，tip頭一定要選擇帶有濾芯的。必須高度注意被污染的尖銳物品，包括針頭、注射器、載玻片、移液管、毛細(xì)玻璃吸管和解剖刀。每次實(shí)驗(yàn)后，立即清理所有接觸過(guò)病毒的器具，均應(yīng)高壓消毒再進(jìn)行下一步處理。顯微鏡臺(tái)、生物安全柜臺(tái)面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外灑落的含病毒的液體，用衛(wèi)生紙吸干后，用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡被污染處1h。裝盛病毒載體的實(shí)驗(yàn)用品，要單獨(dú)放置，標(biāo)示清楚，并標(biāo)注“危險(xiǎn)品”字樣。盡量使用培養(yǎng)瓶，不要使用培養(yǎng)板來(lái)感染病毒，以防意外灑落。對(duì)共用實(shí)驗(yàn)室的人員進(jìn)行病毒安全培訓(xùn)或提示。關(guān)于慢病毒1、慢病毒載體的特

32、點(diǎn)及應(yīng)用范圍？慢病毒載體是有包膜的RNAW毒，可以感染分裂和非分裂細(xì)胞（而逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染有絲分裂活性的細(xì)胞），在感染宿主細(xì)胞后不能自我復(fù)制。以水泡口炎病毒（VesicularStomatitisVirus）包膜G蛋白VSV-G替換野生型包膜蛋白，使重組慢病毒感染范圍覆蓋了各種傳代和原代的腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，以及干細(xì)胞、T細(xì)胞等。2、金開(kāi)瑞生物的重組慢病毒使用何種系統(tǒng)？金開(kāi)瑞生物使用第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，包括3個(gè)輔助質(zhì)粒、1個(gè)用于插入目的基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，三個(gè)毒粒組裝必須的基因（Pol,Gag,Rev）被分開(kāi)裝載于不同的質(zhì)粒上，包裝過(guò)程中必須4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)才能成功出毒

33、，最大限度降低了重組概率。同時(shí)三代轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的5和3'LTR都刪除缺失了野生型的U3,成為不能自我復(fù)制的自滅活（SIN）載體。3、慢病毒載體生物安全性如何？重組慢病毒載體已經(jīng)刪除了所有野生型毒性基因，感染細(xì)胞后只表達(dá)裝載的目的基因，不表達(dá)任何野生型病毒的基因，自滅活序列修飾使其不能復(fù)制，包膜糖蛋白做了pseudotyped替換為VSV-G因此三代包裝系統(tǒng)的改造保證了慢病毒載體的生物安全性，目前未有致瘤報(bào)道。4、影響慢病毒產(chǎn)量的因素有哪些？包裝過(guò)程中，慢病毒的產(chǎn)量隨著插入片段的增大而呈指數(shù)下降，一般當(dāng)目的基因2k時(shí)即會(huì)可見(jiàn)顯著的出毒效率降低，當(dāng)接近4k時(shí)，其出毒量會(huì)低至可以使用的下限、或幾

34、乎不出毒。插入序列的G3量70%寸，產(chǎn)量會(huì)受到影響。一些對(duì)包裝細(xì)胞有毒性的基因，也會(huì)導(dǎo)致難以產(chǎn)毒。5.、慢病毒載體可以容納多大的插入基因？整個(gè)慢病毒基因組在5'和3'LTR之間的最大容納能力約9k,由于轉(zhuǎn)移載體中各種表達(dá)原件的存在，載體的實(shí)際裝載極限在4k左右。一般3.5k的基因已無(wú)法作產(chǎn)量保證。6、該如何選擇轉(zhuǎn)移載體？根據(jù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用需求，主要從啟動(dòng)子、熒光/抗性標(biāo)簽等角度選擇載體所攜帶的原件。過(guò)表達(dá)目的序列（包括編碼基因、非編碼RNA時(shí)通常選擇CMW動(dòng)子，某些情況可能使用EF1a啟動(dòng)子；進(jìn)行shRNA干擾時(shí)通常選擇U6啟動(dòng)子。后續(xù)進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選時(shí)，需攜帶如Puro的抗性篩選基因

35、。攜帶GFP、mCherry等熒光蛋白便于直觀監(jiān)測(cè)病毒感染效率，但在后續(xù)的免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)中，可能會(huì)由于波長(zhǎng)范圍干擾而帶來(lái)不便，例如GFP同F(xiàn)ITC互相干擾。另外當(dāng)目的基因較大時(shí)，攜帶不必要的熒光或篩選元件會(huì)進(jìn)一步降低出毒效率。7、慢病毒感染后多長(zhǎng)時(shí)間可見(jiàn)目的基因表達(dá)？通常慢病毒介導(dǎo)的目的基因表達(dá)通常在72h左右達(dá)到高峰，大多數(shù)后續(xù)檢測(cè)可在此階段進(jìn)行。對(duì)于代謝快速的細(xì)胞在24h即可看到熒光蛋白等較高表達(dá)的產(chǎn)物，代謝較慢的細(xì)胞可能需要72-96h。8、我以前用過(guò)慢病毒感染造血細(xì)胞，但是表達(dá)不理想，你們有沒(méi)有好的解決辦法？答：影響慢病毒載體介導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)的因素主要是病毒的感染能力和特

36、定的啟動(dòng)子在該細(xì)胞中的強(qiáng)度。VSV-G介導(dǎo)的慢病毒載體對(duì)造血系統(tǒng)的細(xì)胞的感染能力并不合適，除了常規(guī)用的VSV-G外，我們公司還擁有其它8種病毒包膜蛋白庫(kù)，我們會(huì)根據(jù)客戶的需要選擇特定的包膜蛋白，或者是利用特定的啟動(dòng)子，從而使目的基因能在特定的細(xì)胞中得以高表達(dá)。9、你們提供的慢病毒的滴度是如何測(cè)定的？這個(gè)測(cè)定方法如何？我拿到病毒后需要自己測(cè)滴度嗎？我們是在293T細(xì)胞株中對(duì)純化的慢病毒進(jìn)行滴度測(cè)定的。常用有4種方法進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定，分別是：通過(guò)ELISA對(duì)病毒顆粒中的p24蛋白進(jìn)行檢測(cè)；通過(guò)定量PCR寸病毒顆粒的RNA®行檢查；通過(guò)定量PCR寸整合到基因組DNA中的病毒序列進(jìn)行檢測(cè)；

37、通過(guò)FACS對(duì)熒光蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。我們用基因組DNAt量PCR勺方法和熒光法進(jìn)行慢病毒滴度的檢測(cè)。前兩種方法并不能區(qū)分病毒顆粒是否有活性，因此測(cè)定所得的滴度往往比后兩種方法高一至兩個(gè)數(shù)量級(jí)。后兩種方法確定的是有效的病毒滴度，因此更有意義。由于并非所有的病毒載體中都含有熒光蛋白，此外，熒光蛋白的表達(dá)有時(shí)候還受啟動(dòng)子及表達(dá)的目的基因影響，因此通過(guò)整合到基因組中的病毒序列進(jìn)行檢測(cè)是最佳方法。關(guān)于腺病毒1、腺病毒載體對(duì)目的基因的長(zhǎng)度是否有要求？有要求。對(duì)E1和E3雙缺失的腺病毒載體，比如AdMax的KitC、KitD等，其總包裝的外源片斷要求小于8kb。而對(duì)于只有E1缺失或E3缺失的載體，比如

38、KitA、KitB等，外源片斷要求小于5kb。注意，外源片斷指包括啟動(dòng)子、外源基因和polyA等在內(nèi)的整個(gè)插入片斷。2、我的試驗(yàn)需要多少總量的腺病毒載體？腺病毒介導(dǎo)外源基因的基因治療研究一般分為體外培養(yǎng)細(xì)胞試驗(yàn)（體外試驗(yàn)）和動(dòng)物試驗(yàn)（體內(nèi)試驗(yàn)）兩部分，不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需要的病毒量也不盡相同。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，完成一個(gè)完整的腫瘤治療實(shí)驗(yàn)需要腺病毒的病毒量總量約為3X1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，關(guān)鍵應(yīng)該是在病毒包裝過(guò)程和擴(kuò)增過(guò)程。純化過(guò)程只是去掉有缺陷的病毒和細(xì)胞碎片等容易引起機(jī)體免疫反應(yīng)的過(guò)程，如果擴(kuò)增的病毒滴度高，那么純化后就會(huì)更高的。4、克隆到轉(zhuǎn)移載體的基因中的5&

39、#39;和3'UTR（未翻譯區(qū)）的額外的堿基會(huì)影響蛋白表達(dá)嗎？UTR盡可能短一些，特別是在5'要避免在mRNAl形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。在起始密碼子ATG前面可以加一小段（6-9bp）的堿基序列可以增強(qiáng)目的基因的表達(dá)，比如Kozak序列（GCCGCCACCATG）5、如何判斷腺病毒載體是否能高效感染某種細(xì)胞？參照文獻(xiàn)報(bào)道是最簡(jiǎn)單的辦法，也可以用帶報(bào)告基因的腺病毒先行預(yù)實(shí)驗(yàn)。Ad5能高效感染絕大多數(shù)人類(lèi)、小鼠等的體細(xì)胞（包括分裂和非分裂細(xì)胞），比如肝、肌肉、神經(jīng)組織等。但對(duì)血液系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞，比如乳腺癌、白血病細(xì)胞等，感染效率較低。6、腺病毒載體在體外實(shí)驗(yàn)（invitro）中應(yīng)

40、注意哪些問(wèn)題？1）由于細(xì)胞表面受體的差異，腺病毒載體在不同的細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不同。可根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道或用帶報(bào)告基因的腺病毒載體判斷病毒用量。2）在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)感染病毒效果較好。避免在消化細(xì)胞后立刻感染病毒，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞膜上的病毒受體往往受到了暫時(shí)的破壞。培養(yǎng)過(guò)夜后再感染病毒，效果較好。3）選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)MOI（病毒感染單位數(shù)/細(xì)胞數(shù)），可以在MOI為0.11000范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)（10倍比稀釋?zhuān)?）感染病毒時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液的體積盡量小一些，以完全覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。如24孔板可用200ul，6孔板1ml。5）感染時(shí)間為90分鐘，每15分鐘輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)液一次，以混勻。6）選擇適當(dāng)表達(dá)檢測(cè)時(shí)間，一般感染病

41、毒24h后就能檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，48小時(shí)表達(dá)達(dá)到較高水平。7、用于體內(nèi)試驗(yàn)的腺病毒，是否要求純化？是的，病毒純化是很必要的。因?yàn)榧?xì)胞裂解液包含有缺損顆粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（細(xì)胞毒素）、培養(yǎng)基、血清以及細(xì)胞碎片。這些雜質(zhì)如果被注入動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。另外，純化的作用還包括可以將病毒濃縮至一定濃度便于注射、使病毒懸浮于適于體內(nèi)注射的緩沖液中等。8、如果我的實(shí)驗(yàn)中需要將重組腺病毒注射入動(dòng)物體內(nèi)，如果貴公司提供的純化產(chǎn)品比較濃，需要如何稀釋病毒產(chǎn)品，有特殊要求嗎？在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中稀釋病毒產(chǎn)品的等滲溶液沒(méi)有其他特殊要求，常規(guī)的動(dòng)物試驗(yàn)用等滲溶液即可，如PBS生理鹽水等。稀釋后的樣品盡量一次用完，在沒(méi)有保護(hù)劑的情況下，腺病毒在28c保存時(shí)間越短越好。9、小鼠體內(nèi)注射腺病毒，一只小鼠肌注大概多少量？體內(nèi)表達(dá)時(shí)間和表達(dá)高峰如何？大部分文獻(xiàn)顯示，腺病毒用量范圍在108-10IU/只小鼠。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，小鼠肌注腺病毒后，34天目的蛋白的表達(dá)達(dá)到高峰，一周后逐漸下降，持續(xù)表達(dá)時(shí)間在兩周左右。10、腺病毒載體對(duì)小鼠的半致死劑量（LD50）大概是多少？根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，靜脈注射小鼠（昆明鼠），半致死劑量LD50大約為1X1011v.p./只；裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50