1、第33卷第9期2011年9月中國預防獸醫學報ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineVol.33,No.9Sep.2011doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2011.09.08熒光定量RT-PCR方法與兔體定型熱試驗對于檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的平行關系葛葉”，張興娟I,朱慶虎2,韓秋影I,王牟平2,李偉杰2,孫建宏2,仇華吉、(I.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所善醫生物技術國家重點實驗室/豬傳染病研究室，黑龍遼哈爾濱150001;2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所維科生物技術開發公司.黑龍江哈爾濱150069)摘要：為探討熒

2、光定量RT-PCR技術與傳統兔體定型熱試臉時于檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的平行關系，本研究采用熒光定量RT-PCR方法與兔體定型熱試驗對5份豬瘟兔化弱毒細胞苗成品和6份半成品樣品進行平行檢測。結果表明，兩種檢測方法存在正相關性，最低10s個病毒拷貝可以使家兔產生定型熱反應，最低IO,個病毒拷貝可以使家兔產生輕熱反應。熒光定量RT-PCR檢測方法的檢測過程僅需3.5h,大大縮短了豬瘟疫苗的檢測時間，該方法可以補充傳統的兔體定型熱反應用于豬瘟兔化弱毒疫苗半成品與成品的檢驗。關鍵詞：豬瘟兔化弱毒疫苗；熒光定量RT-PCR;兔體定型熱試驗中圖分類號：S852.5文獻標識碼：A文章編號：1008-0589(2

3、011)09-0699-05Parallelrelationshipbetweenreal-timeRT-PCRandfeverreactionmethodinrabbitsfortestinghogcholeralapinizedvirusvaccinesGEYe”，ZHANGXing-juan1,ZHUQing-hu2,HANQiu-ying1,WANGMu-ping2,LIWci-Jie2,SUNJian-hong2,QIUHua-ji1收稿日期：2011-01-11基金項目：國家科技支撐計劃(2006BAD06A03)作者簡介：葛葉(1982-),女，河北秦皇島人，碩士,LIWci-J

4、ie2,SUNJian-hong2,QIUHua-ji1收稿日期：2011-01-11基金項目：國家科技支撐計劃(2006BAD06A03)作者簡介：葛葉(1982-),女，河北秦皇島人，碩士,通信作者：E-mail:qiuhuaji(I.DivisionofSwineInfectiousDiseases,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001,China;2.HarbinWeik

5、cBiotechnologyDevelopmentCompany,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150069,China)Abstract:Toevaluateaparallelrelationshipbetweenthereal-timeRT-PCRmethodandfeverreactionmethodinrabbits,wcdetected5finishedand6semi-finishedproductsofhogcholeralapinizedvirus(HCL

6、V)vaccines.Theresultsshowedthatbothmethodshadpositivecorrelation,105copiesofHCLVwereabletoinducetypicalfeverreactionand10copiesinducemoderatefeverreactioninrabbits.Only3.5hourswasneededforthereal-timeRT-PCR,indicatingthatthereal-timeRT-PCRcouldbeanalternativetotraditionalfeverreactiontestforHCLVvacc

7、inedosagedeterminationinrabbits.Keywords：hogcholeralapinizedvirus;real-timeRT-PCR;feverreactionmethodinrabbits豬瘟是由豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一種嚴重威脅養豬業的病毒性疾病，他界動物衛生組織(OIE)將其列為須呈報的動物傳染病，我國也將其列為一類傳染病3】。目前用于豬瘟免疫接種的疫苗主要是豬瘟兔化弱毒細胞苗(HogCorrespondingauthorcholeralapinizedvirus,HCLV),疫苗的半成品、成品的效價測定

8、需將待檢樣品稀釋后經耳緣靜脈注射試驗兔，連續4d測定兔體溫變化獲得，該方法費時、費力、費錢鑒于熒光定量RT-PCR方法可以對兔體組織中的豬瘟病毒含最進行實時監測，具主要從事豬瘟疫苗定墳監測方法研究.有特異、敏感、快速、高通處和實時等優點網。本研究將熒光定量RT-PCR技術與傳統兔體定型熱試驗進行平行比較，通過優化方案，多次重復試驗表明，熒光定量RT-PCR檢測方法可以補充傳統的兔體定型熱試驗用于疫苗生產過程中的半成品及成品疫苗的檢驗，可應用該方法以縮減檢驗周期。1材料和方法1.1疫苗和半成品HCLV株由哈爾濱維科生物技術開發公司提供；疫苗半成品為初生犢牛睪丸細胞培養上清，收獲后-20-C保存備

9、用；隨機抽取5批次豬瘟細胞疫苗成品和6批半成品備檢。1.2主要實驗材料QIAampViralRNAKit提取試劑盒購自QIAgen公司；DEPC購自Promcga公司；HotStartExTaqDNA聚合酶、ReverseTranscriptaseXL(AMV).MgCl2(25mM)、RNA酶抑制劑(HPRI)和dNTP(10mM和2.5mM)購自寶生物工程(大連)有限公司；體質最為1.5kg3.0kg的新西蘭大耳白兔購自哈爾濱坤達養殖場。1.3兔體定型熱反應法測定疫苗半成品及成品豬瘟兔化弱毒疫苗效價測定按規程進行，即將樣品用生理鹽水稀釋后，每個樣品接種2只試驗兔，停只經耳緣靜脈注射ImL,

10、接種后，上下午各測定體溫1次，48h后，每隔6h測定體溫1次，根據體溫反應和接種結果進行綜合判定。結果判定如下：定型熱反應(+):潛伏期48h96h,體溫上升呈明顯曲線，至少有3個溫次超過正常體溫1C以上，并稽留18h36h;輕熱反應(+):潛伏期48h96h,體溫上升呈明顯曲線，至少有2個溫次超過正常0.5-C以上，并稽留12h36h；無反應(-):體溫正常；兩只家兔均呈定型熱反應標記為+/廿，一只呈定型熱反應，另一只呈輕熱反應標記為廿/+,兩只均呈輕熱反應標記為+/+,一只呈輕熱反應而另一只無反應標記為+/,兩只均無熱反應標記為/。1.4引物使用本實驗室構建的位于CSFVNS5B區域的豬瘟

11、兔化弱毒特異性引物(HCLV-F/HCLV-R)和TaqMan水解探針(HCLV.JOE)同。1.5病毒RNA的提取取140jjiL樣品，用QIAampViralRNAKit提取試劑盒提取病毒RNA,具體操作方法參照說明書進行。最后用60piLAVE洗脫液洗脫溶解，直接用于cDNA的合成。1.6反轉錄cDNA的合成取5以病毒RNA,加入到20反轉錄反應體系中，內含4jiL5xRTBuffer2p.LdNTPMixture(各10mM)、50pmol9-mer隨機引物、10uAMV和20uHPRl,42C水浴1h,最后95C5min滅活反轉錄酶1.7疫苗成品與半成品檢測1.7.1熒光定量RT-P

12、CR檢測熒光定量RT-PCR反應總體積25gL,反應體系含10倍系列稀釋的標準品和疫苗樣品的cDNA2jjlL,10xHotStartExTaqBuffer2|xL,HCLV-F、HCLV-R引物各lptL(10pM).HCLV-JOE0.4|iL(1pM),dNTPs0.4p,L(10mM),HotStartExTaq0.25pL,滅菌雙蒸水補齊至25jjlLo反應條件為：95*C5min；95C30s、60C45s,40個循環。每次循環的退火延伸時收集熒光。試驗結束后，根據收集的熒光曲線和Ct值判定結果。1.7.2動物接種試驗為確定熒光定量RT-PCR檢測方法與兔體發熱反應的相關性，將經熒

13、光定量RT-PCR檢測后的疫苗樣品以10倍系列稀釋，按照ImU只的劑量經耳緣靜脈接種試驗兔，測定兔體發熱情況，每6h記錄一次兔體溫變化。為進一步確定熒光定量RT-PCR檢測方法與兔體定型熱反應法的雖化關系，將經熒光定量:RT-PCR檢測后的豬瘟兔化弱毒疫苗按照1000病毒拷貝數/叫、100病毒拷貝數/以、20病毒拷貝數仙L、4病毒拷貝數/|iL、2病毒拷貝數仙L、1病毒拷貝數/皿、0.5病毒拷貝數/piL、0.25病毒拷貝數仙L稀釋后，以ImL/H的劑量:經耳緣靜脈接種試驗兔，每個稀釋度接種3只。接種48h后停隔6h測定體溫，連續測4d,記錄兔體溫變化情況，同時用熒光定量RT-PCR檢測接種后

14、4d家兔脾臟中的總病毒RNA含最。2結果2.1定性試驗隨機選取豬瘟兔化弱毒疫苗樣品3份，分別用兔熱法和熒光定量RT-PCR測定其效價,10倍系列稀釋熒光定量RT-PCR測定的疫苗樣品，耳緣靜脈接種家兔1mL,連續4d記錄兔體溫變化，結果顯示，病毒含量在不低于IO?拷貝61L時均出現定型熱反應(表Do表1熒光定量RT-PCR方法與兔體反應熱方法試驗比較Table1Comparativedetectionusingreal-timeRT-PCRandfeverreactionmethodinrabbits疫苗編號Vaccinebatches拷貝數蝕CopieszjiL徐群度Dilutions生理鹽

15、水Norma)saline1041站I0410,10*IO720090367.66x10*-H-/+nT+/+-/-20090372.86x10，+/+-H/+/+個/+J-20100043.17x10+/+/+/+/+/20091226-14.7x10*H-/+/+/+/-+/+/+20091228-13.6x0H-/44-+/+/+/+-/-20091230-29.86x10*+/+/+/+/.+/-20091230-31.27x1伊+/+/+/-A+/-20100101l.56xl07+/+/-+/+/+/+200912242.4x10*+/+/+/-注：+/+：兩只試臉兔均為定型熱反應

16、；+/+：只試驗兔JL定型然反應，另一只呈輕熱反應；+/+：兩只試驗兔均呈輕熱反應；+/-：兩只試瞼兔一只呈輕熱反應，另一只無反應；-/-：兩只試驗兔均無反應Note:-W-/+:Bothrabbitsshowedfeverreaction;-H-/+:Onerabbitshowedfeverreaction,theothershowedmoderatefeverreaction;+/+:Bothrabbitsshowedmoderatefeverreaction;+/:Onerabbitshowedmoderatethermalreaction,theotherremainednormal;

17、/:Bothrabbitsremainednormal隨機選取6份HCLV半成品，包括同一批次不同收毒時間、不同批次相同收毒時間及不同批次不同收毒時間，用兩種方法進行平行測定。結果顯示，熒光定&RT-PCR測定的效價與兔體發熱法效價測定結果為相同稀釋度，20091226-1批次的疫苗半成品熒光定雖RT-PCR檢測結果為4.7xIO?？截?，該樣品IO,稀釋免疫家兔，1只家兔無發熱反應；將樣品IO?稀釋時，兔體出現輕熱反應，將接種10,和10稀釋度樣品的家兔迫殺.無菊采取脾臟，采用熒光定量RT-PCR檢測，結果顯示，10。稀釋度的樣品檢測結果呈陽性，而10,稀釋度樣品檢測結果為陰性，表明10。稀釋

18、度的病毒樣品在家兔脾臟發生了病毒復制，可能由于家兔的個體差異未出現預期的發熱反應；而10稀釋度病毒樣品在部分家兔出現發熱但在脾臟未發生病毒復制，提示家兔易受非特異性因素影響致使體溫異常升高，這同時顯示了采用家兔發熱法測定疫苗效價存在的弊端。通過熒光定量RT-PCR檢測與兔體發熱比較表明，兩者存在很好的相關性，對3個不同批次的HCLV和6個不同批次的HCLV半成品的定性試驗結果顯示，經過熒光定最RT-PCR檢測的樣品同時按照10倍系列稀釋后接種家兔，使兔體發生不同程度的發熱反應.隨著稀釋倍數增高即病毒含量降低，兔體的發熱反應逐漸減弱（表1）。2.2定量試驗熒光定量RT-PCR測得2010014批

19、次和2010039批次的HCLV效價分別為1.51x106和6.02x0.用生理鹽水倍比稀釋后分別按1mLZ只接種試驗兔，觀測其體溫變化.4d后，無菌摘取試驗兔脾臟，研磨后對兔脾臟的總病毒及病毒負鏈RNA進行熒光定量RT-PCR檢測及熱反應試驗，結果顯示接種1（T個病毒拷貝數可以使兔體產生定型熱反應，接種10,個病毒拷貝數可以使兔體產生輕熱反應（表2、表3）,表明HCLV的兔體最小感染量（RID）為IO,個病毒拷貝數需要指出的是，在發熱法測定過程中，我們發現個別家兔出現異常反應，如編號2010014-21的試驗兔出現類似定型熱反應，2010039-17出現類似輕型熱反應，但用熒光定量RT-PC

20、R檢測該兔脾臟總病毒和病毒負鏈RNA時，結果均呈陰性（即NoCT）,表明這兩只家兔脾臟內未發生病毒復制，該家兔體溫上升可能是在體溫測定過程中擦傷肛門導致；表2中的2010014-18號和表3的2010039-14號試驗兔，并未出現預期的發熱反應，在脾臟內亦無病毒復制，推測是由于兔個體對HCLV不敏感所致。表2熒光定量RT-PCR方法與兔體反應熱方法定試驗比較-1Table2Quantitativecomparisonbetweenreal-timeRT-PCRandfeverreactionmethodinrabbits-1初觥毒拷則wCopies/Lininocuhte試做號Rabbitnu

21、mber鬼體發魏法FeverreactionsinrabbitsRNA找TotalRNAinthespleeniofinoculatedrabbits樓種知牌辰負俄RNAt()RNAinthespleenofinoculatedrabbits20)0014-1X4.04x10s1.16x10*io52010014-2-H-4.70x10*1.22XIO32010014-3+9.31x10*8.86xg20100144W3.61x1/2.53x10*1002010014-53.06x101.45x10*2010014+2.52x10s1.32x10*2010014-72.22X1051.23x1

22、0*20201001*2.04x1/1.I6xI02010014-94.95x1伊2.74x10*2010014-10+2.05x10s1.62x10*42010014-11+2.60XI058.98x10=2010014-124.89x10s2.37x10s2010014-13+1.55x10*8.02x!0J22010014-14+7.10x10s5.68x10*2010014-155.51X1O54.41xIO52010014-16+1.75x10,4.7xlffI2010014-1747.24x1儼4.O5XIO22010014-18NoCTNoCT2010014-19.NoCTNoC

23、T0.52010014-20NoCTNoCT2010014-21-HNoCTNoCT生夏鹽水G1NoCTNoCTNormalsalineC-2.NoCTNoCT表3HCLV熒光定量RT-PCR方法與兔體反應熱方法試驗比較-2Table3Quantitativecomparisonbetweenreal-timeRT-PCRandfisverreactionmethodinrabbits-2Wm接勘兔牌活病lyl兔編號第停邱雷.RNAMRNA依Copies/LinRabbitnumberTotalRNAinthespleen(-)RNAinthespleenofinoculateofinocul

24、atedrabbitsinoculatedrabbits2010039-1L82x渺1.15x10sI052010039-2-H-5.32xKT4.61xlO42010039-35.34x10*1.10x10*20I003MH5.29x10*4.19x10*1002010039-5H6.53x10*1.22x102010039-6+7.56xIO41.03xlO52010039-7+6.43x10*6.81xi(r202010039-8+4.59x10*2.25x10,2010039-96.50xT4.23x10*2010039-102.01x!0*6.47x1/42010039-118.32

25、xlO52.32x10*2010039-126-MxlO4LI7X1042010039-13+1.22x10*4.53x1/22010039-14.NoCTNoCT2010039-153.30x10*5.68xKF2010039-16+4.21x105I.86XI0212010039-17NoCTNoCT2010039-183.75xI059.62xI022010039-19NoCTNoCT0.52010039-20NoCTNoCT2010039-21NoCTNoCT2010039-22NoCTNoCT0.252010039-23NoCTNoCT2010039-24NoCTNoCT生夏缺C-3

26、NoCTNoCTNormalsalineC4NoCTW3討論HCLV以其具有對不同日齡豬無殘余毒力、誘導免疫反應快和可以保護豬只抵抗豬瘟強毒的攻擊等優點，成為國際上公認的最安全、有效的豬瘟疫苗。多年來，在國內外廣泛應用，對豬瘟的控制起到了重要的作用四。疫苗效價的高低是判定疫苗合格與否的關鍵指標。HCLV效價判定常用方法兔體定型熱反應法（兔熱法）存在的突出不足是：不能精確定量；檢測結果易受兔體個體差異和環境因素影響；實驗周期長（至少4d）,費時費力；需要飼養和消耗動物，成本高。因此，如何快速、準確測定疫苗效價是豬瘟疫苗生產中面臨的主要技術難題之一。研究表明，采用微量細胞培養ELISAS和反向間接

27、血凝試驗測定HCLV效價，可以縮短檢測時間，降低生產成本，但不能對毒價進行準確定量近年來發展起來的熒光定量RT-PCR技術以其敏感、快速和特異等特點在基因表達譜分析、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用叫。與兔熱法相比，熒光定量RT-PCR方法敏感、穩定、準確，能有效克服家兔個體反應性差異帶來的誤差，操作步驟簡單、自動化程度高、檢測速度快，整個過程僅需3.5h,齒此它不但能快速對疫苗成品進行準確定量，而且能及時監控疫苗生產中細胞產毒情況，及時淘汰不合格批次。熒光定3RT-PCR檢測所需樣品量和試驗材料較少，大大降低了疫苗的生產成本，也大大減少了對家兔等生物資源的耗費。本研究通過將熒光定量:

28、RT-PCR檢測方法與兔體發熱法進行定性定量比較分析，將熒光定量RT-PCR檢測的HCLV成品、半成品系列稀釋后接種試驗兔，兔體溫變化情況顯示，隨著樣品稀釋倍數的增高，兔體的發熱情況逐漸減輕，與熒光定量RT-PCR測定的結果呈正相關，即熒光定最RT-PCR測得的拷貝數在較低的稀釋度時在兔體上會出現典型的定型熱反應，而稀釋較高的倍數會出現輕度發熱乃至不發熱，表明熒光定量RT-PCR檢測方法與兔體發熱法的結果具有明顯的相關性c為證實兩者的相關性，重復檢測成品、半成品9批，結果一致。為進一步確定兩者的最化關系，本研究采用測定了病毒拷貝數的疫苗稀釋后接種試驗兔，觀察兔體溫變化，結果顯示，當1mL疫苗稀

29、釋液中含有10個病毒拷貝數時兔體呈定型熱反應，1mL稀釋液中含有IO個病毒拷貝數時兔體呈輕熱反應，為證實該結果，重復檢測2批疫苗，結果一致。表明在HCLV檢驗中，熒光定量RT-PCR方法與兔熱法存在正相關性。熒光定量RT-PCR方法檢測的是病毒（包括失活的病毒）RNA含量，間接反映病毒含量，而兔體定型熱試驗直接檢測的是活病毒含量，盡管可以通過檢測病毒負鏈RNA.間接反映活病毒的含量，但兩種檢測結果可能存在一定差異。因此，熒光定量RT-PCR方法可能并不能完全替代傳統的兔熱法用于HCLV半成品與成品的檢驗，但可以作為兔熱法的有益補充。參考文獻：(H股震，劉景華.動物病毒學M.北京：科學出版社，】997：652-664.2王家富.張楚瑜，傅烈振.等.中國豬痕兔化弱毒NS2-3基因的序列分析J.病毒學報.2000,16(2)：150-154.蔡寶祥.家畜傳染病學(M