1、l 上海交通大學醫學院上海交通大學醫學院l 瑞金臨床醫學院瑞金臨床醫學院l 洪秀華教授洪秀華教授 l 從生物體內取出組織或細胞，在體從生物體內取出組織或細胞，在體外外(in vitro)(in vitro)模擬體內生理環境，在無模擬體內生理環境，在無菌、適當溫度和一定營養條件下，對這菌、適當溫度和一定營養條件下，對這些組織或細胞進行孵育培養，使之保持些組織或細胞進行孵育培養，使之保持一定的結構和功能，以便于我們觀察研一定的結構和功能，以便于我們觀察研究，這種方法就是細胞培養（究，這種方法就是細胞培養（cell cell cultureculture）。有時細胞培養也稱為組織培）。有時細胞培養也

2、稱為組織培養（養（tissue culturetissue culture），二者可作為同），二者可作為同義語使用。義語使用。l細胞培養的工作始于細胞培養的工作始于2020世紀初目前廣泛世紀初目前廣泛應用于生物學、醫學的各個領域，并且應用于生物學、醫學的各個領域，并且是各種細胞工程技術的基礎。哈里森是各種細胞工程技術的基礎。哈里森（ HarrisonHarrison，19071907），因此被稱為），因此被稱為“組織培養之父組織培養之父”l（一）培養細胞的類型及其特點（一）培養細胞的類型及其特點l體外培養細胞大多培養在瓶皿等容器中，體外培養細胞大多培養在瓶皿等容器中，根據它們是否能貼附在支持物

3、上生長的根據它們是否能貼附在支持物上生長的特性，可分為貼附型和懸浮型兩大類。特性，可分為貼附型和懸浮型兩大類。l 大多數培養細胞均為貼附型，它大多數培養細胞均為貼附型，它們必須貼附在支持物表面生長，這類們必須貼附在支持物表面生長，這類細胞在體內時各自具有其特殊的形態，細胞在體內時各自具有其特殊的形態，但在體外培養時貼附于支持物后形態但在體外培養時貼附于支持物后形態上表現單一化而失去體內原有的某些上表現單一化而失去體內原有的某些特征，多呈上皮樣或成纖維細胞樣。特征，多呈上皮樣或成纖維細胞樣。l貼附細胞型貼附細胞型MRC-5成纖維細胞成纖維細胞 貼附型細胞正常猴腎單層上皮細胞貼附型細胞正常猴腎單層

4、上皮細胞l接觸抑制：接觸抑制：正常貼附型細胞具有接觸抑正常貼附型細胞具有接觸抑制的特性，細胞相互接觸后可抑制細胞制的特性，細胞相互接觸后可抑制細胞的運動，因此細胞不會相互重疊于其上的運動，因此細胞不會相互重疊于其上面生長。面生長。l密度抑制：密度抑制：細胞生長、匯合成片后，雖細胞生長、匯合成片后，雖發生接觸抑制，但只要營養充分，仍可發生接觸抑制，但只要營養充分，仍可增殖分裂，但當細胞數量達到一定密度增殖分裂，但當細胞數量達到一定密度后，由于營養的枯竭和代謝物的影響，后，由于營養的枯竭和代謝物的影響，細胞分裂停止，稱為密度抑制。細胞分裂停止，稱為密度抑制。l腫瘤細胞的接觸抑制及密度抑腫瘤細胞的接

5、觸抑制及密度抑制往往減弱或消失，因此細胞制往往減弱或消失，因此細胞可向三維空間發展，導致細胞可向三維空間發展，導致細胞堆積，并可生長至較高的終末堆積，并可生長至較高的終末細胞密度。細胞密度。l少數細胞在培養時不貼附于支持物上，少數細胞在培養時不貼附于支持物上，而以懸浮狀態生長，包括一些取自血、而以懸浮狀態生長，包括一些取自血、脾或骨髓的培養細胞，尤其是血液白細脾或骨髓的培養細胞，尤其是血液白細胞，以及一些腫瘤細胞。胞，以及一些腫瘤細胞。l 細胞懸浮生長時可以呈單個細胞或細小細胞懸浮生長時可以呈單個細胞或細小的細胞團，胞體為圓形。的細胞團，胞體為圓形。l其優點是在培養液中生長，生存空間大，其優點

6、是在培養液中生長，生存空間大，允許長時間生長，便于大量繁殖。允許長時間生長，便于大量繁殖。l培養細胞的生命期培養細胞的生命期l 培養細胞的生命期（培養細胞的生命期（life span）指的）指的是細胞在培養中持續增殖和生長的時間，是細胞在培養中持續增殖和生長的時間，一般可分為原代培養期、傳代期和衰退一般可分為原代培養期、傳代期和衰退期。從體內取出細胞接種培養到第一次期。從體內取出細胞接種培養到第一次傳代叫原代培養，一般持續傳代叫原代培養，一般持續1-4周。周。l 原代細胞一經傳代后便稱為細胞系原代細胞一經傳代后便稱為細胞系（cell line），進入傳代期，此期在全），進入傳代期，此期在全生命

7、期中持續時間最長，細胞增殖旺盛，生命期中持續時間最長，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體的核型。一般情況下可并能維持二倍體的核型。一般情況下可傳代傳代10-50次，隨后細胞增殖緩慢以至次，隨后細胞增殖緩慢以至完全停止，細胞進入衰退期，最后死亡。完全停止，細胞進入衰退期，最后死亡。l 腫瘤細胞系可無限增殖而無衰腫瘤細胞系可無限增殖而無衰退期，正常細胞系也可在傳代期退期，正常細胞系也可在傳代期末期或衰退期發生自發轉化，細末期或衰退期發生自發轉化，細胞獲得永生性即永久增殖的能力，胞獲得永生性即永久增殖的能力，稱為無限細胞系或連續細胞系。稱為無限細胞系或連續細胞系。l 培養細胞的生存環境是培養瓶、皿或培養細

8、胞的生存環境是培養瓶、皿或其它容器，生存空間相對孤立，營養是有其它容器，生存空間相對孤立，營養是有限的。當細胞增殖至一定密度后，則需分限的。當細胞增殖至一定密度后，則需分離出一部分細胞接種到其他容器，并及時離出一部分細胞接種到其他容器，并及時更新培養液，否則將影響細胞的繼續生存，更新培養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程叫這一過程叫傳代傳代（passage 或或subculture）。）。l 從細胞接種到下一次傳代再培養的從細胞接種到下一次傳代再培養的一段時間叫一代。需要注意的是一段時間叫一代。需要注意的是細胞培細胞培養一代養一代與與細胞倍增細胞倍增（doubling）的概念）的概念是不同

9、的，細胞倍增指的是細胞數增加是不同的，細胞倍增指的是細胞數增加一倍。一般地，細胞培養一代的過程中，一倍。一般地，細胞培養一代的過程中，細胞可倍增細胞可倍增2-6次。次。l細胞傳一代以后，細胞群體一般要經過細胞傳一代以后，細胞群體一般要經過潛伏期潛伏期、指數增長期指數增長期與與平臺期平臺期三個階段。三個階段。l以貼附型細胞為例說明如下：細胞接種以貼附型細胞為例說明如下：細胞接種后呈懸浮狀態，在后呈懸浮狀態，在05-4 h內貼附于支持內貼附于支持物，進入物，進入潛伏期潛伏期，此期細胞無增殖發生，此期細胞無增殖發生，原代細胞持續約原代細胞持續約24-96 h，而腫瘤細胞或，而腫瘤細胞或無限傳代細胞僅

10、需無限傳代細胞僅需6-24 h。l隨著分裂相細胞的出現并逐漸增多，細隨著分裂相細胞的出現并逐漸增多，細胞群體進入指數增長期，此期又稱胞群體進入指數增長期，此期又稱對數對數期期，細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最，細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，佳，適于進行實驗研究適于進行實驗研究；此期時間長短；此期時間長短因細胞本身特性及接種密度、因細胞本身特性及接種密度、血清濃度血清濃度而不完全相同，一般可持續而不完全相同，一般可持續3-5天。天。l隨著細胞數量的逐漸增多，細胞相互接隨著細胞數量的逐漸增多，細胞相互接觸匯合成片，因接觸抑制及密度抑制細觸匯合成片，因接觸抑制及密度抑制細胞停止分裂繁殖，進入胞停止

11、分裂繁殖，進入平臺期平臺期，細胞數，細胞數目不再增加，但仍維持一定時間的活力，目不再增加，但仍維持一定時間的活力，此時應此時應及時及時分離傳代，否則細胞將因中分離傳代，否則細胞將因中毒而發生改變甚至死亡。懸浮型細胞一毒而發生改變甚至死亡。懸浮型細胞一般沒有潛伏期，接種并添加新鮮培養液般沒有潛伏期，接種并添加新鮮培養液后即可迅速進入指數增長期。后即可迅速進入指數增長期。l 培養細胞需要特定的培養基和培養細胞需要特定的培養基和培養設備。培養細胞在培養器皿中培養設備。培養細胞在培養器皿中生長，浸浴于生長，浸浴于培養液培養液，并需要特有，并需要特有的的環境環境，包括一定的，包括一定的溫度、濕度和溫度、

12、濕度和氣體成分。氣體成分。培養細胞的生存條件培養細胞的生存條件培養皿培養皿或培養瓶或培養瓶 溫度、濕溫度、濕度和氣體度和氣體由由CO2恒溫孵恒溫孵育箱提供育箱提供 生長生長培養液培養液1020的血清的血清 維持維持培養液培養液25的血清的血清 營養物質營養物質糖、糖、氨基酸、維生氨基酸、維生素、無機離子、素、無機離子、微量元素等微量元素等 l培養細胞所需營養物質與體內細胞相同，培養細胞所需營養物質與體內細胞相同，包括糖、氨基酸、維生素、無機離子、微包括糖、氨基酸、維生素、無機離子、微量元素等。細胞在體外生存于含各種營養量元素等。細胞在體外生存于含各種營養成分的培養基中。成分的培養基中。l來自于

13、動物體液和分離組織提取的天然培來自于動物體液和分離組織提取的天然培養基有血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液養基有血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等，但制作過程復雜，批間差異大，已逐等，但制作過程復雜，批間差異大，已逐漸被漸被合成培養基合成培養基取代。取代。l按其物質狀態，分半固體培養基（如軟按其物質狀態，分半固體培養基（如軟瓊脂培養基）和液體培養基兩類，其中瓊脂培養基）和液體培養基兩類，其中液體培養基（即培養液）使用最為廣泛。液體培養基（即培養液）使用最為廣泛。目前市場上有多種配制好的細胞培養液目前市場上有多種配制好的細胞培養液出售，但價格較昂貴。實際工作中多用出售，但價格較昂貴。實際工作中多用市售

14、培養基干粉來配制培養液。市售培養基干粉來配制培養液。l配制培養液時，尚需配制培養液時，尚需加一定量的動物血清加一定量的動物血清（胎（胎牛或小牛血清）。配制時根據添加血清量的多牛或小牛血清）。配制時根據添加血清量的多少，構成作用不同的培養液，用于不同細胞和少，構成作用不同的培養液，用于不同細胞和不同研究目的。一般情況下需添加不同研究目的。一般情況下需添加10 20的血清，以維持細胞較快的生長增殖速度，的血清，以維持細胞較快的生長增殖速度，稱為稱為生長培養液生長培養液；為維持細胞緩慢生長或不死，；為維持細胞緩慢生長或不死，加加2 5血清含量即可，稱為血清含量即可，稱為維持培養液維持培養液。l此外為

15、防止污染，培養液中尚需此外為防止污染，培養液中尚需加一定量的抗加一定量的抗生素生素（多用青霉素（多用青霉素100單位單位/ml和鏈霉素和鏈霉素100g/ml）。）。1、MEM(minimum essential media)l含有含有12種必需氨基酸、谷氨酰胺，種必需氨基酸、谷氨酰胺，8種維生素及必要的無機鹽，成種維生素及必要的無機鹽，成分簡單，易于分簡單，易于添加某種特殊成分添加某種特殊成分適應某些特殊細胞的培養。適應某些特殊細胞的培養。2、DMEM（ Dulbeccos modified Eagle medium)l是由是由Dulbecco等人在等人在MEM培養基的基礎培養基的基礎上研制而

16、成。相比上研制而成。相比MEM增加了各成分的增加了各成分的用量。分用量。分高糖型和低糖型高糖型和低糖型，各自葡萄糖，各自葡萄糖含量為含量為4500g/L、1000g/L。高糖型有利于。高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適合于生長細胞停泊于一個位置生長，適合于生長較快、附著較困難的腫瘤細胞。較快、附著較困難的腫瘤細胞。3、IMDM（Iscoves modified Dulbeccos medium）l含有含有42種成分，較種成分，較DMEM增加了許增加了許多非必須氨基酸及一些維生素，增多非必須氨基酸及一些維生素，增加了加了HEPES，葡萄糖含量為高糖型。，葡萄糖含量為高糖型。適合于細胞密度較低

17、、細胞生長較適合于細胞密度較低、細胞生長較困難的情況，如白細胞融合之后雜困難的情況，如白細胞融合之后雜交細胞的篩選培養，交細胞的篩選培養，DNA轉染后轉轉染后轉化細胞的篩選培養。化細胞的篩選培養。4、RPMI1640l其成分較為簡單，適合于許多種類其成分較為簡單，適合于許多種類細胞的生長，如腫瘤細胞或正常細細胞的生長，如腫瘤細胞或正常細胞、原代培養或傳代培養的細胞。胞、原代培養或傳代培養的細胞。RPMI1640是目前應用最為廣泛的培是目前應用最為廣泛的培養基之一養基之一。5、HamF10、HamG12l特點是在配方中加入了一些微量元特點是在配方中加入了一些微量元素和無機離子，可以在加入很少血素

18、和無機離子，可以在加入很少血清的情況下使用，特別適合于進行清的情況下使用，特別適合于進行單細胞分離培養。單細胞分離培養。 HamG12培養基培養基也是無血清培養基中常用的基礎培也是無血清培養基中常用的基礎培養基養基7、McCoys 5AlMcCoys 5A培養基是培養基是McCoy T.A等等人在人在1959年研制成功的，是一種專年研制成功的，是一種專門為肉瘤細胞設計的培養基，后來門為肉瘤細胞設計的培養基，后來發現它特別適合于原代細胞培養，發現它特別適合于原代細胞培養，適合于較難培養的細胞的生長。適合于較難培養的細胞的生長。l沒有固定標準，以下為參考：沒有固定標準，以下為參考：1、建立某種細胞

19、株所用的培養基應該是培、建立某種細胞株所用的培養基應該是培養這種細胞首選的培養基。著可以參考文養這種細胞首選的培養基。著可以參考文獻，或在購買細胞株時咨詢。獻，或在購買細胞株時咨詢。2、本實驗室慣用的培養基不妨試一試，許、本實驗室慣用的培養基不妨試一試，許多培養基可以適合于多種細胞。多培養基可以適合于多種細胞。3、根據細胞株的特點、實驗的需要來選擇、根據細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養基。如小鼠細胞株多選擇培養基。如小鼠細胞株多選擇RPMI1640；進行細胞雜交、基因轉移實驗，可選擇進行細胞雜交、基因轉移實驗，可選擇IMDM。4、用多種培養基培養目的細胞，觀察其生、用多種培養基培養目的細胞，

20、觀察其生長狀態，可用生長曲線、集落形成率等長狀態，可用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據實驗結果選擇最佳培養指標判斷，根據實驗結果選擇最佳培養基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。l無血清培養基即不需要添加血清就可維無血清培養基即不需要添加血清就可維持細胞在體外生長較長時間生長繁殖的持細胞在體外生長較長時間生長繁殖的合成培養基。合成培養基。l用于觀察一種生長因子對某種細胞的作用于觀察一種生長因子對某種細胞的作用（這時需要排除其他生長因子的干擾，用（這時需要排除其他生長因子的干擾，而血清中可能含有各種生長因子）；或而血清中可能含有各種生長因子）；或需要測定某種細胞

21、在培養過程中分泌某需要測定某種細胞在培養過程中分泌某種物質的能力；或大規模的培養某種細種物質的能力；或大規模的培養某種細胞，以獲得它們的分泌產物的時候。胞，以獲得它們的分泌產物的時候。l無血清培養基分為無血清培養基分為基礎培養液基礎培養液和和添加組分添加組分兩大部兩大部分。基礎培養液以分。基礎培養液以HamF12和和DMEM最為常用，最為常用，一般兩者以一般兩者以1:1混合。混合。l添加組分包括：添加組分包括： 1、促貼壁物質促貼壁物質： 一般是細胞外基質，如纖連蛋白（一般是細胞外基質，如纖連蛋白（FN）、層粘）、層粘連蛋白（連蛋白（LN）等。它們還是重要的分裂素以及）等。它們還是重要的分裂素

22、以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要的作用。殖和分化，起著重要的作用。2、促生長因子及激素促生長因子及激素l如表皮生長因子（如表皮生長因子（EGF）、神經生長因子）、神經生長因子（NGF）、內皮細胞生長因子（）、內皮細胞生長因子（ECGF）等。）等。3、酶抑制劑酶抑制劑l終止胰酶的消化作用，達到保護細胞的目的。終止胰酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制劑。最常用的是大豆胰酶抑制劑。4、轉鐵蛋白和牛血清白蛋白轉鐵蛋白和牛血清白蛋白5、微量元素微量元素 硒最為常見。硒最為常見。l1、NaHCO3溶液溶液l2、

23、HEPES液液l 是一種弱酸是一種弱酸羥乙基哌嗪乙硫磺酸。羥乙基哌嗪乙硫磺酸。HEPES對細胞無毒性，可防止對細胞無毒性，可防止pH值迅速值迅速變動變動l常用的是青鏈霉素，俗稱常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶雙抗溶液液”l青霉素使用的終濃度為青霉素使用的終濃度為0.1g/L。一。一般配成般配成100倍濃縮液，可用倍濃縮液，可用PBS或或培養基配制。培養基配制。l 谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養基中都要添加，要作用，合成培養基中都要添加，由于谷氨酰胺容易降解，所以都是由于谷氨酰胺容易降解，所以都是使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度

24、為為0.002mol/L。一般配制為。一般配制為100倍濃倍濃縮液。縮液。1、培養器皿、培養器皿2、培養環境：、培養環境：CO2恒溫孵育箱恒溫孵育箱lCO2恒溫孵育箱是目前普遍應用的細胞培養設恒溫孵育箱是目前普遍應用的細胞培養設備，備，l箱內應置水槽以維持箱內溫度、濕度和避免培箱內應置水槽以維持箱內溫度、濕度和避免培養液蒸發，養液蒸發，l蒸餾水需無菌水并應加無腐蝕性和無揮發性的蒸餾水需無菌水并應加無腐蝕性和無揮發性的防腐劑以防生霉。應定期對箱內進行消毒。防腐劑以防生霉。應定期對箱內進行消毒。l另外，細胞培養過程中進行換液、傳代等工作另外，細胞培養過程中進行換液、傳代等工作時需在無菌工作臺上進行

25、。時需在無菌工作臺上進行。l二氧化碳培養箱二氧化碳培養箱（培養箱）提供箱（培養箱）提供箱內一定濃度內一定濃度二氧化二氧化碳氣體和相對濕度碳氣體和相對濕度，創造了細胞與微生創造了細胞與微生物正常生命活動的物正常生命活動的環境條件，使之在環境條件，使之在脫離復雜機體內環脫離復雜機體內環境的直接影響，在境的直接影響，在體外能生長體外能生長瀪瀪殖。殖。 l培養箱的結構培養箱的結構l以水套式以水套式CO2CO2培養箱培養箱為例，培養箱基本有為例，培養箱基本有三壁結構三壁結構箱體、控制箱體、控制中心（包括鍵盤、顯中心（包括鍵盤、顯示器、指示器等）、示器、指示器等）、CO2/O2CO2/O2傳感器、增濕傳感

26、器、增濕盤等。盤等。l可分為單可分為單 雙內艙水套培養箱兩種。雙內艙水套培養箱兩種。l箱內傳感器箱內傳感器有熱傳導有熱傳導(T/C(T/C）和紅外（）和紅外（IRIR）傳）傳感器兩種。感器兩種。l水套注入口水套注入口( (用于注滿水用于注滿水) )。 水套排水口水套排水口（在（在水套注滿過程中或熱脹冷縮時讓空氣逸出，水套注滿過程中或熱脹冷縮時讓空氣逸出，不能覆蓋）。不能覆蓋）。l水套排氣口水套排氣口（用于迅速排空水套）。（用于迅速排空水套）。l加熱式內門（為了保持箱內干燥）。加熱式內門（為了保持箱內干燥）。l箱內氣體取樣口箱內氣體取樣口（可使用（可使用FyriteFyrite或類似工具或類似工

27、具提取箱內樣本的含量）。提取箱內樣本的含量）。l1細胞分離和原代培養細胞分離和原代培養l 原代培養也叫初代培養，指從供原代培養也叫初代培養，指從供體取得組織，分離得到所需細胞體取得組織，分離得到所需細胞后接種于培養瓶，進行首次培養。后接種于培養瓶，進行首次培養。細胞分離細胞分離原代（初代）培養原代（初代）培養消化法傳代消化法傳代 組織塊剪切組織塊剪切,消化消化法使組織進一步法使組織進一步分散分散 制備獲得細胞懸獲得細胞懸液計數后，加入液計數后，加入營養液稀釋成一營養液稀釋成一定濃度細胞懸液定濃度細胞懸液孵箱中進行培養孵箱中進行培養 細胞懸液細胞懸液計數后，計數后，加入營養加入營養液稀釋成液稀釋

28、成一定濃度一定濃度細胞懸液細胞懸液孵箱中進孵箱中進行培養行培養將原代細胞培將原代細胞培養物用胰酶和養物用胰酶和EDTA消化處理消化處理后，收集后，收集洗滌，洗滌，再分裝至再分裝至 含有含有新鮮營養液的新鮮營養液的培養瓶中繼續培養瓶中繼續培養培養 l 培養材料為血液、羊水、胸水和腹培養材料為血液、羊水、胸水和腹水等細胞懸液時，可采用離心法分離。水等細胞懸液時，可采用離心法分離。一般用一般用5001000rpm的低轉速，時間約的低轉速，時間約510min。如果一次離心樣品量很多，。如果一次離心樣品量很多，時間可適當延長，但離心速度過大、時時間可適當延長，但離心速度過大、時間過長，會擠壓細胞造成損傷

29、甚至死亡。間過長，會擠壓細胞造成損傷甚至死亡。l 培養材料為組織塊時，首先要把組培養材料為組織塊時，首先要把組織塊剪切至盡量小，然后用消化法使組織塊剪切至盡量小，然后用消化法使組織進一步分散，以獲得細胞懸液。對細織進一步分散，以獲得細胞懸液。對細胞間質較少的軟組織，如胚胎、上皮、胞間質較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等可用胰蛋白酶消化；對于纖維肝、腎等可用胰蛋白酶消化；對于纖維性組織和較硬的上皮組織、癌組織等可性組織和較硬的上皮組織、癌組織等可使用膠原酶消化。使用膠原酶消化。l胰酶（胰酶（Trypsin）：）：0.1%0.25%，用，用D-HanKS液配制，最佳液配制，最佳pH89lEDTA

30、 ：0.02%，作用于細胞間連接尤其對，作用于細胞間連接尤其對貼壁的細胞適用貼壁的細胞適用l膠原酶（膠原酶（Collagenase）：）：0.10.3mg/L(20萬萬u/L)， pH6.5，Ca2+，Mg2+不抑制其活性，不抑制其活性，作用于膠原組織，適用于上皮類原代細胞。作用于膠原組織，適用于上皮類原代細胞。l細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶的過程稱之為傳代；進行一次分培養瓶的過程稱之為傳代；進行一次分離培養稱之為傳一代。離培養稱之為傳一代。 培養細胞傳代根培養細胞傳代根據不同細胞采取不同的方法。據不同細胞采取不同的方法。l貼壁生長的細胞多用消化法

31、傳代，傳代貼壁生長的細胞多用消化法傳代，傳代中常用到二乙烯四乙酸二鈉（中常用到二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）。）。EDTA能從組織生存環境中吸取能從組織生存環境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要，這些離子是維持組織完整的重要因素。但因素。但EDTA單獨使用不能使細胞完單獨使用不能使細胞完全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。混合使用，效果較好。l吸除或倒掉瓶內舊培養液，向瓶內加入少量約吸除或倒掉瓶內舊培養液，向瓶內加入少量約12ml消化液（一般含胰蛋白酶、消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），），輕輕搖動培養瓶，使消化液流遍所有

32、細胞表面；輕輕搖動培養瓶，使消化液流遍所有細胞表面；l然后在然后在37環境下孵育環境下孵育1-3min，把培養瓶放置，把培養瓶放置顯微鏡下進行觀察，發現胞質回縮、細胞間隙顯微鏡下進行觀察，發現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即倒掉消化液，加入增大后，應立即倒掉消化液，加入Hanks液沖液沖洗一次以終止消化；洗一次以終止消化；l然后加入少許培養液，用彎頭吸管吸取瓶內培然后加入少許培養液，用彎頭吸管吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，使之脫落形成細胞養液，反復吹打瓶壁細胞，使之脫落形成細胞懸液，以懸液，以1：2或或1：3的比例接種在新的培養瓶的比例接種在新的培養瓶內。內。l懸浮生長的細胞可直接添加新鮮

33、懸浮生長的細胞可直接添加新鮮培養液，或離心收集，接種到新培養液，或離心收集，接種到新培養瓶。培養瓶。l通常在通常在45天需傳代，一般以天需傳代，一般以1:4稀釋傳代。稀釋傳代。l培養細胞在傳代中性質易發生改變培養細胞在傳代中性質易發生改變, 有支有支原體污染的危險。研究工作也要求細胞原體污染的危險。研究工作也要求細胞株的代數應維持在一定期限內。解決這株的代數應維持在一定期限內。解決這些困難的方法就是將細胞凍存，需要的些困難的方法就是將細胞凍存，需要的時候再行復蘇。細胞凍存在液氮中，從時候再行復蘇。細胞凍存在液氮中，從理論上講貯存時間是無限的理論上講貯存時間是無限的。l在不加保護條件下直接凍存細

34、胞時，細在不加保護條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水會形成胞內和外環境中的水會形成結晶結晶，能導，能導致細胞內發生一系列變化而引起細胞死致細胞內發生一系列變化而引起細胞死亡。亡。l如向培養基中加入如向培養基中加入保護劑保護劑甘油或二甲基甘油或二甲基亞砜（亞砜（DMSO），可使冰點降低，在緩），可使冰點降低，在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外。結前透出細胞外。l溶解細胞時，速度要快，使之迅速通溶解細胞時，速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的過細胞最易受損的50后，細后，細胞仍能生長，活力不受任何損害。胞仍能生長，活力不受任何損害。l細胞

35、凍存與復蘇的原則是細胞凍存與復蘇的原則是“慢凍快慢凍快融融”。凍存時選用對數生長期細胞，凍存時選用對數生長期細胞，用常規方法收集細胞。在液氮中可長用常規方法收集細胞。在液氮中可長期保存期保存。l凍存細胞復蘇時，將凍存于液氮中凍存細胞復蘇時，將凍存于液氮中的凍存管取出，迅速放入的凍存管取出，迅速放入3740水浴中使其在水浴中使其在1min內融化。在無菌內融化。在無菌條件下打開凍存管，取出細胞懸液條件下打開凍存管，取出細胞懸液至離心管中，補加至離心管中，補加10ml培養液，培養液，5001000rpm低速離心低速離心5min，去上，去上清，加入新鮮培養液適量，轉入培清，加入新鮮培養液適量，轉入培養

36、瓶中置養瓶中置37培養。培養。l細胞培養過程中操作不當時，易引發微細胞培養過程中操作不當時，易引發微生物污染。微生物污染一旦明確，多數生物污染。微生物污染一旦明確，多數將無法救治。為了防止污染的蔓延，還將無法救治。為了防止污染的蔓延，還應及時丟棄污染細胞。應及時丟棄污染細胞。l（1）霉菌和細菌污染）霉菌和細菌污染 霉菌和細菌繁殖霉菌和細菌繁殖迅速，能在很短的時間內壓制細胞生長迅速，能在很短的時間內壓制細胞生長或排出有毒物質殺滅細胞，因此霉菌和或排出有毒物質殺滅細胞，因此霉菌和細菌污染較易發現。細菌污染較易發現。l霉菌污染后多在培養液中形成白色或淺霉菌污染后多在培養液中形成白色或淺黃色飄浮物，一

37、般肉眼可見，較易被發黃色飄浮物，一般肉眼可見，較易被發現，短期內培養液多不混濁，倒置顯微現，短期內培養液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間有縱橫交錯穿行的鏡下可見于細胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀、管狀及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩絲狀、管狀及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養液中；很多菌絲在高倍鏡下可見在培養液中；很多菌絲在高倍鏡下可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間形態呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。生長。l細菌污染后培養液短期內顏色變黃，細菌污染后培養液短期內顏色變黃，表明有大量酸性物質產生，出現明表明有大量酸性物質產生，出現明

38、顯混濁現象；有時靜置的培養瓶液顯混濁現象；有時靜置的培養瓶液體初看不混，但稍加震蕩，就有很體初看不混，但稍加震蕩，就有很多混濁物漂起；倒置顯微鏡下觀察，多混濁物漂起；倒置顯微鏡下觀察，可見培養液中有大量細小的圓球狀可見培養液中有大量細小的圓球狀顆粒飄浮，有時在細胞表面和周圍顆粒飄浮，有時在細胞表面和周圍有大量細菌存在，細胞生長停止并有大量細菌存在，細胞生長停止并有中毒表現有中毒表現。l支原體污染是一個常見而又棘手的問題。支原支原體污染是一個常見而又棘手的問題。支原體是一種大小介于細菌和病毒之間（最小直徑體是一種大小介于細菌和病毒之間（最小直徑0.2m）并獨立生活的微生物，因此可通過濾菌）并獨立

39、生活的微生物，因此可通過濾菌器，支原體對熱敏感但對一般抗生素不敏感。器，支原體對熱敏感但對一般抗生素不敏感。支原體污染細胞后，培養液可不發生混濁，多支原體污染細胞后，培養液可不發生混濁，多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。實際上細胞已受到各方面潛在的影響，如細胞實際上細胞已受到各方面潛在的影響，如細胞變性、變性、DNA合成受影響等。個別嚴重者，可致合成受影響等。個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢，甚至從培養器皿脫落。細胞增殖緩慢，甚至從培養器皿脫落。l相差顯微鏡檢測相差顯

40、微鏡檢測 將細胞接種于事先放置于將細胞接種于事先放置于培養瓶內的蓋玻片上，培養瓶內的蓋玻片上，24h后取出，用相差油后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間，類似布朗運動。和細胞之間，類似布朗運動。l熒光染色法熒光染色法 熒光染色用能與熒光染色用能與DNA特異性結特異性結合的熒光染料合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內含，可使支原體內含有的有的DNA著色，據此可檢測支原體。固定細胞著色，據此可檢測支原體。固定細胞以以Hoechst 33258染色，然后置熒光顯微鏡下觀染色，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在

41、于細胞周圍或附于細胞察。鏡下支原體為散在于細胞周圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。膜表面的亮綠色小點。l電鏡檢測電鏡檢測 用掃描電鏡方法簡便快用掃描電鏡方法簡便快速，也可以利用透射電鏡。速，也可以利用透射電鏡。lDNA分子雜交檢查或支原體培養分子雜交檢查或支原體培養等方法等方法 檢出率高，但方法較復雜檢出率高，但方法較復雜。l 傳代細胞帶有潛伏病毒。傳代細胞帶有潛伏病毒。Hela-HPV18,HSV,逆轉錄病毒等以前病毒形逆轉錄病毒等以前病毒形式整合細胞式整合細胞DNA。可通過細胞直接觀。可通過細胞直接觀察（察（血細胞吸附、包涵體等血細胞吸附、包涵體等）、動物）、動物接種、異種組織培養物生長、電

42、鏡觀接種、異種組織培養物生長、電鏡觀察、免疫學方法及察、免疫學方法及PCR方法檢查方法檢查l防止污染，預防是關鍵防止污染，預防是關鍵1、器皿準備中的預防、器皿準備中的預防2、操作前的預防：超凈工作臺，培養皿，、操作前的預防：超凈工作臺，培養皿，培養液，操作者培養液，操作者3、操作過程中的預防：瓶口不能于工作臺、操作過程中的預防：瓶口不能于工作臺風向逆向；火焰燒灼滅菌，專管專用，風向逆向；火焰燒灼滅菌，專管專用，試管斜位，不要交談，完畢后整理、清試管斜位，不要交談，完畢后整理、清掃掃1、抗生素排除：聯合用藥，預防性應用比、抗生素排除：聯合用藥，預防性應用比污染后使用更好污染后使用更好2、加溫除菌

43、：、加溫除菌：41oC，510h3、動物接種、動物接種4、與、與共培養共培養l上皮組織上皮組織l內皮細胞內皮細胞血管內皮細胞、淋巴內皮血管內皮細胞、淋巴內皮細胞細胞l單層柱狀上皮細胞單層柱狀上皮細胞胃粘膜上皮細胞，胃粘膜上皮細胞，腸粘膜上皮細胞，假復層纖毛柱狀上腸粘膜上皮細胞，假復層纖毛柱狀上皮細胞皮細胞l復層上皮細胞復層上皮細胞表皮細胞，食管粘膜表皮細胞，食管粘膜上皮細胞上皮細胞l成纖維細胞成纖維細胞l 細胞：腹腔，肺泡，肥大細胞，細胞：腹腔，肺泡，肥大細胞，血細胞，淋巴細胞，軟骨細胞，血細胞，淋巴細胞，軟骨細胞，骨細胞骨細胞l脂肪細胞脂肪細胞l心肌細胞心肌細胞l平滑肌細胞平滑肌細胞l骨骼肌

44、細胞骨骼肌細胞l神經組織，神經元，神經膠質細神經組織，神經元，神經膠質細胞，少突膠質細胞，胞，少突膠質細胞，Schwann細胞細胞l脂肪細胞脂肪細胞l除此之外，尚有器官培養（胚除此之外，尚有器官培養（胚胎干、神經干、造血干、間光胎干、神經干、造血干、間光質干、表皮組織干、胰島干細質干、表皮組織干、胰島干細胞培養）等技術胞培養）等技術人臍血管內皮細胞（凋亡）人臍血管內皮細胞（凋亡）人臍血管內皮細胞人臍血管內皮細胞l生物體是一個高度統一的整體，而細胞生物學的生物體是一個高度統一的整體，而細胞生物學的主要對象是生物體內的各種細胞，很顯然，在整主要對象是生物體內的各種細胞，很顯然，在整體條件下研究單個

45、細胞或某一細胞群在體內（體條件下研究單個細胞或某一細胞群在體內（in vivo）的功能活動是非常困難的。）的功能活動是非常困難的。細胞培養的意細胞培養的意義義主要在于兩點，其一是人工培養條件易于改變主要在于兩點，其一是人工培養條件易于改變并能嚴格控制，便于研究各種因素對細胞的結構、并能嚴格控制，便于研究各種因素對細胞的結構、功能和各種生命活動規律的影響；其二是細胞在功能和各種生命活動規律的影響；其二是細胞在體外培養環境中可以長期存活和傳代，可以比較體外培養環境中可以長期存活和傳代，可以比較經濟地、大量地提供在同一時期、條件相同、性經濟地、大量地提供在同一時期、條件相同、性狀相似的細胞作為實驗樣

46、本。因此，大量生物醫狀相似的細胞作為實驗樣本。因此，大量生物醫學研究工作依賴于細胞培養，許多重要的發現都學研究工作依賴于細胞培養，許多重要的發現都基于培養細胞的工作。基于培養細胞的工作。l細胞培養技術也存在著一定局限性，主細胞培養技術也存在著一定局限性，主要是細胞離體以后失去與體內環境的密要是細胞離體以后失去與體內環境的密切聯系，失去了神經體液的調節和不同切聯系，失去了神經體液的調節和不同細胞間的相互作用，特定分化基因的表細胞間的相互作用，特定分化基因的表達減弱或停止，而進化中保守的細胞生達減弱或停止，而進化中保守的細胞生長和增殖活動卻可維持，遂使體內外細長和增殖活動卻可維持，遂使體內外細胞出

47、現了差異，這是應用細胞培養技術胞出現了差異，這是應用細胞培養技術應該注意的問題。應該注意的問題。l細胞培養技術除經典地用于細胞形態結構、功細胞培養技術除經典地用于細胞形態結構、功能和細胞活動研究以外，還成為近年發展起來能和細胞活動研究以外，還成為近年發展起來的細胞工程技術的基礎，也就是說細胞培養技的細胞工程技術的基礎，也就是說細胞培養技術重要應用就是各種細胞工程技術。因此在此術重要應用就是各種細胞工程技術。因此在此對這些相關技術作一簡介。對這些相關技術作一簡介。l一般地，一般地，細胞工程細胞工程指應用各種手段對細胞不同指應用各種手段對細胞不同結構層次結構層次(整體、細胞器、核、基因等整體、細胞

48、器、核、基因等)進行改進行改造，如進行細胞融合、核移植、基因轉移等，造，如進行細胞融合、核移植、基因轉移等，以獲得具有特定生物學特性的細胞。以獲得具有特定生物學特性的細胞。l在細胞自然生長情況下，或在其他人為添加因在細胞自然生長情況下，或在其他人為添加因素存在下，使同種細胞之間或不同種類細胞之素存在下，使同種細胞之間或不同種類細胞之間相互融合的過程，即為細胞融合（間相互融合的過程，即為細胞融合（cell fusion）。通過細胞融合，可將來源于不同細）。通過細胞融合，可將來源于不同細胞核的染色體結合到同一個核內，結果形成一胞核的染色體結合到同一個核內，結果形成一個合核體的雜種細胞。在實際工作中

49、常采用各個合核體的雜種細胞。在實際工作中常采用各種促融合手段，包括病毒類融合劑如仙臺病毒、種促融合手段，包括病毒類融合劑如仙臺病毒、化學融合劑如聚乙二醇（化學融合劑如聚乙二醇（PEG）及電激融合法）及電激融合法等。等。l在進行細胞融合反應和適當時間的培養在進行細胞融合反應和適當時間的培養后，需要通過一定方法對兩種親本細胞后，需要通過一定方法對兩種親本細胞融合產生的具有增殖能力的雜種細胞進融合產生的具有增殖能力的雜種細胞進行篩選。篩選方法主要包括藥物抗性篩行篩選。篩選方法主要包括藥物抗性篩選、營養缺陷篩選和溫度敏感性篩選等。選、營養缺陷篩選和溫度敏感性篩選等。l細胞融合最典型的應用是單克隆抗體技

50、術。細胞融合最典型的應用是單克隆抗體技術。1975年年Koehler和和Milstein將用綿羊紅細胞免疫將用綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞和體外培養能長期繁殖的小鼠骨的小鼠脾細胞和體外培養能長期繁殖的小鼠骨髓瘤細胞融合，獲得了具有兩種親本細胞特性髓瘤細胞融合，獲得了具有兩種親本細胞特性的雜交細胞，即既能在培養條件下長期生長增的雜交細胞，即既能在培養條件下長期生長增殖，又能分泌特異的抗綿羊紅細胞的抗體的殖，又能分泌特異的抗綿羊紅細胞的抗體的B淋巴細胞雜交瘤。細胞融合技術的發展和骨髓淋巴細胞雜交瘤。細胞融合技術的發展和骨髓瘤細胞株的建成促成了瘤細胞株的建成促成了B細胞雜交瘤技術的建細胞雜交瘤技術的建

51、立和單克隆抗體技術的成功。立和單克隆抗體技術的成功。l細胞核移植細胞核移植（nuclear transfer）是指將）是指將一個雙倍體的細胞核（可來自胚胎細胞一個雙倍體的細胞核（可來自胚胎細胞或體細胞）移植到去核的成熟卵母細胞或體細胞）移植到去核的成熟卵母細胞或受精卵中。重組的卵細胞可以植入母或受精卵中。重組的卵細胞可以植入母體，并能發育為與供核細胞基因型相同體，并能發育為與供核細胞基因型相同的后代，因此又稱為動物克隆技術。的后代，因此又稱為動物克隆技術。1997年誕生的克隆羊年誕生的克隆羊“多利多利”就是體細就是體細胞核移植技術的產物。胞核移植技術的產物。l核移植技術首先是選取合適的受體去核

52、卵細胞核移植技術首先是選取合適的受體去核卵細胞和供體核。目前均以發育至減數分裂中期和供體核。目前均以發育至減數分裂中期II的的成熟卵母細胞為受體，供體核則可以采用胚胎成熟卵母細胞為受體，供體核則可以采用胚胎細胞、未分化的原始生殖細胞、胎兒細胞乃至細胞、未分化的原始生殖細胞、胎兒細胞乃至高度分化的成年動物細胞。核質融合一般是將高度分化的成年動物細胞。核質融合一般是將獲得的核轉移到已經人工去核的成熟卵母細胞獲得的核轉移到已經人工去核的成熟卵母細胞卵周隙后，施加微電流脈沖，使核質融合，形卵周隙后，施加微電流脈沖，使核質融合，形成一個重組卵。重組卵需經一定時間的體外培成一個重組卵。重組卵需經一定時間的體外培養，或放入中間受體動物輸卵管內孵育，經過養，或放入中間受體動物輸卵管內孵育，經過一段時間的培養，有的動物需形成桑椹胚或囊一段時間的培養，有的動物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受體子宮里。胚，再植入受體子宮里。l基因轉移指向受體細胞中導入外源基因，基因轉移指向受體細胞中導入外源基因，是改造細胞遺傳性狀的常用手段。一般是改造細胞遺傳性狀的常用手段。一般情況下，能穩定接納外