1、樹突狀細胞與移植免疫耐受【摘要】 樹突狀細胞（dendritic cells，DC）在機體外周與中樞免疫耐受維持中發揮重要作用，其以多種機制參與自身免疫耐受的形成，且具有極強可塑性，因此成為近年來移植免疫耐受領域的研究熱點。本文概述了DC的分型及作用、DC誘導免疫的間接通路、F1t3L和凋亡細胞的作用、基因工作修飾DC及免疫抑制劑。【關鍵詞】 樹突狀細胞；移植免疫；移植耐受 Dendritic Cells and Transplantation Immune Tolerance ?Review AbstractDendritic cells (DC) play an important rol

2、es in the maintenance of central immune tolerance and peripheral immune tolerance. DC can be involvd in tormation of autoimmune tolerance by many mechanisms and demonstrate strong plasticity，so that DC become hot issue in the research of transplantation tolerance recently. In this article the DC typ

3、ing and its role，the indirect pathway of DC-inducing immune tolerance，the F1t3L and apoptotic cell role，the modified DC by genetis engineering and the immune inhibitors were summarized. Key wordsdendritic cell; transplantation immune; transplantation tolerance近年來，隨著細胞或器官移植廣泛開展和移植免疫深入研究，了解到樹突狀細胞（dend

4、ric cells，DC）在移植排斥及移植耐受中發揮雙向調節作用：一方面，DC作為專職抗原呈遞細胞觸發和調節固有性及獲得性免疫反應，啟動免疫應答，介導免疫排斥；另一方面，DC通過多種機制誘導抗原特異性T細胞無能，且在免疫耐受中展示出極強的可塑性。本文就目前DC參與移植耐受的作用機制作一綜述。 DC的分型及作用 未成熟DC 人體內DC具有成熟和未成熟兩種功能狀態。正常情況下，多數DC處于未成熟狀態。DC成熟受多種因素影響，IL-10、TGF-等可抑制其成熟。未成熟DC可分泌IL-10，IL-10誘導無能T細胞產生、抑制T細胞增殖，誘導Th2型細胞反應和通過調節性T細胞（regulatory T

5、cell，Treg）下調DC表面共刺激分子表達、抑制IL-12合成。微生物細胞成分如細菌脂多糖、集落刺激因子（如GM-CSF）和細胞因子（如IL-4、IL-12）等均能促使DC成熟。成熟DC是早期免疫應答強有力的抗原呈遞細胞，它活化初始和記憶T細胞，啟動免疫應答。器官移植后作為“過客”白細胞，供體DC從移植器官中游走至受者的次級淋巴器官內，呈遞抗原特異性MHC分子，激活受者T細胞，啟動免疫應答，觸發排斥反應，此過程為直接異體識別途徑；另外，受者DC或DC祖細胞參與移植后初始炎癥反應，浸潤到移植器官內，凋亡或壞死細胞崩解碎片，經加工處理并結合自身MHC分子，最終把限制性供體MHC分子及自身MHC

6、分子復合肽呈遞給受者T細胞，觸發排斥反應，此過程為間接異體識別途徑1。一般認為直接異體識別途徑參與急性排斥反應，而間接異體識別途徑則與慢性排斥有關。最近研究認為識別的途徑取決于植入器官類型、實驗模型、排斥時相（慢性、急性）等1，2。未成熟DC具有截然不同的生物學特性，低水平表達MHC、CD40、CD80、CD86、B7等共刺激分子和黏附分子，具有極強的抗原攝取、加工處理能力，而激發免疫應答能力卻較弱，未成熟DC可誘導抗原特異性 T 細胞耐受及 Treg 細胞產生。 體外實驗表明：未成熟DC與 CD4 CD25 CD45RO Treg 細胞接觸后可上調其表面抑制性分子ILT3、ILT4表達，從而

7、獲得調節活性，抑制異體反應性CD4 T細胞增殖或使之轉化為Treg細胞，發揮免疫抑制功能3。移植后耐受受者中的調節DC可促使源于初始T細胞中CD4 CD25 Treg細胞擴增，而這些Treg細胞可誘導造血祖細胞向調節DC方向分化并降低DC表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-II類分子表達，維持DC于未成熟狀態4。調節DC再誘導Treg細胞，如此反復互相激發形成反饋環路，阻礙移植物排斥。漿細胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC） 人DC也可根據其分化來源分為髓樣DC和pDC。pDC主要存在于血液循環及次級淋巴組織非抗原進入T細胞區，它受CD40L激活后可促使CD8 T細胞分泌I

8、L-10從而抑制Th1型細胞應答。Kuwana等5報道，從人外周血分離出的新鮮未成熟pDC可誘導抗原特異性CD4 T細胞無能，這與T細胞不能上調CD40L表達及分泌IL-2有關。未成熟pDC上的抑制性Ig樣轉錄受體ILT3、ILT4亦參與此種無應答6，而可溶性IL-10、INF-、TGF-與此無關。體外初始CD8 T細胞與異體CD40L活化的成熟pDCs共培養易向高分泌IL-10 CD8 Treg細胞分化，并通過其分泌的IL-10抑制CD8 效應T細胞旁路增殖7。移植患者血循環內CD8 CD28-細胞（一類獨特Treg細胞）抑制抗原特異性CD4 T細胞應答，阻斷CD40-CD40L活化信號介導

9、的DC成熟，上調供體未成熟pDC上的ILT3、ILT4表達3，這是獨特的Treg細胞經G-CSF動員的供體pDC進入受者，并在其有效俘獲異體抗原后分化為成熟pDC，并通過誘導CD8 Treg細胞、Th2型免疫應答抑制供體Th1、CTL，使其無能，從而減輕GVHD程度8。以上表明機體接觸異體抗原后其血循環中pDC可抑制Th1型細胞介導的免疫應答，這使pDC在移植物排斥、GVHD等Th1型疾病中發揮重要作用。 間接通路 DC通過直接、間接通路呈遞異體抗原啟動免疫應答。但Inaba 等9認為，移植后供體DC可把其表面部分供體型MHC分子轉給受者DC，在受者DC上形成供體MHC分子與自身MHC分子結合

10、的復合物而干擾間接識別途徑，誘導免疫耐受。受者DC負載供體抗原肽（MHC-I類分子或凋亡細胞）后無論是直接進入血液循環，還是進入胸腺均可顯著延長移植物植活時間。DC通過靜脈進入受者后在外周可誘導抗原特異性T細胞產生，這些T細胞再遷移至胸腺獲得中樞耐受10，另外供體DC進入胸腺后與受者DC起清除CD4 CD8 胸腺T細胞及高親和力結合自身MHC分子復合物的循環T細胞克隆。 F1t3L 細胞因子F1t3L在體內能潛在誘導造血祖細胞和DC增殖。在實驗模型中，預先建立一供體鼠，使受者鼠在不使用任何免疫抑制劑下能夠耐受MHC不相合供體肝而不表現排斥反應。如先對供體鼠予Flt3L處理后，再移植異體肝給受者

11、鼠，小鼠則表現出急性排斥反應11。在另一模型中，接受全身照射的實驗小鼠在行T細胞清除、MHC不相合造血干細胞移植后再輸注Flt3L，小鼠則易發生致命GVHD12。由此可見，無論是器官移植還是造血干細胞移植，無論對供體還是受者，這些實驗都表明Flt3L增加了宿主抗移植物、移植物抗宿主病發生率。近來有研究報道，預先以造血干細胞因子Flt3L擴增供體脾區CD8 DC，然后將其經靜脈輸注給受體鼠，發現心臟植活時間延長，且此種效應不依賴CD8 DC狀態（成熟、未成熟）及在靜脈輸注過程中是否發生狀態轉換13。Yunusuv等14最近提出，如降低全身照射強度，F1t3L則有助于異基因骨髓的穩定持久植入，且沒

12、有明顯GVHD表現。 Eto等15研究表明，對于接受環磷酰胺預處理、去T細胞性骨髓移植的受體鼠，在其骨髓造血尚未重建前，如輸注Flt3L動員的供體造血干細胞（DC數量明顯擴增），可誘導受體鼠對MHC錯配的異體皮膚耐受。推測此種耐受與供體特異反應性T細胞持續清除有關，確切機制有待進一步闡明。盡管目前評價Flt3L在移植中的作用為時尚早，但隨著對Flt3L的研究深入、這一潛在DC動員劑必會有良好應用前景。凋亡細胞 實驗表明，靜脈注射供體凋亡細胞可誘導抗原特異性T細胞耐受。機制如下：未成熟DC高效吞噬凋亡細胞，處理并呈遞其抗原，而未引發炎癥反應及自身狀態轉換；下調前炎癥因子IL-1、IL-1、IL-

13、6、TNF-及促Th1細胞因子IL-12P40的分泌，維持TGF-1于高水平。DC膜表面受體?整合蛋白（3、5）、血小板反應蛋白 受體(CD36)、補體受體CR3(CD11b/CD18)、CR4(CD11C/CD18)通過與凋亡細胞表面相應配體務小板反應蛋白、乳脂肪球（milk fat globule）互相識別參與此過程介導生物學效應。凋亡細胞活化補體C3后能促使活化產物iC3b在其胞膜貯積，并借此與DC表面高表達的吞噬受體CD11b/CD18相互識別。在人未成熟DC內化iC3b調理的凋亡細胞后，mRNA水平下調的IL-1、TNF-、IL-12P40等細胞因子轉錄分泌、降低MHC類分子及CD8

14、6表達，抑制CD40-CD40L活化DC成熟16，即通過細胞因子轉換DC以未成熟狀態誘導免疫耐受。小鼠移植模型研究表明，靜脈注射的供體凋亡脾細胞易于在骨髓中植入，長期誘導受體鼠于免疫耐受狀態17。 基因工程修飾DC 近來有應用腺病毒或逆轉錄病毒為載體，將具有誘導耐受作用的免疫抑制分子靶基因轉染給供體DC并使其表達，以期能夠: 阻礙異體反應性T細胞增殖如indoleamine 2，3-droxygenase (IDO)； 抑制DC表面共刺激分子表達并誘使抗原特異性T細胞向Th2方向分化（如IL-10）；誘導抗原特異性T細胞無能（如PD-L1）或克隆清除（如CD95L）。已不斷有實驗證實，單獨轉導

15、以上各靶基因即可降低移植物排斥機率，延長器官植活時間。但單獨基因修飾DC尚不能穿越MHC屏障，誘導耐受。這與目前轉基因技術尚未成熟及諸多因素參與免疫耐受有關。如何提高轉基因效率，如何確保基因修飾未成熟DC在靜脈輸注過程中不發生狀態轉換？這些都是值得研究的問題。轉基因中加入增強綠色熒光蛋白或多種免疫抑制靶基因IL-10、TGF-、CTL antigen-4 immunoglobulin fusion protection (CTLA4-Ig)并由逆轉錄病毒同時轉導給未成熟DC，可提高轉導效率，確保DC未成熟狀態18，19。實驗中于移植前36小時靜脈輸注給受體鼠可使其腎植活時間顯著延長。已證實腺病

16、毒可通過核因子-（NF-）誘導DC成熟而降低治療療效。但最近發現，NF-特異誘導物（ODNs）能持續阻斷DC成熟20，并顯著抑制各種刺激下（包括腺病毒）髓樣DC成熟，而免疫抑制基因表達并不受阻。動物實驗中，將NF-ODN處理后以腺病毒為載體轉導CTLA-Ig的供體的髓樣DC，于心臟移植前靜脈輸注給受體，結果MHC完全錯配的異體心臟植活時間明顯延長21。 免疫抑制劑 免疫抑制劑是臨床抗排斥和治療移植物抗宿主病中最主要的藥物。這些免疫抑制劑在控制免疫反應的同時，也在DC的成熟、分化、趨化及活化等環節上起作用而誘導移植免疫耐受。最常用的免疫抑制劑?鈣調神經蛋白抑制劑（如環孢菌素、西羅莫司等）、糖皮質

17、激素可以抑制DC的成熟、分化、共刺激分子表達、IL-12分泌及NF-信號途徑的活化，而誘導免疫耐受，但糖皮質激素對IL-10的分泌沒有影響，而鈣調神經蛋白抑制劑雖然對DC的分化沒有作用，但可以抑制DC的趨化，并且誘導IL-10的表達22。值得注意的是，鈣調神經蛋白信號轉導途徑激活也是調節性T細胞生成所必需的，有人提出，為誘導有效免疫耐受，應適當減少鈣調神經蛋白抑制劑的用量22。 結束語 同種免疫排斥仍是目前移植領域中亟待解決的問題。DC在移植免疫中扮演雙重角色：參與免疫排斥和誘導移植耐受。尤其是后者已成為當前研究熱點。但目前人們對DC的研究尚處于初步階段，有必要確切闡述DC參與移植耐受的多重機

18、制，以便為臨床學家解決移植排斥提供新思路。 【參考文獻】 1 Lechler R，Ng WF，Steinman RM. Dendritic cells in transplantation-friend or foe? Immunity，2001;14: 357-3682 Illigens BM，Yamada A，Fedoseyeva，EV，et al. The relative contribution of direct and indirect antigen recognition pathways to the alloresponse and graft rejection dep

19、ends upon the nature of the transplant. Hum Immunol，2002; 63: 912-9253 Chang CC，Ciubotariu R，Manavalan JS，et al. Tolerization of dendritic cells by T(s)cells:the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4. Nat Immunol，2002; 3: 237-2434 Min WP，Zhou D，Ichim TE，et al. Inhibitory feedback loop b

20、etween tolerogenic dendritic cells and regulatory T cells in transplant tolerance. J Immunol，2003;170:1304-13125 Kuwana M，Kaburaki J，Wright TM，et al. Induction of antigen specific human CD4 T cell angery by peripheral blood DC2 precursors. Eur J Immunol，2001; 31: 2547-25576 Robinson SP，Patterson S，E

21、nglish N，et al. Human peripheral blood contains two distinct lineages of dendritic cells. Eur J Immunol，1999; 29: 2769-27787 Gilliet M，Liu YJ. Generation of human CD8T regulatory cells by CD40 ligand-activated plasmacytoid dendritic cells. J Exp Med，2002; 195: 695-7048 Arpinati M，Green GL，Heimfeld S

22、，et al. Granulocyyte-colony stimulating factor mobilizes T helper 2-inducing dendritic cells. Blood，2000; 95: 2484-24909 Inaba K，Turley S，Yamaide F，et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells.J EXP Med，

23、1998; 188: 2163-217310 Gopinathan R，DePaz HA，Oluwole OO，et al. Role of reentry of in vivo alloMHC peptide-activated T cells into the adult thymus in acquired systemic tolerance.Transplantation，2001; 72: 1533-154111 Steptoe RJ，Fu F，Li W，et al. Augmentation of dendritic cells in murine organ donors by

24、 F1t3 ligand alters the balance between transplant tolerance and immunity. J Immunol，1997; 159: 5483-549112 Blazar BR，McKenna HJ，Panoskaltsis-Mortari A，et al. Flt3 ligand(FL) treatment of murine donors does not modify gtaft-versus-host disease(GVHD) but FL treatment of recipients post-bone marrow tr

25、ansplantation accelerates GVHD lethality. Biol Blood Marrow Transplant，2001; 7: 197-20713 O Connell PJ，Li W，Wang Z，et al. Immature and mature CD8 dendritic cells prolong the survival of vascularized heart allografts. J Immunol，2002; 168: 143-15414 Yunusov MY，Georges GE，Storb R，et al. Flt3 ligand pro

26、motes engraftment of allogeneic hematopoietic stem cells without significant graft-versus-host disease. Transplantation，2003; 75: 933-94015 Eto M，Hackstein H，Kaneko K，et al. Promotion of skin graft toletance across MHC barriers by mobilization of dendritic cells in donor hemopoietic cell infusions.

27、J Immunol，2002;169: 2390-239616 Verbovetsti I，Bychkov H，Trahtemberg U，et al. Opsonization of apoptotic cells by autologous iC3b facilitates clearances by immature dendritic cells，down-regulates DR-and CD86，and up-regulates CC chemokine receptor 7. J Exp Med，2002; 196: 1553-156117 Ferguson TA，Herndon

28、 J，Elzey B，et al. Uptake of apoptotic antigen-coupled cells by lymphoid dendritic cells and cross-priming of CD8 T cells produce active immune unresponsiveness. J Immunol，2002; 168: 5589-559518 Takayama T，Tahara H，Thomson AW. Transduction of dendritic cell progenitors with a retroviral vector encoding viral interleukin-10 and enhanced green fluorescent protein allows purification of potenti