1、四逆散、歸脾湯與溫膽湯對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型大鼠行為學(xué)的影響        【摘要】  【目的】觀察疏肝方四逆散、養(yǎng)血健脾方歸脾湯和理氣化痰方溫膽湯對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型大鼠行為學(xué)的影響，以進(jìn)一步探討該模型的中醫(yī)證候性質(zhì)。【方法】選用SD大鼠40只，按10g/L蔗糖水?dāng)z取率分層隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、模型組、四逆散組（劑量為56g·kg-1·d-1）、歸脾湯組（劑量為196g·kg-1·d-1）、溫膽湯組（劑量為805g·kg-1·d-1）；采用慢性

2、應(yīng)激刺激方法復(fù)制肝郁證模型，觀察各組大鼠體質(zhì)量、血清皮質(zhì)酮含量、10g/L蔗糖水?dāng)z取率和強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間。【結(jié)果】模型組大鼠血清皮質(zhì)酮含量升高、蔗糖水?dāng)z取率降低、強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間延長(zhǎng),與正常對(duì)照組比較差異均有顯著性意義（P005或P001）；四逆散組可降低血清皮質(zhì)酮含量、升高蔗糖水?dāng)z取率，縮短強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間，與模型組比較差異均有顯著性意義（P005或P001）；歸脾湯組、溫膽湯組各檢測(cè)指標(biāo)均無顯著性改變（P005），各組大鼠體質(zhì)量增加量比較均無顯著性差異（P005）。【結(jié)論】本研究的慢性應(yīng)激大鼠模型屬肝郁證模型，與心脾兩虛及痰熱內(nèi)擾證無關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  慢性應(yīng)激/中藥療法；

3、肝郁證/中藥療法；四逆散/應(yīng)用；歸脾湯/治療應(yīng)用；溫膽湯/治療應(yīng)用；疾病模型，動(dòng)物；大鼠Abstract:  ObjectiveTo observe the effects of Sini Powder (SP)，Guipi Decoction (GD) and Wendan Decoction (WD)，which have the actions of soothing liver，nourishing blood and strengthening spleen，and regulating Qi and resolving phlegm respectively，on the

4、 behavior of rat models with liverQi stagnation induced by chronic stress，and to explore the essence of traditional Chinese medical syndrome of this model.MethodsForty male SpragueDawley rats were exposed to an unpredictable sequence of mild stressors for 21 days while being treated by SP (56 g·

5、;kg-1·d-1)，GD (196 g·kg-1·d-1) or WD (805 g·kg-1·d-1).According to the intake rate of 10g/L sucrose solution，the rats were divided into normal control group，model group，SP group，GD group and WD group by stratified randomization.Body weight，standing time during forced swimmin

6、g test and intake rate of 10g/L sucrose solution were investigated during the whole procedure.Serum corticosterone content was detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA).Results In the model group，serum corticosterone content was increased，intake rate of sucrose solution was reduced，and st

7、anding time during forced swimming test was prolonged (P005 or P001 compared with those in the normal control group).SP counteracted the above changes in the mode group (P<005 or P<001)，but GD and WD had no effect on the above indexes (P>005).The difference of body weight increase was insig

8、nificant between the 5 groups (P005).Conclusion The rat model of liverQi stagnation can be induced by chronic stress，which is different from the syndromes of deficiency of both heart and spleen and the interior disturbance of phlegmheat.Key words:  CHRONIC STRESS/TCD therapy;STAGNATION OF LIVER

9、QI/TCD therapy;SINI POWDER /therapeutic use;GUIPI DECOCTION/therapeutic use;WENDAN DECOCTION/therapeutic use;DISEASE MODELS，ANIMAL;RATS證候是中醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵問題之一。由于影響證候的因素復(fù)雜、范圍廣泛以及倫等方面因素的制約，使證候發(fā)生機(jī)理的研究很難深入，建立證候動(dòng)物模型是擺脫這一困境的重要途徑。肝郁證是臨床常見的基礎(chǔ)性證候，已有用CCl4注射、艾葉注射或夾尾急性激怒法、模具限制法等多種制作肝郁證動(dòng)物模型的報(bào)道1，但這些造模方法均因有種種缺陷，近年已很少應(yīng)用。為了

10、更好地模擬臨床肝郁證，我們采用慢性應(yīng)激的方法初步建立了肝郁證大鼠模型2，并從臨床發(fā)病學(xué)特點(diǎn)、核心癥狀和3種治法代表方劑的治療效應(yīng)等方面，分析了該模型的合理性，初步認(rèn)為其證候性質(zhì)屬肝郁且與脾虛無關(guān)3-4。在上述工作的基礎(chǔ)上，本研究擬比較疏肝方四逆散、養(yǎng)血健脾方歸脾湯和理氣化痰方溫膽湯對(duì)該模型大鼠的行為學(xué)效應(yīng)，以進(jìn)一步探討該模型的中醫(yī)證候性質(zhì)。現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法11藥物、試劑及儀器按照方劑學(xué)5確定方劑的組成，其中四逆散（傷寒論）：柴胡6g，枳實(shí)6g，生白芍6g，炙甘草6g；歸脾湯（濟(jì)生方）：白術(shù)9g，茯苓9g，黃芪12g，龍眼肉12g，炒酸棗仁12g，人參6g，木香6g，炙甘草3g，當(dāng)歸9g

11、，遠(yuǎn)志6g；溫膽湯（三因極一病證方論）：半夏6g，竹茹6g，枳實(shí)6g，橘皮9g，炙甘草3g，茯苓45g。以上各方用飲用水將中藥免煎顆粒（首創(chuàng)大地藥業(yè)有限公司）按成人（以60kg計(jì)）1日用量的14倍配制成懸濁液，其中四逆散濃度為056g/mL，歸脾湯濃度為196g/mL，溫膽湯濃度為0805g/mL。蔗糖（C12H22O11，分子量為34229）購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；皮質(zhì)酮酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定試劑盒（批號(hào)：24110603）購(gòu)自美國(guó)R&D公司。HY2調(diào)速多用振蕩器購(gòu)自江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。12動(dòng)物、分組及給藥雄性SD大鼠40只（SPF級(jí)），體質(zhì)量190210g，由北京

12、維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）20020003；正常光照條件，自由攝取食水，馴養(yǎng)1周并進(jìn)行10g/L蔗糖水?dāng)z取訓(xùn)練。禁水24h后，于第2天清晨89時(shí)測(cè)定1h的10g/L蔗糖水?dāng)z取量，攝取率，隨后采用區(qū)組隨機(jī)設(shè)計(jì)的方法，按10g/L蔗糖水?dāng)z取率劃分區(qū)組，再按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組8只。正常對(duì)照組群養(yǎng)，每天灌胃飲用水10mL/kg；慢性應(yīng)激模型組（簡(jiǎn)稱模型組）孤養(yǎng)，每天灌胃飲用水10mL/kg，并按程序施加造模刺激；慢性應(yīng)激加四逆散組（簡(jiǎn)稱四逆散組）每天灌胃劑量為56g/kg的四逆散懸濁液，并按程序施加造模刺激；慢性應(yīng)激加歸脾湯組（簡(jiǎn)稱歸脾湯組）：每天灌胃劑量為196g

13、/kg的歸脾湯懸濁液，并按程序施加造模刺激；慢性應(yīng)激加溫膽湯組（簡(jiǎn)稱溫膽湯組）：每天灌胃劑量為805g/kg的溫膽湯懸濁液，并按程序施加造模刺激。普通飼料與飲用水在允許時(shí)可自由攝取。各組處理時(shí)間均為21d，每3d測(cè)定1次大鼠體質(zhì)量，以調(diào)整灌胃藥量。13造模方法2刺激方法包括：夾尾1min，水平振蕩160次/min共30min，4冰水游泳5min，禁水24h，禁食24h，晝夜顛倒24h，45熱環(huán)境5min。上述刺激每天1種，每種刺激各3次，隨機(jī)安排，使動(dòng)物不能預(yù)知次日的刺激。14血清皮質(zhì)酮測(cè)定于末次刺激后次日，斷頭取血，4放置3h后，4離心15min（4000g），分離血清，-40保存?zhèn)錅y(cè)。檢測(cè)

14、方法按試劑盒說明書操作。15蔗糖水?dāng)z取率測(cè)定根據(jù)6的方法操作。在正式實(shí)驗(yàn)前，先對(duì)大鼠進(jìn)行蔗糖水?dāng)z取訓(xùn)練，即先用10g/L蔗糖水和飲用水同時(shí)喂養(yǎng)48h，然后斷水24h，于次日清晨89時(shí)再次同時(shí)給予大鼠自由飲用10g/L蔗糖水和飲用水共1h，分別記錄攝取量，根據(jù)下列公式計(jì)算蔗糖水?dāng)z取率（p攝取），并在實(shí)驗(yàn)的第7、14、21天各重復(fù)測(cè)量1次。p攝取=V蔗糖水（V蔗糖水+V飲用水）×100%16強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)7的方法進(jìn)行。于末次應(yīng)激24h后，先進(jìn)行適應(yīng)性強(qiáng)迫游泳15min，即將大鼠放入內(nèi)徑20cm、高60cm的圓形透明玻璃缸中，缸中加溫度（25±1）的溫水，深約25

15、cm，使大鼠在水中不能以后爪支撐身體、前爪攀附于缸壁，取出后用毛巾擦干放回籠中。每缸水僅使用1只大鼠。24h后再同樣將大鼠放入水中，累計(jì)記錄5min內(nèi)大鼠在水中停止掙扎、呈漂浮狀態(tài)的時(shí)間。每只大鼠僅進(jìn)行1次實(shí)驗(yàn)，由兩人同時(shí)觀察記錄，取平均值作為各大鼠強(qiáng)迫游泳靜止時(shí)間的數(shù)據(jù)。17統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS130統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較的SNKq檢驗(yàn)。2結(jié)果21各組大鼠體質(zhì)量及血清皮質(zhì)酮的變化表1結(jié)果顯示，各組大鼠體質(zhì)量均有增加，但增加量差異無顯著性意義（P005）。模型組大鼠血清皮質(zhì)酮含量顯著升高，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P001)。四逆散組大鼠血清皮質(zhì)酮含量顯著

16、低于模型組（P005），與正常對(duì)照組比較差異無顯著性意義（P005）。歸脾湯組、溫膽湯組與模型組比較差異均無顯著性意義（P005）。表1各組大鼠體質(zhì)量增加量及血清皮質(zhì)酮的變化比較（略）1         22各組大鼠蔗糖水?dāng)z取率變化表2結(jié)果顯示，模型組大鼠蔗糖水?dāng)z取率顯著降低，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性意義（P005）；四逆散組攝取率升高，與模型組比較差異有顯著性意義 (P005)；歸脾湯組、溫膽湯組攝取率與模型組比較差異均無顯著性意義（P005）。表2各組大鼠蔗糖水?dāng)z取率與強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間比較（略）23各組大

17、鼠強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間的變化表2結(jié)果顯示，模型組大鼠強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間延長(zhǎng),與正常對(duì)照組比較差異有顯著性意義（P001）；四逆散組大鼠靜止時(shí)間減少，與模型組比較差異有顯著性意義(P001)，與正常對(duì)照組比較差異無顯著性意義（P005）；歸脾湯組、溫膽湯組靜止時(shí)間與模型組比較差異無顯著性意義（P005）。3討論情志異常是肝郁證的主要病因,中醫(yī)七情學(xué)說與應(yīng)激理論類似,情志病因的實(shí)質(zhì)是不良生活事件所形成的心理應(yīng)激；同時(shí)中醫(yī)認(rèn)為情志與肝的關(guān)系最為密切,在對(duì)心理應(yīng)激的調(diào)節(jié)過程中肝起著決定性的作用。臨床上與慢性心理應(yīng)激相關(guān)的病證如抑郁癥,在診斷系統(tǒng)中的核心癥狀表現(xiàn)為興趣或愉快的減少和抑郁情緒,辨證多屬于中醫(yī)

18、“郁證”范疇,疏肝理氣解郁是最基本最重要的治則。前期研究建立了肝郁證動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)3，并使用多種不同應(yīng)激條件隨機(jī)組合起來的慢性應(yīng)激程序，模擬臨床上情志異常引發(fā)肝郁證的過程，并將10g/L蔗糖水?dāng)z取率與強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間兩種行為學(xué)指標(biāo)相結(jié)合，模擬人類肝郁證常見的抑郁、沉默寡言、默默不欲飲食以及喜嘆息等癥狀所反映的興趣缺乏和“無助感”的心理狀態(tài)，結(jié)合逍遙散、四逆散和四君子湯的效應(yīng)，建立并初步驗(yàn)證了慢性應(yīng)激肝郁證大鼠模型2，4。本研究中的模型組大鼠10g/L蔗糖水?dāng)z取率減少、強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間增加，疏肝方劑四逆散可有效對(duì)抗的結(jié)果與前述的研究相同，證明這一模型具有良好的再現(xiàn)性。研究表明，慢性應(yīng)激狀態(tài)時(shí)

19、下丘腦垂體腎上腺軸(HPA)功能亢進(jìn)，腎上腺皮質(zhì)激素分泌增加是其主要表現(xiàn)之一8，常作為反映應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，皮質(zhì)酮?jiǎng)t是大鼠腎上腺皮質(zhì)激素的主要形式。在本研究中，模型組大鼠血清皮質(zhì)酮濃度顯著高于正常組，說明本研究的應(yīng)激方案可明顯升高HPA軸活性，有明確的應(yīng)激效應(yīng)，也與我們以往的研究結(jié)果相同2，4。同時(shí)，具有疏肝作用的四逆散可以顯著抑制慢性應(yīng)激引發(fā)的血清皮質(zhì)酮濃度升高，而健脾養(yǎng)心方劑歸脾湯和理氣化痰方劑溫膽湯則均無此效應(yīng)，提示了慢性應(yīng)激引起的血清皮質(zhì)酮濃度升高與肝郁病機(jī)、疏肝治法之間的密切關(guān)系。臨床上，對(duì)證候判斷的正確與否，最終要通過方劑的療效來驗(yàn)證，因此以方測(cè)證是驗(yàn)證動(dòng)物模型中醫(yī)證候性質(zhì)的

20、重要方法之一。應(yīng)用以方測(cè)證方法進(jìn)行研究，必須設(shè)立其他方劑對(duì)照，并應(yīng)選擇功效相對(duì)明確、爭(zhēng)議較少、認(rèn)識(shí)相對(duì)一致的方劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，以增強(qiáng)測(cè)證的說服力9。前期研究4對(duì)比了經(jīng)典的疏肝方劑四逆散、疏肝健脾方劑逍遙散和健脾方劑四君子湯對(duì)該模型行為學(xué)變化的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)具有疏肝作用的四逆散和逍遙散均可明顯改善慢性應(yīng)激引起的大鼠血清皮質(zhì)酮含量升高，并使10g/L蔗糖水?dāng)z取率和強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間恢復(fù)至正常水平，僅有健脾而無疏肝作用的四君子湯則無此效應(yīng)，說明該模型屬于肝郁證的可能性較大，而與脾虛證無關(guān)。本研究從臨床應(yīng)激相關(guān)疾病抑郁癥較常使用的方劑中選擇了歸脾湯和溫膽湯，與四逆散進(jìn)行效應(yīng)對(duì)比。結(jié)果顯示，四逆散可明顯改善

21、慢性應(yīng)激引起的大鼠血清皮質(zhì)酮含量升高、蔗糖水?dāng)z取率減少和強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間延長(zhǎng)，而歸脾湯和溫膽湯均無此效應(yīng)，基本上排除了該模型與心脾兩虛或痰熱證相關(guān)的可能性，從另一側(cè)面支持該模型屬于肝郁的推論。在本研究中，各組大鼠體質(zhì)量增加量未見顯著性差異，說明本研究中慢性應(yīng)激刺激未能影響大鼠體質(zhì)量，與我們以往的研究結(jié)果相同4。在一些中，慢性應(yīng)激刺激對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量影響的結(jié)果不一致10-11，提示體質(zhì)量變化不能確定是由慢性應(yīng)激引起。在肝郁證的多個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)中，也沒有體質(zhì)量減少，提示體質(zhì)量變化對(duì)于本模型意義不大。【文獻(xiàn)】  1任路,李浩.關(guān)于肝郁證動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀及存在問題的思考J.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，34（4）:44.2金光亮,南睿,郭霞珍.慢性應(yīng)激肝郁證大鼠模型的建立J.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（2）:18.3金光亮,王勝蘭.關(guān)于建立肝郁證動(dòng)物模型的思考J.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2004，28（6）:408.4于琦，金光亮.四逆散、逍遙散與四君子湯對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型大鼠行為學(xué)影響的研究J.天津中醫(yī)藥,2007,6:509.5段富津.方劑學(xué)M.上海：上海技術(shù)出版社,1995：58，126，265.6Stathis Bekris，Katerina Antoniou，Spyros Daskas，et al.Behavioural