1、克隆載體克 隆 載 體基本性質基本特征（或載體的構建）原理機制常用的載體質粒載體質粒能利用寄主細胞的 DNA復制系統進行自主 復制；不相容性；可轉 移性（基因工程中采用 非接合性質粒）（1） 具有合適的復制起始位點（ORI）（2） 具有合適的選擇性標記基因（ 3） 若干限制性切酶的單一位點（ 4）具有 較小的分子量和較高的拷貝數。當帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體 菌才能生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能 在含有抗菌素的培養基 （選擇培養基）中生長。（抗 菌素選擇原理）PSC101ColE1PBR322 pUC18 pUC19 TA載體噬 菌 體 載 體入噬 菌體其DNA兩端的5

2、'末端 各帶有12個堿基的互補 單鏈，即cos位點。有 可替代區，即非必需區。 用外源DNA片段替代這 個區域，不會影響噬菌 體顆粒的形成。（1）基因組大小；去除非必需區，建立 外源DNA片段的克隆或替換位點（2） 在DNA的非必需區插入選擇標記：lacZ 基因；基因c I失活（cl基因：溶源 過程控制基因）；Spi篩選（野生型 入 噬菌體在帶有 P2原噬菌體的溶源性 E.coli中 的生長會受到限制的表型， 稱作Spi+ ，即對P2噬菌體的干擾敏 感）1）通過裂解過程增殖載體2）載體與外源DNA的酶切3）外源DNA與載體的連接4）重組噬菌體的體外 包裝5）包裝噬菌體顆粒的感染6）篩選

3、（入噬菌體載體的克隆原理）插入式載體置換型載體（取代型載 體）M13噬 菌體 載體M13噬菌體的基因組為 單鏈DNA。噬菌體顆粒 的大小受其DNA端點制 約的，不存在包裝限制。 只感染雄性大腸桿菌基因間隔區（in terge nic regio n, IG區）基因II與基因IV之間存在一段 507bp的基因間隔區，含有復制起始位 點，是實施改造、構建人工載體的重點 區域。IG區只有一個Bsu I切點。（2）加入酶切位點，在IG區加入單一 切酶位點。M13mp1在IG區插入一個大 腸桿菌的LacZ'（-肽序列）。使克隆1、以（+）鏈DNA為摸板，合成互補（-）鏈，該 雙鏈稱復制型 DNA

4、（ RFDNA。2、RFDNA在宿主細胞 能快速增殖，可增加到每個細胞約200個拷貝。3、單鏈特異的DNA吉合蛋白結合在 （+ ）鏈上，從而阻 斷了其互補鏈，即（）鏈的合成，這樣，細胞就 會不斷的合成（+）鏈DNA 4、游離出來的（+）鏈 DNA先與基因V的編碼產物形成特異的 DNA-蛋白質 復合物，然后轉移到寄主細胞膜，同時基因V的蛋M13mpn n代表系列數 字對M13mp1的改 進加上常用 的酶切位點。M13mp2LacZ'5'端的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體 細胞外，M13重組分子篩選簡便， 被M13 噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成 混濁斑，易于辨認挑選。而且

5、重組分子 越大，混濁斑的混濁度亦越大 但 M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小， 只有1.5 kb白質從（+） DNA鏈上脫落下來，余下的 M13（ +）鏈 DNA則是從其感染的寄主細胞的細胞膜溢出的過程 中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。（M13噬菌體產生單雙鏈DNA的機制）的第13個核 苷酸G突變成 A,產生了一 個EccR I切 占八、噬 菌 體- 質 粒 雜 合 載 體黏粒載體考斯質粒是一類人工構 建的含有入-DNAcos序 列和質粒復制子的的特 殊類型載體。能像 -DNA那樣進行體外包 裝，并咼效轉染受體細 胞；能像質粒那樣在受 體細胞中自主復制具有 較咼容量的克隆能力： 45kb

6、;具有與同源性序 列的質粒進行重組的能 力粘粒（cosmid ）是帶有 cos序列的質 粒。cos序列是噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。黏粒的組成包括質粒復制起點（colEI ）,抗性標記（amp）, cos 位 點，因而能象質粒一樣轉化和增殖。克 隆的最大DNA片段可達45kb 。有的 粘粒載體含有兩個cos位點，在某種程度上可提高使用效率。設計構建的柯斯質粒一般長46kb。其上的cos位點的一個重要作用是識別噬菌體的外殼蛋白。凡具 有cos位點的任何DNA分子只要在長度相當于噬菌 體基因組，就可以冋外殼蛋白結合而被包裝成類似 噬菌體入的顆粒。因此，插入柯斯質粒的外

7、源DNA可大于40kb。重組的柯斯質粒可象噬菌體入一樣感 染大腸桿菌，并在細菌細胞中復制。噬菌 粒載 體能像質粒那樣在受體細 胞中自主復制能像M13-DNA那樣體外包裝， 并高效轉染受體細胞 裝載量比常規的M13mp系列要大很多（10 kb 通過克隆雙鏈 DNA能獲 得同等長度的單一單鏈DNA噬菌粒載體綜合了質粒載體和M13噬菌體載體優點，含有ColEl復制起始位點、 抗生素抗性選擇標記和絲狀體噬菌體 DNA間隔區（含有噬菌體DNAM制起始、 終止以及噬菌體顆粒形態發生所必需 的全部順式作用元件）它具有質粒的復制起點、選擇性標記、 多克隆位點等，方便 DNA的操作，可在 細胞穩定存在；又具有單

8、鏈噬菌體的復1.具有較小分子量基因組DNA可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進行分離與操作；2.編碼一個 amP基因作為選擇記號， 便于轉化子的選擇；3.拷 貝數含量高4.存在著一個多克隆位點區，因此多 種不冋類型的外源 DNA片段，不經修飾便可直接插 入到載體分子上；5.多克隆位點區阻斷了大腸桿菌 lacZ基因的5'-端編碼區，可按照IPTG顯色反應 試驗師選6. lacZ 基因是置于lac啟動子的控制之 下，插入的外源基因便會以融合蛋白質的形式表達；PUC118 和PUC119重組操作簡便，篩選容 易制起點，在輔助噬菌體的存在下，可進 行噬菌體的繁殖，產生單鏈的子代噬菌 體7含

9、有質粒的復制起點，可復制形成大量的雙鏈 DNA 分子8.帶有一個M13噬菌體的復制起點，在有輔 助噬菌體感染的寄主細胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養基中；9.;在PUC118和pUC119這兩個載體中，多克隆位點區的 核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當中的一 個可轉錄克隆基因的正鏈 DNA另一個則可轉錄出負鏈DNA人工染色 體染色體具有復制功能， 利用染色體的復制元件 來驅動外源DNA片段復 制的載體稱為人工染色 體載體其裝載外源DNA的容量比質粒、噬菌體 和噬菌體-質粒雜合載體等有很大的拓 展，甚至可以跟染色體的大小相媲美。 人工染色體載體拷貝數少，制備困難， 通

10、常采取“穿梭載體”的策略來解決含有質粒載體所必備的第一受體（大腸桿菌）質粒復制起始位點，這樣的載體在大腸桿菌可以按質粒復 制形式進行高拷貝復制，含有第二受體（如酵母）端粒（TEL）、DNAM制起始位點（ARS）和著絲粒（CEN） 以及合適的選擇標記。載體在體外與目的DNA重組后轉化到第二受體細胞，按照染色體復制的形式進 行復制和傳遞。篩選第一受體的克隆子一般采用抗 生素抗性選擇標記；篩選第二受體的克隆子常用與 受體互補的營養缺陷型。酵母人工染 色體載體YAC 細菌人工染 色體載體BACP1噬菌體人 工染色體載體PAC質粒載體總結質粒 載 體類型長度選擇標記克隆位點PSC101天然質粒，屬嚴緊型

11、、低拷貝型9.09kb四環素抗性Tetr7 個克隆位點：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hi nd III、BamH I、Sal I 、Sam I主要使用EcoR IColEI天然質粒，屬松弛型多拷貝型6.3 kb大腸桿菌素（colicin ） E1 和對E1免疫的 基因（immEDEcoR I位于E1部，插入外源 DNA會導致E1失 活，使受體菌不能合成E1 （ColEI ），但仍然表現出對E1免疫型（ImmEl）pBR322兀件來源復制起點 oripMB1系列（來源于ColEI ）的高拷貝型復制起點 Ampr 基因pSP2124質粒的Amp基因Tet r基因pSC101的 Tetr基

12、因。4363bp氨卞冃霉素和四環素抗性24個克隆位點。其中9個會導致 Tetr基因失活（如BamH、Hi nd川、Sal I ）;3個會導致 Amp基因失活（Sca I、PvuI、Pst 1）。pUC系列（i ）來自pBR322質粒的復制起點（ori ）; （ii ）氨芐青 霉素抗性基因（ampr），但它不再含有原來的核酸切限制 酶的單識別位點；（iii ）大腸桿菌3 -半乳糖酶基因（lacZ ）的啟動子及其編碼a -肽鏈的DNA序列，此結構特稱為lacZ '基因；（iv ）位于lac Z'基因中的靠近 5'-端的一段多克隆位點（MCS區段，但它并不破壞該 基因的功能2

13、.7kbAmpicilli n 抗性和lacZ 的a肽互補（監白斑）相 結合。10個連續的單一限制酶切位點，位于lacZ '基因的5'端。TA載體耐熱聚合酶可在 PCR產物的3'端加上一個非配對的 脫氧腺嘌呤核苷（A）。根據這一特點研制出線性TA質粒載體，其5'端各帶有一個不配對的脫氧胸腺嘧 啶（T），用該載體可進行 PCR產物的直接克隆。TA載體構建：在 般質粒載體的基礎上構建。方法1:先采用限制性切核酸酶酶切使質粒載體線性化，再通過K1enow片段將酶切的線性載體末端補平方法2:利用產生平末端的限制性切核酸酶酶切產生平末端，最后將線性化鈍 末端質粒載體加 T

14、反應形成。目前有很多公司推出了TA質粒載體。入噬菌體載體入噬菌體載體分類插入式載體一種只具有一 個可供外源DNA 插入的克隆位 點的派生載體入噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構建。cl基因插入失活：如入gt10、入NM1149等載體，在cl基因上有EcoR I及Hind III 的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。cI基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產生清晰的噬菌斑。相反，產生混濁 的噬菌斑。Lac Z 基因插入失活：如 charon16A載體，在非必須區段引入lac Z 基因，在lac Z 基因上有 EcoR I位點，插入失活后

15、利用X-gal法篩選（藍白篩選）置換型載體（取代型載 體）具有成對的克 隆位點，在這 兩個位點之間 的入DNA區段可 以被外源DNA 片段所取代。野生型噬菌體染色體的中段對于噬菌體的感染和復制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段這些載體是用Lac 5替換入噬菌體的中間區段，同時將Lac 5作為選擇標記使用時用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli繁殖，并裂解 E.coli ,形成空斑。置換型入噬菌體是使用最廣泛的載體。人工染類別元件優點酵母人工染色體 載體YAC是最常用來克隆 很大DNA片段（2Mb的系統。為構建YAC需要

16、結合四個短序列：即二個端粒、 一個著絲粒和一個 ARS元件，并將一適當大小的 外源DNA連接成一線性DNA分子，而端粒序列位 于正確的末端。YAC的構建有比在細菌中克隆的一些優點，因為某些真核 細胞的序列，特別是重復序列是難以甚至不可能在細菌中 繁殖的，酵母細胞卻具有這樣的能力色體細菌人工染色體 載體BAC是基于大腸桿菌 的F質粒構建 的，高通量低拷 貝的質粒載體每個環狀DNA分子中攜帶一個抗生素抗性標 記，一個來源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴謹型控制的復制子oriS（ Shizuya et al.1992 ），個易于DNA復制的由ATP驅動的解 旋酶（RepE）以及三個確保低拷貝質粒精確

17、 分配至子代細胞的基因座（parA , parB ,和parC）以大腸桿菌為寄主，轉化率高，構建BAC文庫比YAC文庫更容易；BAC載體以環型超螺旋狀態存在，從大腸桿 菌中提取質粒較方便，而從酵母中分離DNA較困難；BAC的復制子來源于 F因子，可穩定遺傳，嵌合及重組 現象少；可以通過菌落原位雜交來篩選目的基因，方便 快捷；BAC載體在克隆位點的兩側具有 T7和Sp6聚合酶 啟動子，可以用于轉錄獲得 RNA探針或直接用于插入片段 的末端測序。表達載體分類結構組成及表達兀件特點或優點備注質 粒 表 達 載 體原核表達載體1啟動子、2轉錄終止子（防止克隆的外源基因表達干 擾載體的穩疋性）3核糖體結

18、合位點表達方式有： 組成型表達， 誘導型表達。 融合型表達， 分泌型表達。啟動子類型：根據作用方式及功能分類組成 型啟動子 組織特異啟動子又稱器官特異性啟動子。 誘導型啟動子酵母表達載體來自pBR322基本骨架含有該質粒復制起 始位點（ori） , lacZ 基因、bla 或 amp、tet 等基因。含有 URA3 HIS3、LEU2 TRP、LYS2與特定的宿主營養缺陷突變體互補篩GAP是組成型啟動子。其余是誘導型啟動 子。酵母表達載體多為穿梭載體 ：既可以 在大腸桿菌中繁殖，獲得足夠的載體DNA 進行體外操作，又可以在酵母中復制、 表由于原核生物和真核生物存在糖基化、 酰基化 等翻譯后修飾

19、反應機制的差異， 真核基因的原 核表達難以獲得有活性的蛋白。 酵母成為真核 表達的首選系統。選或利用 zeocin、basticidin （殺稻瘟菌 素）的抗性基因篩選。啟動子有GAP AOXI、 AUGI 和 GAL1 等。達和選擇。融合蛋白表達載體：于外源基 因插入位點的C端或N端插入了 1個6X His標簽，或在5'端插入了 a -因子作 為分泌信號Ti質 粒 表 達 載 體一元 載體一兀載體就是含目的基因的中間表達載體 與改造后的受體（Ti質粒）通過同源重組所 產生的一種復合型載體，也稱為共整合載 體。由于該載體的T-DNA區與Vir區緊密連 鎖，也稱為順式載體（cis-vec

20、tor）Ti質粒是根癌農桿菌中發現的可引發植 物產生冠癭瘤的質粒。根據冠癭瘤合成的 冠癭堿種類，Ti質粒可分為章魚堿、農 桿堿、農桿菌素和琥珀堿4種不冋類型Ti質粒可分為 T-DNA Vir、Con和Ori 4 個功能區。T-DNA區是Ti質粒中能轉 移到植物細胞的區域。Vir區 位于T-DNA區的上游，其表達產物可激活 T-DNA向植物細胞的轉移， 這一個區域也 稱為致病區。Con區該區含有與農桿菌之間接合轉 移有關的基因（tra ），這些基因受佰主細 胞合成的冠癭堿激活，使Ti質粒在細菌之間轉移。Ori區 調控Ti質粒的自我復制，為復 制起始區構建的基本原理：引入分子質量較小的中間載體，將

21、欲轉化的目的基因及抗性標記基因構建到中間載體上。將Ti質粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，僅 保留其兩邊界及與 T-DNA轉移所必需的25個 堿基序列，構建成所謂卸甲載體。 在卸甲載體 的T-DNA區被刪除致瘤基因位點插入中間載 體同源的質粒序列，將中間載體轉入含有卸甲 載體的根癌農桿菌中，構建在中間載體上目的 基因可通過冋源重組整合到卸甲載體Ti質粒的T-DNA區，并與卸甲載體Ti質粒一起復制。二元 載體雙兀表達載體系統主要包括兩個部分：一部分為卸甲Ti質粒，這類Ti質粒由于 缺失了 T- DNA區域，完全喪失了致瘤作 用，主要是提供Vir基因功能，激活處于反 式位置上的T- DNA的轉移。

22、另一部份是微 型Ti質粒，它在T- DNA左右邊界序列之間 提供植株選擇標記如NPTII基因以及Lac Z基因等。雙兀載體系統的構建的原理是Ti質粒上的 Vir基因可以反式激活 T- DNA的轉移。與共整合載體所不同的是， 它不依賴兩個 質粒之間的同源序列，不需要共整合過程就能 在農桿菌獨立復制雙元表達載體構件方便，轉化效率高于一 元載體。病 毒 表 達 載桿狀病毒表 達載體桿狀病毒表達系統的基本兀件：（1）啟動子：多個啟動子同時表達多個外源 基因。（2）poly A加尾信號：（3）冋源重組 序列。（4）穿梭載體必需兀件。除帶有病毒 自身的復制起始位點外，還帶有pUC質粒的重組蛋白具有完整的生

23、物學功能：接近天然蛋白。能進行翻譯后的加工修飾： 研究糖基化對蛋白質結構與功能影響方 面的理想模型。表達水平高：最高可使 目的蛋白的量達到細胞總蛋白的50%。桿狀病毒科病毒，桿狀病毒顆粒，雙鏈閉合環 狀DNA病毒，專一性感染無脊椎動物將外源基因先克隆到轉移載體上，再與病毒基因組共同轉染細胞，通過細胞的同源重組獲得 帶有外源基因的重組病毒的策略。體復制子及以amp，可以在細菌進行擴增。（5） 篩選標記。 能容納大分子的插入片段：上限未知。 能同時表達多個基因： 在同一細胞同時表達多個基因。能表達基因組DNA昆蟲桿狀病毒表達系統具有剪切的功能。對重組蛋白進行定位的功能： 如將核蛋白 轉送到細胞核上

24、，膜蛋白則定位在膜上， 分泌蛋白則可分泌到細胞外等。腺病毒載體腺病毒 DNA末端結構突出特點1 ）帶有100bp反向的末端重復序列（ITR），而且在 每一條單鏈的 5'-末端還共價地連接著末 端結合蛋白，對病毒的復制有重要作用。2） 當它從病毒顆粒中分離出來之時，便會自發地環化起來，爾后許多環形分子又聚合成多 聚體腺病毒載體是目前最為廣泛應用的基因 載體，也是唯一基因藥物的載體雙鏈DNA的分子大小約為 36kb.可應用于1.基因治療2.表達真核基因3. 研制疫苗首先構建一個含多克隆位點和篩選標志的轉 移質粒，該質粒含有病毒基因組某段早期序 列；然后將一個含有啟動子一外源基因-polyA

25、的表達盒插入到上述質粒中腺病毒E1、E3或E4至右側的ITR區之間，構建成載有外源 基因的穿梭質粒。反 轉 錄 病 毒 載 體泡沫病毒類從5'端開始依次是：5'長末端重復序 列（5 ' -LTR），帶有增強子和啟動子序列； psi序列，又稱“序列，是病毒包裝所必 須的信號序列；gag,編碼病毒衣殼蛋白； pol，編碼反轉錄酶和整合酶（Int）:env,編碼病毒顆粒外層包裝蛋白；3'長 末端重復序列（3 ' -LTR）,帶有poly A加尾 信號序列。一類含單鏈RNA的動物病毒。它的基因組 含有2條相同的正鏈RNA分子，包裝成二 倍體病毒顆粒。（1）在大多

26、數情況下，反 轉錄病毒的腫瘤基因（onc）都能夠在正常 的細胞中轉錄。2 ）反轉錄病毒的寄主圍 相當廣，包括無脊椎動物和脊椎動物。3） 反轉錄病毒具有強啟動子， 外源基因可得 到有效表達。4）反轉錄病毒不但感染效 率高，而且不招致寄主細胞的死亡載體的構建：分離原病毒 DNA刪去部分序列t組入選擇 性標記基因、目的基因和調控兀件t克隆到含 有大腸桿菌復制起始位點的克隆載體t轉化 大腸桿菌t獲得反轉錄病毒克隆載體t輔助細胞系（包裝細胞系）t擴增慢病毒類致癌 病毒 類SV40病毒型轉化載體根據SV40 DNAS入敏感動物細胞的轉方向， 分為早期轉錄區和晚期轉錄區。早期轉錄區包括與病毒感染相關的t抗原含有能夠被真核細胞識別的有效的啟 動子。有許多種動物病毒，在其感染周 期中都能夠持續地復制，使其基因組拷貝猿猴空泡病毒 40（Simia n vacuolati ngvirus40, SV40）基因組是一種環形雙鏈的DNA其大小僅有5243bp，很適于基因操作。導致人基因(smallT-antigen) 和 T抗原基因(large T-antigen)等；含有 BamHI等限制性切核酸酶識別位點；晚期轉錄區包括與病 毒殼蛋白合成相關的基因，