1、核酸分子雜交法這是最早用于性病診斷的重組DNA技術(shù)。基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈，此雜交過(guò)程是高度特異的。雜交的雙方是待測(cè)核酸及探針。待測(cè)核酸序列為性病病原體基因組或質(zhì)粒DNA。探針以放射核素或非放射性核素標(biāo)記，以利于雜交信號(hào)的檢測(cè)。 所謂雜交（hydridization）指兩個(gè)以上的分子因具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體（hybrid），雜交體中的分子不是來(lái)自一個(gè)二聚體分子。同一個(gè)二聚體中的兩個(gè)分子在變性解離后重組合稱為復(fù)性。利用兩條不同來(lái)源的多核苷酸鏈之間的互補(bǔ)性而使它們形成雜交體雙鏈叫核酸雜交。與核

2、酸雜交技術(shù)相對(duì)應(yīng)的另一項(xiàng)技術(shù)被稱為探針技術(shù)，它是指利用標(biāo)記分子對(duì)其它分子的識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對(duì)后者進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)，我們把標(biāo)記的分子叫探針（Probe）。將探針技術(shù)與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，從而使分子雜交技術(shù)得以廣泛推廣應(yīng)用。目前所用的核酸雜交技術(shù)均應(yīng)用了標(biāo)記技術(shù)。 （一）DNA的變性 DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無(wú)規(guī)則線團(tuán)，稱為DNA變性。加熱、改變DNA溶液中的pH，或有機(jī)溶劑等理化因素的影響，均可使DNA變性。變性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。 （二）DNA復(fù)性 變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱

3、為復(fù)性。復(fù)性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。 核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過(guò)堿基對(duì)之間非共價(jià)健的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來(lái)源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間，由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進(jìn)行分子雜交時(shí)，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過(guò)程稱為變性，一般通過(guò)加熱或提高pH值來(lái)實(shí)現(xiàn)。使單鏈聚合成雙鏈過(guò)程稱為退火或復(fù)性。用分子雜交進(jìn)行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素標(biāo)記成為探

4、針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交。 （三）探針靶分子反應(yīng) 從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)。抗體抗體、外源凝集素碳水化合物、親合素生物素、受體配基（Ligand）以及互補(bǔ)核酸間的雜交均屬于探針靶分子反應(yīng)，蛋白質(zhì)探針（如抗體）與特異靶分子是通過(guò)混合力（疏水離子和氫鍵）的作用在少數(shù)特異位點(diǎn)上的結(jié)合，而核酸探針與互補(bǔ)鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長(zhǎng)短不同，通過(guò)氫鍵幾十、幾百甚至上千個(gè)位點(diǎn)上的結(jié)合。這就決定它的特異性。 基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探

5、針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類。DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。 一、核酸探針的種類 （一）DNA探針 DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現(xiàn)已獲的DNA探針種類很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類ALU探針，這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比用G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向，加之分子雜交技術(shù)的高

6、度敏感性，分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。 DNA探針（包括cDNA探針）有三大優(yōu)點(diǎn)：第一，這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。其次，DNA探針不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。 （二）cDNA探針 cDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子（complementary DNA）。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細(xì)胞后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙

7、鏈cDNA，并進(jìn)而整合入宿主細(xì)胞染色體DNA分子，隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制同時(shí)復(fù)制，這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下，可被復(fù)制多代，但不被表達(dá)，故無(wú)毒性，一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復(fù)制。如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細(xì)胞癌變。 逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于基因的克隆和表達(dá)。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶也已商品化。最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核mRNA3末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補(bǔ)于mRNA的cDNA鏈，然后再用RNase H將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成

8、了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。 所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個(gè)有限制酶切點(diǎn)的接頭(Adapter),再經(jīng)特定限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補(bǔ)末端的載體進(jìn)行連接。常用的克隆載體是噬菌體DNA，如gt、EMBL和Charon 系列等。用這類載體可以得到包含105以上轉(zhuǎn)化子文庫(kù)，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測(cè)。 （三）RNA探針 RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA

9、是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過(guò)程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測(cè)。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組DNA克隆時(shí)，因無(wú)DNA探針可利用，獲得HIV的全套標(biāo)記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。 隨著體外逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已成功的建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體PSP和PGEM，這類載體在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別帶有SP6啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄。如果在多克隆位點(diǎn)接頭中插入了外源DNA片段，則可以以DNA兩條鏈中的

10、一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高，在1小時(shí)內(nèi)可合成近10g的RNA產(chǎn)物。只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的dUTP，則所合成的RNA可得高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長(zhǎng)度并可提高標(biāo)記分子的利用率。 RNA探針和cDNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。 （四）寡核苷酸探針 前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測(cè)序時(shí)，也常應(yīng)用克隆探針。克隆探針一般較寡核苷酸探針的特異性強(qiáng)，復(fù)雜度也高，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度而言，較長(zhǎng)的序列隨機(jī)碰撞互補(bǔ)

11、序列的機(jī)會(huì)較短序列少。克隆探針的另一優(yōu)點(diǎn)是，可獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)，因?yàn)榭寺√结樰^寡核苷酸探針摻入的可檢測(cè)標(biāo)記基因更多。但是，較長(zhǎng)的探針對(duì)于靶序列變異的識(shí)別能力又有所降低。對(duì)于僅是單個(gè)堿基或少數(shù)堿基不配的兩個(gè)序列，克隆探針不能區(qū)分，往往雜交信號(hào)相當(dāng)。這既是其優(yōu)點(diǎn)，又是其缺點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)用于檢測(cè)病原微生物時(shí)，不會(huì)因病毒或細(xì)菌DNA的少許變異而漏診，缺點(diǎn)則是不能用于檢測(cè)突變點(diǎn)。這種情況，通常要采用化學(xué)合成的寡核苷酸探針。 合成的寡核苷酸探針具有以下特點(diǎn)：第一，由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短。第二，寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)一個(gè)堿基的變化，因?yàn)槎烫结樦袎A基

12、錯(cuò)配能大幅度降低雜交體的Tm值。第三，一次可大量合成寡核苷酸探針，使得這種探針價(jià)格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。最常用的寡核苷酸探針長(zhǎng)1840個(gè)鹼基，目前的合成可有效地合成至少50個(gè)堿基的探針。 對(duì)于合成的寡核苷酸探針有以下要求： （1）長(zhǎng)度以18-50堿基為宜，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)，合成量也低；較短探針特異性較差。 （2）堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會(huì)增加非特異雜交。 （3）探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。 （4）避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)。 （5）一旦選定某一序列符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將

13、該序列與核酸庫(kù)中的核酸序列比較，探針序列應(yīng)與靶序列核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不應(yīng)超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基的同源。否則，該探針不能用。 二、核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè) 分子雜交是核酸鏈以堿基配對(duì)規(guī)則的一種結(jié)合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子雜交這一特性來(lái)對(duì)特定核酸序列進(jìn)行檢測(cè)，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測(cè)的進(jìn)行標(biāo)記，這條鏈就稱為核酸探針。因此，核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵。放射性同位素標(biāo)記是最早采用的也是目前最常用的核酸探針標(biāo)記方法。常用的放射性同位素有32P和35S。32P因其能量高，信號(hào)強(qiáng)，所以最常用。放射性同位素標(biāo)記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期限制（3

14、2P半衰期為14.3天，35S半衰期為87.1天，125I半衰期為60天），3H的半衰期長(zhǎng)達(dá)12.3年，但它所釋放射線的能量太低，只能用于組織原位雜交。由于同位素標(biāo)記的探針在使用過(guò)程中存在著上述缺點(diǎn)，近年來(lái)，人們?cè)趯ふ曳欠派湫詷?biāo)記物方面取得了很大進(jìn)展。國(guó)內(nèi)已具備生物素類標(biāo)記物的生產(chǎn)能力，并有相應(yīng)試劑出售。目前非放射性標(biāo)記物有下述幾類：金屬如Hg、熒光物質(zhì)如F2TC、半抗原如地高辛、生物素、酶類如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP）等，不同的標(biāo)記物，所標(biāo)記探針的方法及檢測(cè)方法也各異。 核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)有：缺口平移；DNA快速末端標(biāo)記；用T4多核苷酸酶標(biāo)記DNA 5

15、'末端，隨引物延伸；聚合酶鏈反應(yīng)。 核酸探針的非放射性標(biāo)記技術(shù)有：光促生物素標(biāo)記核酸、酶促生物素標(biāo)記核酸、寡核苷酸的生物素末端標(biāo)記、酶標(biāo)DNA、酶標(biāo)寡核苷酸、DNA半抗原標(biāo)記。 三、核酸分子雜交方法 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，新的核酸分子雜交技術(shù)不斷出現(xiàn)和完善，核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。 在固相雜交中，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測(cè)和能防止

16、靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，所以比較常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。 液相雜交是一種研究最早且操作簡(jiǎn)便的雜交類型，由于液相雜交后過(guò)量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高，所以不如固相雜交那樣普遍。近幾年由于雜交檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，商業(yè)性基因探針診斷盒的實(shí)際應(yīng)用，推動(dòng)了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展，下面對(duì)固相雜交和液相雜交分別進(jìn)行介紹。 （一）固相膜核酸分子雜交方法。 固相核酸雜交多是在膜上進(jìn)行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法。 1DNA的變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵,Southern印跡雜交時(shí)DNA在凝膠中變

17、性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/L NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時(shí)，然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時(shí)。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強(qiáng)酸會(huì)使核酸降解。堿變性可避免DNA的降解、熱變性要在低DNA濃度（100g/ml）和低鹽濃度（0.1 SSC 15mmol/L NaOH，1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)下進(jìn)行。用SSC稀釋DNA溶液為50g/ml，加10mol/L NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10mol/L

18、HC1或5mol/L NaH2PO4調(diào)pH到7-8(亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100后，調(diào)至中性，或只加熱10010min)。DNA變性可用OD260增加（約30-40%）來(lái)檢測(cè)，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰溶保存。 2變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min2h，涼干，DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后再在80真空干燥2h。 3預(yù)雜交。濕潤(rùn)的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml預(yù)熱至60的預(yù)雜交液（6

19、5;SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100g/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經(jīng)過(guò)剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10g/ml，用前放100水溶液中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，用封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68水浴中保溫3-12h，當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68時(shí)，在濾膜表面常會(huì)形成水氣泡，輕輕晃動(dòng)袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點(diǎn)對(duì)于保證濾膜表面充分浸潤(rùn)預(yù)雜交液很重要。 4雜交。 從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液，用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好足量的液體保持濾膜濕潤(rùn)（50ul/cm2）。溶液的組成是

20、6×SSC，0.01mol/L EDTA，變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口。雜交反應(yīng)在68水浴中進(jìn)行，所需時(shí)間視探針和檢測(cè)靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般為4-20h。 5洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5% SDS溶液的盤中,室溫下漂洗5min,再將濾膜移入2×SSC和0.1% SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動(dòng)),然后將濾膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68輕輕搖

21、動(dòng)保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。 洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12以下，Tm=69.3+0.41×(G+C）%，雙鏈DNA的Tm值隨錯(cuò)配堿基對(duì)數(shù)每增加1%而遞減1。 6結(jié)果顯示。放射性測(cè)定方法，固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射自顯影法、另一是液閃計(jì)數(shù)法，放射自顯影法比較簡(jiǎn)單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再顯影，定影即可。對(duì)于雜交信號(hào)較強(qiáng)的固相膜，用一塊增敏屏可顯著增強(qiáng)暴光強(qiáng)度。此外，為了減弱32P的放射，暴光通常在-20或- 80下進(jìn)行。液閃計(jì)數(shù)法主要用于斑點(diǎn)和狹縫雜交及為了比較兩個(gè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱等情形，方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成

22、小塊（每份樣品1塊），80真空干燥后裝閃爍瓶，加入25 ml閃爍液，剪2-3塊無(wú)樣品作為本底對(duì)照，在液體閃爍計(jì)數(shù)器上自動(dòng)計(jì)數(shù)，液體計(jì)數(shù)測(cè)定放射性強(qiáng)度也可以在放射自顯影之后進(jìn)行。 (二)固相核酸分子雜交類型 1菌落原位雜交（colony in situ hybridization）。是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)、并與主平板上的菌落對(duì)位。 實(shí)驗(yàn)步驟如下： 將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置

23、相同。 培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。 在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。 5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl）浸濕的濾紙上，放置10min。 將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl pH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min，重復(fù)中和一次。 將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過(guò)的濾紙上，放置10min，SSPE配成20×貯備液：3.6mol/L NaCl,0.2mol/L NaH

24、2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。 將濾膜用濾紙吸干，80真空烘干2h。 2斑點(diǎn)雜交（Dot blot）。是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如Minifold和、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。 （1）DNA斑點(diǎn)雜交： 先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。 將DNA樣

25、品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上,每個(gè)樣品一般點(diǎn)5l(210g DNA)。 將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?（2）RNA斑點(diǎn)雜交：與上法類似，每個(gè)樣品至多加10g總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5l DEPC水，加5l甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8l點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。 （3）完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：應(yīng)用類似檢測(cè)細(xì)菌菌落的方法，可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測(cè)，將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與

26、檢測(cè)。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗辜?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。 3.Southern印跡雜交（Southern blot）。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交的基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和和高鹽下通過(guò)毛吸作用

27、將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上、烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著，附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確立探針互補(bǔ)的每一條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多消化產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 （1）瓊脂糖凝膠電泳。利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消解片段（0.325kb）分離開，分離大分子DNA片段（800-12000bp）用低濃度瓊脂糖（0.7%），分離小分子片段（5001000bp）用高濃度瓊脂糖（1.0%），300-5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠。根據(jù)分離樣品品

28、質(zhì)，分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽。 電泳時(shí)，同時(shí)將分子量標(biāo)記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過(guò)夜，電泳完畢，將膠浸到含0.5g/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在灌膠前加入膠片中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5，曝光20-40s。 （2）硝酸纖維素膜吸印。 1將膠片切成合適大小，切去右上角作為記號(hào)。 2將膠片放進(jìn)盛有變性緩沖液（1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH）的盤中輕晃15min。 3換到中和緩沖液（1mol/L Tris-HCl,

29、pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盤中輕晃30min。 4裁一張硝酸纖維素膜、2-4張3mm濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙），都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路）。先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC緩沖液,接觸膠和硝酸纖維素膜時(shí)都要戴手套操作。 5平盤上放一塊比膠大的平板上面鋪一張3mm濾紙,起燈蕊作用,盤中加入少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚），不能沒過(guò)平板，使3mm濾紙充分飽和。 6將膠倒扣在3mm濾紙上。 7浸濕的硝酸纖維素膜在膠上，對(duì)齊。鋪膜時(shí)從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時(shí)，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾

30、紙直接接觸。 8膜上放一張3mm濾紙，不能與膠接觸。 9上面加吸印紙及重物（500g左右）。 10通過(guò)濾紙的燈芯作用，平盤中的緩沖液就會(huì)通過(guò)膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時(shí)更換浸濕的吸印紙，在室溫下轉(zhuǎn)印過(guò)夜。 11清除上面的東西。用鑷子將膜取出，在6×SSC中洗一下。 12自然干燥，80烤2h。 13這是的膜就可進(jìn)行雜交，或室溫密封保存。 4Northern印跡雜交（Northern blot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被稱為Nor

31、thern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blot。Northern 印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進(jìn)樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)樗鼤?huì)水解RNA的2'-羥基基團(tuán)。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過(guò)程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后用低鹽緩沖液洗脫，否則RNA會(huì)被洗脫。在膠中不能加EB，因?yàn)樗鼤?huì)影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合。為測(cè)定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照像，樣品膠則進(jìn)行Nort

32、hern轉(zhuǎn)印。標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5g/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機(jī)拍照時(shí)，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過(guò)久，會(huì)使RNA信號(hào)降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時(shí)，甲基氫氧化銀是一種強(qiáng)力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。 RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法。 <1>試劑： 10×MSE緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/L EDTA pH8.0。

33、 5×載樣緩沖液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚藍(lán)。 甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。 20×SSC； 去離子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris，pH7.5。 <2>步驟： 140ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60，加7ml10×MSE緩沖液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。 2等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。 3使RNA變性（最多20g），R

34、NA4.5ml,10×MSE緩沖液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲酰胺10ml。 455加熱15min，冰浴冷卻。 5加2ml5×載樣緩沖液。 6上樣、同時(shí)加RNA標(biāo)記物。 760伏電泳過(guò)夜。 8取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。 9室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。 10室溫下將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。 1120×SSC洗膠1h。 1220×SSC中過(guò)夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。 13取出硝酸纖維素膜，80真空烘烤2h

35、。 5組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）。組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交，而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對(duì)致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置，對(duì)分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動(dòng)向及病

36、原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。 用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針操作的長(zhǎng)度以100-400nt為宜，過(guò)長(zhǎng)則雜交率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16-30 nt）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長(zhǎng)探針，因此，寡核苷酸探針和不對(duì)稱PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。 探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最為常用，3H標(biāo)記的探針半衰期長(zhǎng)，成像分辨率高，便于定位，缺點(diǎn)是能量低，35S標(biāo)記探針活性較高，影像分辨率也較好，而32P能量過(guò)高，致使產(chǎn)

37、生的影像模糊，不利于確定雜交位點(diǎn)。 原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素。標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對(duì)探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要，去除蛋白質(zhì)的方法是，用0.2mol/L HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水。原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性、穩(wěn)定性上還需進(jìn)一步完善和提高。 6，固相夾心雜交。Dunn等最早介紹了夾心雜交類型，Ranki等又作了進(jìn)一步的改進(jìn)，夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)：（1）樣品不需固定，對(duì)粗制樣品能做出可靠的檢測(cè)；（2）用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強(qiáng)，因?yàn)橹挥袃蓚€(gè)雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。 固相夾心法雜

38、交需要兩個(gè)靠近而又互相重疊的探針，一個(gè)做固相吸附探針，另一個(gè)作標(biāo)記檢測(cè)探針，樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個(gè)探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)，需要注意的是兩探針必須分別亞克隆進(jìn)入兩個(gè)分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號(hào)。 夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)和更容易對(duì)小量樣品進(jìn)行操作。Dahlen等利用微孔板進(jìn)行夾心雜交，可同時(shí)進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，他們先吸附DNA探針加到凹板中，然后用紫外線照射使其固定到塑料板上，用微孔板進(jìn)行夾心雜交還可直接用于PCR技術(shù)。應(yīng)用光敏生物素標(biāo)記探針，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的敏感性和用32P標(biāo)記探針（3×108cpm/g）作16h放射

39、自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點(diǎn)還有可同時(shí)操作多份樣品，加樣、漂洗和讀結(jié)果等步驟可以自動(dòng)化。 7 其它雜交類型 （1）固化探針雜交。該法較少使用，原理是使未標(biāo)記固化探針通過(guò)雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標(biāo)抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合，將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗、加入底物顯色并進(jìn)行測(cè)定，探針濃度為2g/ml,80雜交，可在10-15min完成，檢測(cè)的敏感性為5×106靶序列。 （2）反向雜交：這個(gè)雜交類型是用標(biāo)記的樣品核酸與未標(biāo)記的固化探針DNA雜交，故稱為“反向雜交”。這種雜交方法的優(yōu)點(diǎn)是在一次雜交中，可同時(shí)檢

40、測(cè)樣品中幾種核酸。這種雜交方式主要用于進(jìn)行中的核轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)和多種病原微生物的檢測(cè)，前者是在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中標(biāo)記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標(biāo)記樣品核酸。 8固相膜核酸雜交膜的選用。雜交膜是一種多孔、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面，就可用雜交法進(jìn)行檢測(cè)。最常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射性標(biāo)記探針都很方便，產(chǎn)生的本底淺，與核酸結(jié)合的化學(xué)性不是很清楚，推測(cè)為非共價(jià)鍵結(jié)合，經(jīng)80烤干2h和雜交處理后，核酸仍不會(huì)脫落。硝酸纖維素膜的另一特點(diǎn)是只與蛋白有微弱非特異結(jié)合，這在使用同位素探針中尤為有用。硝酸纖維素膜的缺點(diǎn)是結(jié)合核酸能力的大小取決于轉(zhuǎn)印條件和高濃度鹽（>10&#

41、215;SSC）,與小片核酸(<200bp)結(jié)合不牢，質(zhì)地脆，不易操作。 尼龍膜在某些方面比硝酸纖維素膜好，它的強(qiáng)度大，耐用，可與小至10 bp的片段共價(jià)結(jié)合，在低離子濃度緩沖液等多種條件下，它們都可與DNA單鏈或RNA緊密結(jié)合，且多數(shù)膜不需烘烤。尼龍膜韌性好，可反復(fù)處理與雜交，而不丟失被檢標(biāo)本，它通過(guò)疏水鍵和離子鍵與核酸結(jié)合，結(jié)合力為350-500g/cm2，比硝酸纖維素膜（80-100 g/cm2）強(qiáng)許多。尼龍膜的缺點(diǎn)是對(duì)蛋白有高親合力，不宜使用非同位素探針。 9“噪音”的排除。“噪音”（noise）是固相膜雜交方法常遇到的問(wèn)題，指標(biāo)記DNA結(jié)合到空白膜上的放射性計(jì)數(shù)，即本底。這個(gè)問(wèn)題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴(yán)格的雜交條件，二是選擇合格的雜交反應(yīng)液和對(duì)膜進(jìn)行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著離子強(qiáng)度的增加，空白膜（未固定DNA對(duì)照膜）上的“噪音”水平增加，而在50%甲酰胺-6×SSC的雜交反應(yīng)液中“噪音”最低。目前，最常使用的消除噪音的方法是用Denhardt液與固定膜預(yù)保溫，這樣可以充分封閉膜上的多條非特異結(jié)合位點(diǎn)。 （三）液相核酸分子雜交類型 1、吸附雜交 （1）HAP吸附雜交，羥基