1、第43卷第1期西北農林科技大學學報(自然科學版)Vol.43No.l2015年1月JournalofNorthwestA&FUniversity(Nat.Sci.Ed.)Jan,2015網絡出版時間.2014-12-12O9：3ODOI：10.13207/ki.jnwafu.2015.01.028網絡出版地址.http：/kLnct/kcms/detail/61.1390.S.20111212.0930.028.htm副豬嗜血桿菌平板凝集檢測方法的建立與應用高艷,張定全,楊增岐.梁留存.劉海金.吳朋朋,高小龍.常旭東.杜恩岐(西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌712100)摘要【目的

2、】建立快速檢測副豬嗜血桿菌抗體的平板凝集試驗方法，以便能夠對副豬喑血桿函病進行快速準確的診斷【方法】利用9株(Ea、Ec、Ew、A】、A2、B】、B2、Cl、C2)副豬嗜血桿菌陜西分離株制備平板凝集抗原.用其免疫健康家兔制備血清抗體，建立副豬嗜血桿菌平板凝集檢測方法，對制備抗原的優勢菌株進行篩選.并對該方法的特異性敏感性、抗原最佳工作濃度進行檢測【結果選出Ew株作為制備抗原的種子菌株.成功建立了檢測副豬嗜血桿幽抗體的平板凝集試驗方法；該方法具有良好的特異性和敏感性.抗原最適工作濃度為8X10*CFU/m"采用本試驗建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法對臨床血清樣品的檢測結果與臨床診斷結

3、果基本一致【結論】建立的副豬喧血桿菌平板凝集試驗方法能夠對副豬嗜血桿菌病做出較為快速準確的診斷；陜西省存在副豬嗜血桿茜不同程度的感染.規模豬場集中飼養的豬感染副豬喧血桿菌的比率明顯高于散戶關夜伺副豬嗜血桿菌；抗原制備；平板凝集；抗體檢測中圖分類號S853.31文獻標志碼A文章編號1671-9387(2015)01-0021-05EstablishmentandapplicationofplateagglutinationmethodfordetectingantibodyagainstHaemophilusporasuisGAOYan,ZHANGDing-quan,YANGZeng-qi,LI

4、ANGLiu-cun,LIUHarjin,WUPcng-pcng,GAOXiao-long,CHANGXirdong,DUEirqiofVeterinaryMedicNorthictstA&FUniversityhaanxt712100,C”a)Abstract：Objective】ThisstudyaimedtoestablisharapidmethodfordetectingantibodyofHpsandpreparetheplateagglutinationantigenforthedetectionofserumHpsantibody.Method9Hpsstrains(Ea

5、.Ec.Ew.Al.A2.B1.B2.C1.andC2)storedintheinfectiousdiseaselabwererevivedandscrumantibodiesofimmunizingrabbitswasprepared.ThentheplateagglutinationmethodfordetectingserumHpsantibodywasestablishedandthespecificity,sensitivity,andbestworkingconcentrationweredecided.ResultEwstrainwasselectedasthestrainfor

6、generatingantigen.TheplateagglutinationmethodfordetectingantibodyagainstHaem。philusftarasuiswassuccessfullyestablished,'hemethodhadgoodspecificityandsensitivity.andthesuitableworkingconcentrationofantigenwas8X10CFU/mL.Thetestresultsofclinicalserumsampleswiththeclinicaldiagnosiswerebasicallythesa

7、me,tConclusionTheestablishedTJuTJTJ期目介者日項筒作精金考倍收基作通TJuTJTJ期目介者日項筒作精金考倍收基作通2013-09-13陜西省農業科技創新項目（2011NXC01-1。）高艷（1986-）,女，陜西榆林人.在讀碩士，主荽從事動物傳染病的診斷與防制研究，E-mail：616291725楊增岐（1963_）,男.陜西岐山人.教授.博士.博士生導師.主要從事動物疫病診斷與防制研究E-nuiil：yzql106plateagglutinationmethodofHpsmeasurementdiagnosedGlasser'sdiseasemore

8、rapidlyandaccurately.TheresultsalsoshowedthattheHpsinfectionrateofscalepigfarmwashigherthanthatofscatteredfarmsinShaanxi.Keyw<>rds:Haemophilusparasuis:antigenpreparation：agglutination；antibodydeteciion副豬.血桿畫（HaemophilusparasuisHps）通常寄生于豬的上呼吸道，一般情況下不發病，但在豬群存在其他病原感染以及環境變化等因素的影響下.能夠引發以多發性漿膜炎關節炎腦膜

9、炎支氣管肺炎等為特征的嚴重全身應疾病打臨床上豬鏈球菌胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌沙門菌等可引起與副豬嗜血桿菌病相似的癥狀.且往往與這些菌混合感染豬.所以應特別注意副豬嗜血桿菌病與這些病的鑒別診斷檢測副豬嗜血桿菌病的方法有很多種.如間接血凝抑制試驗法、平板凝集試驗法、瓊脂擴散試驗法、elisa等:刈。但目前國內采用平板凝集試驗法來檢測副豬嗜血桿菌的詳細文獻報道較少本試驗在制備副豬嗜血桿菌平板凝集抗原的基礎上.初步建立了副豬嗜血桿菌平板凝集檢測方法，并用此方法對陜西部分地區豬場的豬進行了副豬嗜血桿菌血清抗體檢測.證明本試驗建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法具有簡便快速經濟、準確等優點.可用于集約化豬

10、場和散養豬副豬嗜血牝菌病的檢疫及流行病學調查Q1材料與方法1.1材料9株副豬嗜血桿菌（Ea、Ec、Ew、Al、A2、Bl、B2、C1、C2株），由西北農林科技大學動物醫學院傳染病實驗室從陜西省關中地區患多發性漿膜炎和關節炎豬場中分離鑒定和保存豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌陽性血清豬鏈球菌陽性血清副豬嗜血桿菌標準陽性血清.括由西北農林科技大'學動物醫學院傳染病實驗室提供：其他血清是2oi2-2O13年期間.采集自陜西部分豬場和散養戶ifkg/只左右的健康家兔.購自西北農林科技大學實驗動物中心1.2方法1.2.1副豬嗜血桿菌的復蘇與擴大培養從冰箱中取出凍存的副豬喑血桿菌菌液.在38p左右水浴中快

11、速使其復蘇，將復蘇菌液移至TSA固體培養基上，37°C培養2436h,觀察菌落形態并進行鑒定參考文獻中的方法并加以改進.將復蘇鑒定好的菌株移至TSA固體培養基上進行培養.連續傳23代復壯后制備抗原1.2.2免疫陽性血清與陰性血清的制備用制備好的副豬嗜血桿菌抗原與氫氧化鋁佐劑按照體積比1:1混合.背部皮下多點注射免疫健康家兔.每個點注射500pL.共免疫3次.每次8X109CFU/mL。一免以后間藺7d進行二免.二免后間隔7d進行三免.三免后7d無菌心臟采血.分離血清.小量分裝.置-20p保存備用采集無副豬嗜血桿菌感染的健康家兔血清.作為陰性血清.置_2op保存備用1.2.3副豬瞎血桿

12、菌平板凝集檢測方法的建立按照平板凝集試驗方法.取1塊潔凈的玻璃板.垂直滴加制備好的抗原和血清各50.用火柴棒充分混句.室溫放置35min.觀察藥果同時.用生理鹽水設立對照1.2.4可靠性試驗以9株副豬嗜血桿菌為抗原.用系試驗建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法.檢測134份豬割豬嗜血桿菌標準陽性血清和50份標準陰性血清.記錄結果1.2.5優勢抗原菌株的篩選以9株副豬嗜血桿菌易抗原.用本試驗建立的平板凝集試驗方法檢測276份血清.根據抗原與檢測血清出現凝集反應程度的不同.篩選出制備抗原的最佳菌株試驗檢測的？76份血清中142份是20122013年期間采集自詭西省的一些發希豬場神家某豬場95份、扶風

13、某豬場32份、寶雞某豬場15份），另外134份陽性血清由傳染箱實驗室采集并檢測O1.2.6抗原最佳工作濃度的確定用0.5%的無菌石炭酸生理鹽水調整副豬嗜血桿菌抗原為ix1019X108X107X10%6X105X104X10,和3X109CFU/mL8個梯度.用此8個梯度的副豬嗜血桿菌抗原測定免疫兔血清中副豬嗜血桿菌抗體.以確定抗原的最佳工作濃度1.2.7特異性試驗以Ew株副豬嗜血桿菌為抗原.用本試驗建立的平板凝集試驗方法檢測制備好的兔副豬嗜血桿菌免疫陽性血清30份、兔陰性血清30份、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌陽性血清30份、豬鏈凌菌陽性血清30份.同時用生理鹽水設立打照1.2.8副豬嗜血桿菌平

14、板凝集試驗對臨床樣品的檢測試驗檢測的血清是2012-2013年期間.采集自陜西省的一些豬場和散養戶.共282份.其中扶風某豬場32份、寶雞某豬場15勉縣某豬場14份、華縣某豬場18份、神木縣某商品豬場95份、神木某種豬場（1）20份、箱木縣某種豬場（2）38份;神木縣散養戶豬場50份所有采血豬均未進行副豬嗜血桿菌病疫苗免疫用本試驗建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法檢測采集血清樣.并結合臨床診斷結果判斷副豬嗜血桿菌病的流行情況2結果與分析2.1副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法的可靠性9株副豬嗜血桿菌抗原與陽性血清凝集反應率達96.3%100.0%（表1）.與陰性血清的凝集反應率為0說明本試驗制備的副

15、豬嗜血桿菌抗原及建立的平板凝集試驗方法可堂且具有很強的實用性Q表1副豬嗜血桿菌平板凝集抗原與豬陽性血清凝集試驗結果Table1AgglutinationbetweenplateagglutinationantigenofHpsandswinepositiveserum抗知Antigen供試陽性血消Testedpositiveserum性政Detectionofpositive陽性*/%PositiverateEa13413298.5Ec13413399.3Ew134134100.0Al13413097.0A213413298.5Bl13413097.0IJ213413197.7Cl134129

16、96.3C213413399.32.2制備副豬嗜血抗原優勢菌株的篩選由表2可以看出，本試驗制備的副豬嗜血桿菌抗體基本可檢測出陜西地區副豬嗜血桿菌流行株：Ew株較其他菌株抗原與陽性血清反應的凝集程度強，其次為日/株.其他菌株反應凝集情況基本相同表明Ew菌泰具有較強的凝集反應性.可作為今后制備副豬嗜血桿菌抗體和弱毒苗的備選菌株表2制備副豬嗜血桿菌抗原優勢菌株的篩選Table2ScreeningadvantagestrainsforantigenpreparationofHps血清來源Serumsource血清份敬Serumcopies檢浦陽性PositivenumberEaEcEw陽性率/%Pos

17、itiverate1Positivenumber陽任率，PositiveratePositivenumberPH任率/%Positiverate神木臬豬場AswinefarminSbcnmu957781.17174.79296.8扶風某貓場AswinefarminFufeng322165.61959.42578.1寶雞某豬場AswinefarminBaoji151386.71280.01386.7陜西其他地方OtherareasinShaanxi13413298.513399.3134100.0血清來源血清份數AlA2Bl陽性率檢卸陽性數陽性率r檢測陽性數陽性率rvruiiisourceOVI

18、UlllcopiesPositivePositivePositivePositivePositivePositivenumberratenumberratenumberrate神木臬豬場AswinefarminSlienmu9576807376.87073.7扶風某豬場AswinefarminFufeng3216501856.31546.9寶說某豬場AswinefarminBaoji1512801280.01173.3陜西其他地方OtherareasinShaanxi1341309713298.513097.0血清來源血清份致B2ClC2ScrumScrumHIMWEEMPUli弟檢測陽性數陽

19、性率/%sourcecopiesPositivePositivePositivePositivePositivePositivenumberratenumberratenumberrate押木某稿場AswinefarmofShenmu956669.57376.87275.8扶風某豬場AswinefarmofFufeng321753.11856.31959.4室珥某貓場AswinefarmofIlaoji151280.01066.71386.7陜西其他地方OtherareasinShaanxi13413199.212997.713399.32.3副豬嗜血桿菌抗原最佳工作濃度的確定函陽性血清4倍稀

20、釋.抗原濃度為8X10,CFU/mL平板凝集試驗結果（表3）表明.兔副豬嗜血桿時.抗原與血清凝集現象最明顯.液體完全透明.凝集顆粒物大如沙粒.因而確定抗原的最適工作濃度為8X109CFU/mL。表3副豬嗜血桿菌抗原最佳工作濃度的確定Table3DeterminationofthemostsuitableconcentrationofdetectionofHpsantigen注廣+”.液體完全透明.凝集鞭粒物如大沙粒“+”.出現較多的凝集顆粒物.液體幾乎完全透明.即75%凝集：+”有沙慶原濃«/(CFUmL-i)Concentration-ofantigen血清得U倍敷Serumdil

21、utiontimes1248163264IXIO10+H卜+9X10»+8X109+7X10»+6X10*+5X10，+/4X10*+3X109粒狀凝集顆粒物,液體不完全透明,即50%凝集廣+-.液體混濁.有較少的小的穎敦狀物.即25%我集廣一”.液體均勾混濁.無凝集物樣進行檢測.結果見表4。結合表4結果及發病情況可知：（1）檢測出為陽性血清的豬.臨床表現為被毛粗亂:消瘦體溫升高關節腫脹呼吸困難：剖檢可觀察釧胸腔內纖維素性滲出嚴重.肺與胸腔壁黏連.胸腹腔積液較多.出現典型的絨毛心.脾臟梗死.肝臟有大量的出血班等典型的副豬嗜血桿菌臨床癥狀檢測結果與病豬剖檢結果相符.表明試驗結

22、果可寶進一步證明.建立的副豬嗜血桿菌平板凝集樣進行檢測.結果見表4。結合表4結果及發病情況可知：（1）檢測出為陽性血清的豬.臨床表現為被毛粗亂:消瘦體溫升高關節腫脹呼吸困難：剖檢可觀察釧胸腔內纖維素性滲出嚴重.肺與胸腔壁黏連.胸腹腔積液較多.出現典型的絨毛心.脾臟梗死.肝臟有大量的出血班等典型的副豬嗜血桿菌臨床癥狀檢測結果與病豬剖檢結果相符.表明試驗結果可寶進一步證明.建立的副豬嗜血桿菌平板凝集Note：*+*.Liquidiscompletelytransparent«aggregationofpartidessuchaslargesand；"+"Appeari

23、ngmoreMggregAtedparti-cles*liquidiscompletelytransparentwith75%agglutination；*+Agglutinationparticlessuchassandgranular*theliquidisnotcompletelytransparentwith50%agglutinationLiquidisturbid«therearefewersmallpelletswith25%agglutination*HLiquidiscvcnlvturbid*noaggregate.2.4副豬晴血桿菌平板凝集試驗方法的特異性特異性試

24、驗結果表明.兔陰性血清對騰組豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌陽性血清和豬鏈球菌陽性血清無凝集現象：兔副豬嗜血桿菌陽性血清試驗組100%凝集.說明副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法具有良好的特異性2.5副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法對臨床樣品的檢測試驗方法具有較強的臨床實用性表4陜西豬場Hps血清抗體檢測結果對7個豬場和神木縣部分散養戶的282份血清Table4DetectionresultsofantibodyofHpsinShaanxiswinefarms血清來源血清份數檢測陽性致可野陰性敷陽性率SerumsourceScrumcopiesPositivenumber詈，NegativenumberPosi

25、tiverate扶風某56場AswinefarminFufeng32250778.1寶雞某貓場AswinefarminBaoji15131186.7勉縣某貓場aswinefarminMianxian1491464.3華*®某貓場AswinefarminHuaxian18151283.3神木縣某商品豬場AbusinessswinefarminShe!)mu95922197.0神木縣某稗貓場（1）OAAAOAAApigbreedingfarminShenmuVuLJU神木縣某種豬場（2）ooAAQQAApigbreedingfarminShenmuoouOOu神木縣散養戶豬場Scatte

26、redfarmsinSlienmu5032456.0總計Total28215712113（2）供檢豬場均有副豬嗜血桿菌檢出.其中關中3個豬場（扶風某豬場、寶雞某豬場和華縣某豬場）平均陽性檢出率為81.5%，陜南1個豬場（勉縣某豬場）陽性檢出率為64.3%.陜北神木縣3個豬場的平均陽性率達到60.1%。表明陜西已有副豬嗜血桿菌病流行.且流行覆蓋面較廣（3）發病季節多集中在秋冬、冬春冷熱交替的季節，說明副豬嗜血桿菌病在秋冬冬春冷熱交替的季節較其他時間更容易發生另外.檢測血清多為3170日齡保育舍發病豬.表明410周齡豬更容易感染此病（4）神木縣散養戶豬場的50份血清中陽性血清3份.陽性率為6.0%

27、；3個豬場的153份血清.檢出副豬嗜血桿菌陽性血清92份.陽性檢出率為6o.i%。此結果表明.副豬嗜血桿菌病在散養戶豬場的發病率明顯低于集約化豬場因此，要求集中飼養的豬場在管理與疫病防控方面更要重視.以避免副豬嗜血桿菌的規模集中感染©3討論檢測副豬嗜血桿菌的方法很多，如用滅活的副豬嗜血桿菌菌體作為包被抗原的eusA法、補體結合試驗以及多聚的鏈式反應（p（、r）條等W。；.另外.林雪玲等小還建立了副豬嗜血桿菌的快速聚合酶鏈式反應診斷技術.可對該病作出迅速的診斷這些方法具有較強特異性和較高敏感性.但檢測成本較高本試驗采用平板凝集試驗法檢測副豬嗜血桿菌血清抗體,雖然與上述幾種方法相比.特異

28、性和敏感性稍差.但操作簡便快捷易掌握成本低.可對該病作出快速的診斷本試或所用菌祿是由西北農林科技大學動物醫學院傳染病實驗室從陜西關中地區豬場中分離得到.是陜西地區流行的菌株本試驗制備的抗原可檢測出陜西地區副豬嗜血桿菌陽性血清.可用于區別感染豬與非感染豬.也可用于陜西地區豬場副豬瞎血桿菌臨床快速診斷和流行病學調查通過對陜西地區一些豬場及散養戶豬的血清抗體檢測.了解和掌握了陜西地區副豬嗜血桿菌病的流行情況.對陜西地區該病的預防和控制有一定的指導價值本研究結果顯示.副豬嗜血桿菌病巳成為陜西地區普遍流行的疾病.應提高警惕.加強防治管理此外.規模豬場集中飼養的豬感染Hps的比率明顯高于散戶.說明集中飼養

29、更容易造成豬的成批感染；另外.從采樣豬發病的時間可以看出.該病在秋冬冬春等冷熱交替的季節更容易發生因此，氣候變化時.豬場更應該注意加強飼養管理:閔。豬場可利用“二點三點法，飼喂，即將豬場分散在不同的地點按照豬成長階段分批分群飼養在不同的.地點.以避免疫病的交叉感染心。具體操作方法為：哺乳仔豬在21d前斷乳.然后將其轉移飼養到另外一個生產區并對該生產區徹底消毒保持豬舍干凈清潔.以減少病原微生物.使仔豬處于較好的環境中生長發育.而且此時仔豬體內的特殊疾病免疫抗體還沒有完全消失具有較好的抵抗力Q參考文獻】陳申秒，魏建忠.副豬嗜血桿苗病的研究進展口養豬，2007(4)：52-54.ChenSM.Wei

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