1、文獻速覽人偏肺病毒疫苗研究最新進展人偏肺病毒(Humanmetapneumovirus,hMPV)和它相近的同病毒科成員呼吸道合胞病毒一樣，是兒童下呼吸道感染的主要病因。hMPV也是世界范圍內引起免疫功能低下者和老年人發病及死亡的常見原因。感染的反復發生也加重了醫療負擔。然而，目前并沒有針對hMPV的特異性預防措施。本文著重概述目前關于闡述hMPV疫苗的研究進展的文獻。我們認為對宿主應答中病毒蛋白的作用更好的認識有利于有效預防性疫苗的研發。1人偏肺病毒hMPV是一種負義單鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科，該科還包括了呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)和副流

2、感病毒°hMPV在2001年被發現不久,就很快被認為是幼兒、免疫功能低下者和老年人下呼吸道感染的常見病因。雖然hMPV是重要的臨床病原體，但目前卻沒有疫苗。hMPV包含兩個基因群體：A和每個基因群體乂有兩個基因亞群，分別是A1和A2.B1和B2。目前,hMPV共有5個當代流行病毒株，它們已經存在了數十年°hMPV的反基因組包括表達病毒蛋白的九個開放閱讀框：3'NPMFM2-1-M2-2-SH-G-L-5，。其中核蛋白N,磷蛋白P和大蛋白L是RNA合成所必需的。RNA合成由兩個獨立的過程組成:病毒復制和基因轉錄。首先由蛋白L和蛋白P組成的RNA依賴性病毒RNA聚合酶(

3、RdRp)結合在N.殼體化基因組的前導區，然后通過識別起始和終止信號沿病毒基因的一側依次轉錄每段基因。在合成階段mRNA被帽化和聚腺苜酸化。當有足夠的核蛋白來殼化反基因組和基因組時，復制開始。首先負鏈基因復制成正鏈反基因，然后正鏈反基因作為模板復制成病毒基因的多個拷貝。除了蛋白P和L,M2.2蛋白對病毒RNA合成也是重要的。與RSV的M2.2蛋白一樣，從病毒基因的轉錄到病毒基因的復制過程中，hMPV的M2-2蛋白是否是病毒RNA聚合酶開關的關鍵調節因子仍存在爭議。磷蛋白P、糖蛋白G、疏水蛋白SH和M2.2蛋白都顯示出調節宿主免疫應答的作用。分別缺乏或組合缺乏G、SH和M.2的重組hMPVs以及

4、用禽類病毒蛋白P替換人類病毒蛋白P的重組hMPVs都是減毒的。融合蛋白F對hMPV的入侵是必要的，并且還能誘導強的體液免疫反應。在本文概述中，討論了基于上述蛋白功能的hMPV疫苗研發的現狀和進展。2滅活疫苗福爾馬林滅活流感疫苗因其優良的穩定性，易于規模生產，無病毒復制方面的生物安全性等原因，通常被用來進行大規模免疫接種。然而，福爾馬林滅活的人RSV疫苗(Formalin-inactivatedhumanRSVvaccine,FI-hRSV)接種會導致自然感染后疾病加重。疾病加重可能因為：(1)Th2型的T細胞記憶應答；(2)甲醛過敏;和/或(3)產生未成熟抗體及其對自然感染hRSV表位的輕微識

5、別。最近有報道說RSV糖蛋白G肽鏈接種后FI-hRSV接種引起的疾病加重減少了，這說明抗RSVG蛋白的特異性抗體對RSV傳染病控制是至關重要的。同樣，在實撿動物接種福爾馬林滅活hMPV后也出現與疫苗相關聯的肺部疾病加重和hMPV感染后的Th2應答。這說明福爾馬林滅活hMPV不是一個合適的候選疫苗。研究用其他的滅活方式來研發安全疫苗。例如，用納米乳劑輔佐的滅活RSV也顯示出可以誘導產生持久的RSV特異性體液免疫應答，可以降低黏液的產生，增加病毒的去除,同時沒有伴隨Th2免疫介導的病理作用。同時，疫苗接種小鼠呈現出加強的Thl/Thl7應答。雖然納米乳劑輔佐的滅活RSV候選疫苗仍需要進一步研究，但

6、是如果納米乳劑滅活hMPV具有免疫原性和保護性且有平衡的免疫應答,那么納米乳劑就可以應用到hMPV。3病毒蛋白疫苗亞單位疫苗是一種經過純化的、通過全基因序列或部分基因序列表達而成的病毒蛋白。這種疫苗經常以VLP、納米顆粒或輔以免疫增強佐劑的形式存在。在副黏科病毒中具有最優的免疫原性的蛋白是融合蛋白F。例如，種與hMPV相近的同家族成員RSV,由Novavax以其F蛋白研發的納米顆粒疫苗正在進行U期臨床的評估c近年來，一些利用hMPV蛋白研發的亞單位候選疫帶正在進行動物試驗。以逆轉錄病毒的核心顆粒作為載體，腹腔注射hMPVF蛋白能夠引起抗同源和異源病毒株強烈的體液免疫應答。此外，誘導的中和抗體能

7、降低隨后因肺部感染同源和異源病毒株而導致的死亡率,而接種hMPV糖蛋白G后卻不能引起中和活性。在以w病毒復制子和3型副流感病毒(Parainfluenzavirustype3,PIV3)為載體的hMPVF蛋白疫苗也存在類似的結果。研究表明,動物肌肉注射含有佐劑的可溶性hMPVF蛋白能夠引起體液免疫應答，但這種應答會隨著時間很快消失。最近，Williams團隊研究表明，用懸浮培養的人胚腎上皮細胞(293-F)表達基質蛋白(M)和F蛋白形成hMPVVLPs,它提供的免疫保護能夠抑制hMPV在小鼠肺部的復制，而這種保護與Th2失衡的細胞因子無關。小鼠免疫接種F-M-VLPs能夠增強F蛋白特異性抗體應

8、答和增加識別F蛋白表位的CD8+T細胞。通過添加TiterMaxGold佐劑或a-半乳糖神經酰胺佐劑來加強VLP誘導的中和抗體應答。以上結果表明，融合蛋白疫苗是hMPV疫苗研發的一個潛在候選者。其他用于蛋白疫苗研發的hMPV蛋白還有P蛋白和G蛋白。重組桿菌Calmette.Guerin(一種能夠促進抗其他細菌、寄生蟲和病原體抗原免疫應答的載體)表達的hMPVP蛋白賦予了CD4'和CD8*T細胞強大的表型效應，其表現出的hMPV保護性免疫力與動物的主動免疫相當。然而，也有團隊研究表明hMPVG亞單位蛋白不能夠誘導保護性抗體應答，說明hMPVG蛋白對病毒的免疫原性不重要。對缺乏G蛋白的重組

9、hMPV(rhMPV-AG)的研究發現G蛋白在誘導保護性免疫應答方面起重要作用。盡管G蛋白在免疫原性上扮演的角色仍存在爭議,但是在單蛋白免疫過程中，導致G蛋白出現不良的免疫原性有幾種可能性:一種可能性是像之前研究的RSVF蛋白一樣,在單蛋白免疫過程中，hMPVG蛋白在基因和/或蛋白質水平上經過了某些修飾;另一種可能性是與F蛋白相比，相同的載體攜帶G蛋白的能力降低。總之,G蛋白是否具有良好的免疫原性仍需繼續研究闡明。用以hMPVF蛋白為基礎的亞單位疫苗進行免疫接種是有前途的，但是疫苗的接種途徑和載體類型的組合形式以及為了誘導更加持久和有效的免疫效力所需要F蛋白的長度仍需更多的實驗來確定。由于hM

10、PV其他蛋白在免疫原性和免疫平衡方面仍有重要作用，因此，需要更多研究來闡明亞單位疫苗免疫接種對Thl/Th2/Thl7平衡的影響。4減毒活疫苗減毒活疫苗可以分為兩類:非重組和重組疫苗。非重組減毒病毒通常通過自然突變以及病毒在細胞上傳代過程中由于添加或去除實驗壓力導致的缺失來產生，實驗壓力包括比如化學突變劑和低溫傳代等。非重組減毒活疫苗主要的風險是病毒毒力逆轉和病毒致病性恢復進而引起疾病。一些非重組RSV減毒活疫苗在進行臨床試驗評價，但顯示出一些副反應和減毒不充分的情況。最近研制出溫度敏感型hMPV病毒株，免疫倉鼠后顯示出保護性免疫應答。重組減毒活病毒通過細胞轉染hMPVcDNA基因組獲得,進行

11、或不進行基因修飾或基因剔除，用質粒編碼組成RdPp復合體的每一個必須蛋白。重組減毒hMPV病毒株已經通過剔除特定附屬基因的方法獲得。分別是rhMPV-AG,缺乏G和SH的重組hMPV(rhMPV-AG/SII),缺乏M2-2的重組hMPV(rhMPV-AM2-2)o在感染的倉鼠中，相比rhMPV野毒株感染,rhMPV-AG和rhMPV-AG/SH在下呼吸道和上呼吸道分別抑制了至少40倍和600倍的病毒復制。然而在嚙齒類動物模型中，相比rhMPV野毒株，缺乏SH的重組hMPV(rhMPVASH)有時能更有效地感染倉鼠肺部，這說明SH對于病毒體內感染完全沒必要，它的剔除沒有減毒效果。在感染的非洲綠

12、猴中，突變的rhMPV-AM2-2相比rhMPV-AG達到了一個更高的水平，并且誘導了可比擬的免疫原性和保護效力。還有另一種減毒重組hMPV,它的P蛋白被禽類MPV的P蛋白(rhMPV-Pavian)取代。最近，在人感染實驗中發現一個重組的hMPV野毒株適合做hMPV減毒活疫苗候選株的母本病毒。雖然rhMPV-Pavian對健康成人的感染力比較弱，但是rhMPV-Pavian這種弱感染力的機制以及是否其他重組減毒病毒對人有相似感染的問題需要將來進一步的研究。5未來設計疫苗需要考慮的其他因素雖然F蛋白被認為是決定hMPV免疫原性的一個主要因素，但是識別能激活保護性細胞毒性T淋巴細胞(Cytoto

13、nicT-lymphocytes,CTL)和體液免疫的病毒抗原對制定成功的疫苗接種策略來說還是必要的。已經證明幾個CTL的肽段在對hMPV感染后的CD8+CTL應答中起作用。這些肽段是H-2b小鼠的N蛋白VGALIFTKL172,H-2d小鼠的M2-2蛋白CYLEINIEII64,HLA-A*0201轉基因小鼠的SH蛋白KLILALLTFL44和G蛋白32SLILIGTTTL4io小鼠免疫接種hMPVCTL表位肽后，上調了hMPV攻擊小鼠的肺部和支氣管淋巴結的Thl型細胞因子的表達，進而降低了小鼠模型的病毒滴度和疾病的發生。最近,hMPVH-2d的顯性和次顯性表位被發現和鑒別出來。在12個選擇

14、的預測表位中，M2.l蛋白白勺幻GYIDDNQSI'9和村蛋白白勺3°7spkaGLLSI?”認為是首次感染時H-2h的顯性和次顯性表位。另外，還發現了第二次、第三次感染后記憶性CTL應答中H-2d限制性表位的多樣性，包括對抗M2-2蛋白的"CYLENIEII64的記憶性CTL應答的次顯性作用。通過減毒活病毒rhMPV全基因刪除而導致的表位缺陷會降低rhMPV誘導免疫原性的能力，這說明CTL表位免疫原性的重要性。為了延長以F蛋白為基礎的疫苗接種的免疫原性或加強刪除突變rhMPV的免疫原性,對宿主同時接種包含CTL表位的肽段可能是一個好的選擇。由于N蛋白和M2-2蛋白

15、的抗原表位完全保守，所以CTL表位疫苗提供的保護有望覆蓋兩種hMPV病毒株°對抗病毒信號調節中的關鍵病毒蛋白的識別對疫苗設計來說也是至關重要的。最近,識別了一些病毒蛋白,比如G和M2.2蛋白，它們在抑制宿主的自然免疫力方面起重要角色。我們和其他研究者都發現M2.2蛋白是一個具有多種功能的蛋白。它不僅調節病毒基因轉錄和病毒RNA復制,而且還包含一個CTL表位以及維甲酸誘導基因I和Toll樣受體的靶向中心配體。此外,M2.2蛋白也在調節miRNAs表達方面起重要角色，其中某些miR-NAs對免疫相關基因的表達起重要作用。對于多功能病毒蛋白來說,就更需要識別它們的功能區，因為這對合理設計重

16、組減毒活病毒來說很重要。最近,我們也識別了M2-2蛋白中負責抑制抗病毒信號的基序。所有這些關于M22的信息或許可以給以M2.2為基礎的候選減毒活疫苗的設計提供一個基礎信息。例如，包含以下突變的突變體：（l）M2.2，s病毒復制區域，可用作復制突變；（2）為了加強免疫原性，用蛋白的交互序列終止M22s對抗病毒信號的抑制。另一方面，為了盡可能減少病毒其他蛋白突變的概率，防止打破Thl/Th2平衡以及保持CTL表位的原始免疫原性，對病毒基因轉錄起重要作用的區域不應該被修改。總之，解析病毒蛋白的功能區域對疫苗研發是大有益處的。6討論一個有效的理想候選疫苗應該是安全的，能比自然hMPV感染誘導出更強的免疫力和保護力，而自然hMPV感染只能引起不完全的免疫保護。研究發現FI-hMPV免疫接種棉鼠會加重動物感染hMPV后其肺部的病理變化，除此以外,FI-hMPV仍是一個有希望的候選疫苗。亞單位疫苗看似僅能對初次感染誘導出短期保護性應答。然而，亞單位疫苗卻可能利于增強曾暴露于hMPV個體的免疫應答。此外,亞單位疫苗有希望給早產兒、免疫功能低下者和老年人等高風險群體提供一個持續一定時間的安全有效的保護,特別是以非感染載體的形式接種。目前