1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上touhun本科學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告僅供參考責(zé)任自負(fù)學(xué)號(hào) 姓 名 孫 永 升 學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 專(zhuān)業(yè)、班級(jí) 10生物技術(shù) 實(shí)驗(yàn)課程名稱(chēng) 酶 工 程 教師及職稱(chēng) 李 俊 俊 開(kāi)課學(xué)期 2012 至 2013 學(xué)年 第二學(xué)期 填報(bào)時(shí)間 2013 年 5 月 29 日 云南師范大學(xué)教務(wù)處編印實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)實(shí)驗(yàn)方式小組成員實(shí)驗(yàn)六 纖維素酶的固定化及其性質(zhì)測(cè)定小組合作XXXXXXXX1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1了解酶制劑的固定化方法；1.2 學(xué)會(huì)固定化酶酶學(xué)特性的測(cè)定方法。 2、 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和溶液：2.1 儀器：紫外分光光度計(jì)、比色皿（3個(gè)）、恒溫水浴鍋、試管架（1個(gè)）、l移液管、洗耳球、注射

2、器、標(biāo)簽（若干）等。2 .2 試劑和溶液2 .2.1 檸檬酸鈣緩沖液，0.05mol/L，pH4.8;2 .2.2 10mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液）;2 .2.3 DNS試劑（CMCA-DNS）;2 .2.4 稀釋到200倍的纖維素酶液;2 .2.5 2.5%、3.5%、4.5%、 5.5%的海藻酸鈣溶液;2 .2.6 2%的CaCl2溶液。3、實(shí)驗(yàn)原理或裝置示意圖：3.1 酶的固定化 把游離的水溶性酶限制在某一局部空間或固體載體上，酶固定后既不會(huì)流失，也不會(huì)污染產(chǎn)品，而且穩(wěn)定性得到提高可長(zhǎng)期反復(fù)使用。3.2 最常用的固定化方法是包埋法。3.3 海藻酸鈣包埋法：通常是在其鈣鹽溶液中

3、加入二價(jià)離子（如Ca2+），通過(guò)Ca2+取代Na+來(lái)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。4、實(shí)驗(yàn)方法步驟、操作流程及注意事項(xiàng)：4 .1 實(shí)驗(yàn)方法：（一）酶液的準(zhǔn)備（二）纖維素酶的固定化（三）固定化纖維素酶性質(zhì)的測(cè)定4 .2 實(shí)驗(yàn)操作步驟：1、將預(yù)先準(zhǔn)備好的200倍纖維素酶液酶準(zhǔn)確稀釋?zhuān)汗潭ɑ赶♂尩?000倍，測(cè)游離酶稀釋到10000倍待用。2、纖維素酶的固定化：各取四瓶200mlCaCl2溶液于500ml三角瓶中待用。各取30ml不同濃度（2.5%、3.5%、4.5%、5.5%）的海藻酸鈣于50ml小燒杯中，并分別取取稀釋到1000倍的纖維素酶液10ml加入不同濃度的海藻酸鈣溶液中，混合均勻。3、用注射器將上述混

4、合液取20ml（各取四次）逐漸滴入200mlCaCl2溶液的三角瓶中 靜止冷卻20min后,經(jīng)固定化的小球紗布過(guò)濾晾干待用。4、準(zhǔn)確稱(chēng)取各個(gè)濃度制成的海藻酸鈣纖維素酶0.5g固定化小球，游離酶量取0.5ml，60預(yù)熱10min。5、準(zhǔn)確計(jì)時(shí)后，于保溫后的酶液中依次加如CMC-Na溶液2.00mL振蕩混勻，在50水浴中繼續(xù)保溫30min（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）。（固定化酶對(duì)照中不加入底物、游離酶對(duì)照中先不加入酶液）6、反應(yīng)混合物物保溫 30min后，于各個(gè)濃度底物試管中加入3mLDNS試劑終止液，迅速振蕩均勻。（1）于游離酶對(duì)照中加入0.5 ml 的酶液。（2）于固定化酶對(duì)照中加入2.00mLCMC-Na溶

5、液。7、混合后將各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的三支試管沸水浴5min，自來(lái)水冷卻后，加蒸餾水19.5mL。搖勻，在540nm處讀取OD值。8、固定化酶與游離酶穩(wěn)定性比較（操作按上面所述）：將得到的固定化纖維素酶（海藻酸鈣濃度為3.5%）與等量的游離纖維素酶分別在60下保溫10min、20min、30min、40min、50min，保溫后按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行酶活測(cè)定（分別做三個(gè)平行）。9、海藻酸鈣濃度對(duì)酶活性的影響：分別用2.5%、3.5%、4.5%和5.5%的海藻酸鈣濃度來(lái)固定化酶，并分別測(cè)定固定化酶的活性（分別做三個(gè)平行）。4.3 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)本實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)在測(cè)定中盡量減少操作錯(cuò)誤：應(yīng)熟知流程、步驟。另：實(shí)驗(yàn)所測(cè)定內(nèi)

6、容較多，因此應(yīng)小組分工合作配合完成。注意以下事項(xiàng)：酶液準(zhǔn)確稀釋。移液管使用時(shí)量取精準(zhǔn)，保證結(jié)果可靠準(zhǔn)確。試管上編號(hào)：貼上用圓珠筆寫(xiě)上編號(hào)的膠布，以防止保溫或沸水加熱時(shí)脫落；在纖維素酶固定化測(cè)定中是底物加入酶液：空白對(duì)照先不加底物，游離酶測(cè)定中空白對(duì)照先不加酶液。精確記時(shí)：每一管加入酶液的時(shí)間要做記錄，每管之間間隔的時(shí)間要合理；避免試管進(jìn)水：煮沸和用流水沖洗時(shí)；5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理：5.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果：表一 固定化酶（3.5%）與游離酶穩(wěn)定性的比較保溫時(shí)間（min）吸光度OD540、酶活 （u/g）、相對(duì)酶活(%) 固定化纖維素酶酶游離纖維素酶酶 10 0.0375 639.04 33.63

7、 0.0585 7586.50 65.23 20 0.2590 1900.61 100.00 0.0695 8213.01 70.62 30 0.1965 1544.64 81.27 0.0805 8839.53 76.00 40 0.1373 1207.46 63.53 0.1295 11630.36 100.0050 0.0570 653.46 34.38 0.0755 6008.00 51.66注：固定化酶所用源酶液稀釋1000，相對(duì)酶活以1900.61 u/g為100%計(jì)算；游離酶10000倍，相對(duì)酶活以11630.36u/g為100%計(jì)算.表二 不同海藻酸鈣濃度的固定化酶的活性海藻酸

8、鈣濃度（%） 吸光度OD540 固定化纖維素酶活（u/g） 相對(duì)酶活（%） 2.5 0.0295 593.48 63.853.5 0.0885 929.52 100.004.5 0.0390 741.15 79.735.5 0.0297 601.59 64.72注：相對(duì)酶活以本組測(cè)定酶活最高929.52 u/g為100%計(jì)算.5.2結(jié)果處理經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件作圖分析結(jié)果如下：5.2.1 固定化酶（3.5%）與游離酶酶活穩(wěn)定性的比較如圖一、二、三：圖一 圖二 圖三5.2.2不同海藻酸鈣濃度固定化酶的纖維素酶相對(duì)活性如圖四： 圖四結(jié)果：酶活(相對(duì)酶活)比較：固定化酶（3.5%）與游離酶酶活穩(wěn)定性由圖一、二

9、、三可以看 出：海藻酸鈣（3.5%）所制成的纖維素固定化酶相對(duì)活性隨反應(yīng)時(shí)間的增加在20min時(shí)到達(dá)最大100%，后逐漸減小。曲線在30min時(shí)與游離纖維素酶曲線有一個(gè)交點(diǎn)：時(shí)間增加固定化酶活性降低，40min時(shí)，纖維素游離酶活性達(dá)最大相對(duì)活性：100%，之后減低，酶相對(duì)活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于固定化酶相對(duì)活性。酶穩(wěn)定性比較：由圖三可看出在反應(yīng)30min以后，游離酶的酶活穩(wěn)定性保持升高 到40min達(dá)最大酶活，之后酶活（相對(duì)活性）急劇下降（曲線斜率較陡曲）；而固定化纖維素酶的酶活從20min后保持平緩的下降趨勢(shì)（斜率較緩），即穩(wěn)定性較高。不同濃度的海藻酸鈣對(duì)固定化酶性質(zhì)影響：隨著海藻酸鈣的濃度由：2.5%

10、、3.5%、4.5%、5.5%升高，呈現(xiàn)增后減的趨勢(shì)，固定化纖維素酶酶活性在3.5% 達(dá)最大相對(duì)酶活性100%。 6、 分析與討論：酶的固定化是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi),仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)利用的一類(lèi)技術(shù)。與游離酶相比,固定化酶在保持其高效專(zhuān)一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí),又克服了游離酶的不足之處,呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡(jiǎn)便等一系列優(yōu)點(diǎn)。固定化酶的制備方法有物理法和化學(xué)法兩大類(lèi)。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。優(yōu)點(diǎn)在于酶不參加化學(xué)反應(yīng),整體結(jié)構(gòu)保持不變,酶的催化活性得到很好保留。實(shí)驗(yàn)中所采用的時(shí)物理包埋法，采用海藻酸

11、鈣介質(zhì)包埋纖維素酶制成固定化纖維素酶。（一）纖維素固定化酶與游離酶活性比較初步得出結(jié)論：3.5%海藻酸鈣固定所制得的酶到最大反應(yīng)時(shí)其反應(yīng)時(shí)間（20min）明顯短于游離酶的反應(yīng)時(shí)間(40min);反映出固定化酶的優(yōu)勢(shì)之一。（二）在探索不同海藻酸鈣濃度對(duì)固定化纖維素酶活性影響中，可以看到隨濃度的增加酶相對(duì)活性先增后減在3.5%時(shí)最大。由此我們初步確定海藻酸鈣固定纖維素酶的最適濃度。 （三）有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)固定化后纖維素酶的活性降低，但固定化酶的增加穩(wěn)定性（溫度60，不同時(shí)間）與游離酶相比較增加。對(duì)于固定化酶活性受各種因素所影響：海藻酸鈣的濃度、氯化鈣的濃度、纖維素酶用量、固定化時(shí)間等。因此為確定固定化

12、纖維素酶所用海藻酸鈣準(zhǔn)確濃度需進(jìn)一步試驗(yàn)采用單因子變量。由圖四可知, 在海藻酸鈣濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為3.5% 時(shí),固定化酶活力最大。當(dāng)海藻酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí),其黏度很大, 難以擠成球狀, 影響凝膠成型, 同時(shí)凝膠的孔徑也小, 影響酶與底物的結(jié)合。反之海藻酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)太小, 凝膠的孔徑較大, 固定化酶容易流失, 也會(huì)影響酶活。因此, 合適質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈣易形成機(jī)械強(qiáng)度適宜的凝膠, 同時(shí)底物和產(chǎn)物易于從凝膠微孔擴(kuò)散通過(guò), 酶促反應(yīng)速度較快, 所以選擇海藻酸鈣濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）3.5% 為宜。對(duì)酶固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因可能有以下幾點(diǎn)： 固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶伸展變形； 酶活力的緩慢

13、釋放； 抑制酶的自降解，將酶與固態(tài)載體結(jié)合后，由于酶失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了降解。7、實(shí)驗(yàn)小結(jié)：掌握海藻酸鈣固定纖維素酶的基本原理與操作方法纖維。在海藻酸鈣固定纖維素酶中由于固定化效果受各種條件影響：海藻酸鈣的濃度、氯化鈣的濃度、纖維素酶用量、固定化時(shí)間等。因此實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格控制除海藻酸鈣鈣外的因素。做到準(zhǔn)確，減少實(shí)驗(yàn)操作誤差，增加結(jié)果可信度。8、實(shí)驗(yàn)思考題： 為什么海藻酸鈣濃度的固定化酶的活性產(chǎn)生影響？答：固定化條件對(duì)固定化酶活力的影響主要有：海藻酸鈣的濃度、氯化鈣的濃度、纖維素酶用量、固定化時(shí)間等。海藻酸鈣具有強(qiáng)烈的吸附作用，可與Ca2+、Cu2+等正二價(jià)陽(yáng)離子迅速形成凝膠，海藻

14、酸鈣濃度過(guò)大凝膠的空徑越小，影響酶與底物結(jié)合；海藻酸鈣濃度太小，凝膠的孔徑較大，固定化容易流失，所以酶活較低。所以海藻酸鈣濃度有一個(gè)最佳濃度值。為什么海藻酸鈉濃度的固定化酶的活性產(chǎn)生影響？答：固定化條件對(duì)固定化酶活力的影響主要有：海藻酸鈉的濃度、氯化鈣的濃度、纖維素酶用量、固定化時(shí)間等。海藻酸鈉具有強(qiáng)烈的吸附作用，可與Ca2+、Cu2+等正二價(jià)陽(yáng)離子迅速形成凝膠，海藻酸鈉濃度過(guò)大凝膠的空徑越小，影響酶與底物結(jié)合；海藻酸鈉濃度太小，凝膠的孔徑較大，固定化容易流失，所以酶活較低。所以海藻酸鈉濃度有一個(gè)最佳濃度值。9、參考文獻(xiàn)：1 魯玉俠, 蔡妙顏, 郭祀遠(yuǎn), 王兆梅. 海藻酸鈣包埋法制備固定化脂肪酶研究J. 現(xiàn)代食品科技, 2007,4(22):3032.2 潘利華, 羅建平, 查學(xué)強(qiáng)等