1、武漢長江工商學院生物酶工程技術論文院： 工學院 專業： 生物工程 年級： 10 題目: -淀粉酶的酶學性質研究學生： 學號： 指導教師： 職稱: 2013年 06 月02日目 錄摘 要3關鍵詞3Abstract3Key words3前言31.材料與方法411材料與設備41.2繪制糖含量標準曲線4試劑配制4繪制糖含量標準曲線42.-淀粉酶酶學性質研究關鍵技術52.1 -淀粉酶最適溫度研究關鍵技術52.2 -淀粉酶最適PH研究關鍵技術62.3-淀粉酶耐熱性研究關鍵技術72.4-淀粉酶動力學常數（Km）測定研究82.5-淀粉酶相對分子質量測定研究93.結論10參考文獻10-淀粉酶的酶學性質研究摘 要

2、：本實驗通過研究-淀粉酶的酶學性質，利用淀粉酶水解還原糖，還原糖能使3，5-二硝基水楊酸還原，生成棕色的3-氨基-5硝基水楊酸。淀粉酶活力與還原糖的量成正比，用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位質量樣品在一定時間內生成還原糖的量表示酶活力。酶的活性又同時受到溫度、PH、激活劑抑制劑等的影響。設計單因素試驗研究-淀粉酶的最適條件，采用SDS-PAGE法測定-淀粉酶相對分子質量，結果如下：最適溫度為60，最適PH為7.5，耐熱性較好，100時-淀粉酶仍有活力，動力學常數（Km）為3.8g/L。關鍵詞：-淀粉酶 活力 溫度 PH 耐熱性 動力學常數 相對分子質量Enzymatic

3、Properties of Mesophilic -AmylaseAbstract：-Amylase was purified to electrophoretic homogeneity. The molecular weight ofthe purified -amylase is 58 kD. Its optimum pH value of is in the range from 5.5 to 6.5,and the optimum temperature is 60 .With in 24 h at room temperature 80% enzyme activity keeps

4、 in the pH range from 7.0 to 10.0. The most enzyme activity loseswithin 15 min at 55 . But, the enzyme would be stable for 1 h with the presence of 10 mmol/L Ca2+. EDTA inhibits the enzyme activity, while, Ca2+, Mn2+ and Co2+ ions are activators. Km and Vmax of -amylase to soluble starch is 4.33 g/L

5、 and 1.19 g/Lmin, respectively. The main hydrolysates to soluble starch are oligosaccharides and dextrin.Key words：Bacillus amyloliquefaciens；-amylase；purification；characterization property 前言： 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱。-淀粉酶（-1,4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶），普遍分布在動物、植物和微生物中，是一種重要的淀粉水解酶。它以隨機作用方式切斷淀粉、糖原、寡聚糖或多聚糖分子內的-1,4葡萄糖苷鍵

6、，產生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖。 不同來源的-淀粉酶的酶學性質和理化性質有一定的區別，它們的性質對其工業應用的影響也較大，在工業生產中要根據需要使用合適來源的酶，因此對淀粉酶性質的研究非常重要。本實驗所使用的是由芽孢桿菌深層發酵提取而得到的-淀粉酶，是一種高效性的淀粉酶，具有較高的催化能力，可用于制備糊精、麥芽糖、葡萄糖等，其最適反應溫度為50-75，最適PH范圍為5.5-7.5，耐熱性為在100仍有少量活性，動力學常數Km值為1.74g/L，采用SDS-PAGE法測定-淀粉酶相對分子質量。通過研究淀粉酶的性質，能使我們更好的了解它，并充分利用于工業生產、食品加工、醫療等產業。1.材料與方法11

7、材料與設備材料: -淀粉酶；可溶性淀粉，硫酸，葡萄糖（粉末），氫氧化鈉(粉末)，3,5-二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉，檸檬酸，檸檬酸鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，甘氨酸，考馬斯亮藍G-250,95%乙醇，85%磷酸主要儀器:試管，恒溫水浴鍋，722型分光光度計，分析天平，燒杯，容量瓶，具塞刻度試管，玻璃棒，移液管，膠頭滴管，洗耳球，垂直板電泳槽，電爐11.2繪制糖含量標準曲線1.2.1試劑配制1）1%-淀粉酶液的配制2準確稱取-淀粉酶0.5g，適量水溶解后定容至50 mL，即得1-淀粉酶液，放入冰箱中保存，用時需過濾。2）1%淀粉溶液準確稱取可溶性淀粉0.5g,用適量蒸餾水溶解后沸水浴中煮沸3min

8、后定容至50ml，臨用現配。3）3,5-二硝基水楊酸3精確稱取3,5-二硝基水楊酸10g，溶于200ml 2mol/lNaOH溶液中，加入500 ml蒸餾水，再加入300g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至1000ml,搖勻后分裝至試劑瓶中冰箱中保存。4）0.1mol/l檸檬酸稱取檸檬酸21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。5）0.1mol/l檸檬酸鈉稱取檸檬酸鈉29.41g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。6）0.1mol/l磷酸氫二鈉4稱取二水磷酸氫二鈉35.61g，用蒸餾水溶解定容至1000ml。7)0.1mol/l磷酸二氫鈉稱取一水磷酸二氫鈉27.6g,用蒸餾水溶解定容至1

9、000ml。8）甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05mol/l）稱取甘氨酸1.502g，用蒸餾水溶解定容至100ml,即為0.2mol/l甘氨酸。PH10.0 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，0.2mol/l甘氨酸，8ml 0.4mol/lNaOH加水稀釋定容至100ml5。1.2.2繪制糖含量標準曲線 取7只干凈的具塞刻度試管，編號，按下表加入試劑，混勻，置沸水浴中煮沸5min,取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至25ml。以1號管作為空白調零點，在540nm波長下比色測定5。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線6。表1試劑加入量試管號1234567葡萄糖標準溶液/ml00.20.40.81.2

10、1.62.0蒸餾水/ml2.01.81.61.20.80.403,5二硝基水楊酸2222222按表1測得各個試管吸光度如表2表2 吸光度值試管編號1234567葡萄糖含量（mg/ml）00.0080.0160.0320.0480.0640.008吸光度A00.0480.1020.2220.3650.4890.624以標準葡萄糖含量為橫坐標，光密度值為縱坐標，做出標準曲線圖1，求出標準曲線方程。圖1糖含量標準曲線2.-淀粉酶酶學性質研究關鍵技術2.1 -淀粉酶最適溫度研究關鍵技術研究-淀粉酶最適溫度設置如下9個溫度梯度：30、40、50、55、60、65、70、80、90，且需假設一個PH作為最

11、適PH，又已知所選-淀粉酶最適PH范圍為5.5-7.5,設最適PH為6.5，將過濾后的酶液PH調為6.5樣品-淀粉酶活力測定步驟：取每個溫度下4支試管，標明1支為對照管，3支為測定管。于每管中各加酶液1ml，對照管中另加入4ml 0.4mol/l氫氧化鈉，在相應溫度下保溫15min，再向各管分別加入對應溫度下預熱的1%淀粉溶液2ml,搖勻，立即放入對應溫度恒溫水浴，準確計時保溫5min,取出后向測定管中迅速加入4ml 0.4mol/l氫氧化鈉，終止酶活動，準備測糖7。樣品的測定：取酶作用后的各管溶液2ml，分別放入相應的25ml具塞刻度試管中，各加入2ml 3,5-二硝基水楊酸試劑。以下操作同

12、標準曲線制作。根據樣品比色吸光度，從標準曲線查出葡萄糖含量，最后進行結果計算。本實驗設定60時在5min內水解淀粉釋放1mg葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）8。所測得的數據如下：表3 -淀粉酶最適溫度研究溫度304050556065708090對照管OD值0.3070.3020.2940.2820.2780.2940.2540.2430.217酶活力U4.14.354.7254.9755.6255.5255.254.9251.2酶活力計算公式：U=注：A測測量管對應吸光度；A對對照管對應吸光度；V酶反應體系總體積圖2 溫度對-淀粉酶活力的影響結論：由酶活力隨溫度變化而變化的趨勢，得出酶反

13、應最適溫度為60，在5570有較高活力，80以上活力較低9。2.2 -淀粉酶最適PH研究關鍵技術研究-淀粉酶最適PH設置如下9個PH梯度：3.0,4.0,5.6,6.0,6.5,7.0,7.5，8.0，10.0，同測最適溫度一樣需設定最適溫度，根據所測最適溫度為60，所以將恒溫水浴設為60。準備PH緩沖液，PH7.0之前為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，PH7.0至8.0為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，PH10.0為甘氨酸緩沖液10。樣品-淀粉酶活力測定步驟取每個溫度下4支試管，標明1支為對照管，3支為測定管。于每管中各加酶液1ml，對應PH下的緩沖液1ml,對照管中另加入4ml 0.4mol/l氫氧

14、化鈉，在相應溫度下保溫15min，再向各管分別加入對應溫度下預熱的1%淀粉溶液2ml,搖勻，立即放入對應溫度恒溫水浴，準確計時保溫5min,取出后向測定管中迅速加入4ml 0.4mol/l氫氧化鈉，終止酶活動，準備測糖。樣品的測定：取酶作用后的各管溶液2ml，分別放入相應的25ml具塞刻度試管中，各加入2ml 3,5-二硝基水楊酸試劑。以下操作同標準曲線制作。根據樣品比色吸光度，從標準曲線查出葡萄糖含量，最后進行結果計算11。表4 -淀粉酶最適PH研究PH3.04.05.66.06.57.07.58.010.0對照值OD0.2920.2930.2820.2790.2850.2900.2940.

15、3200.288酶活力U0.40.3251.0752.0251.856.0756.0255.0754.475酶活力計算公式：U=U=注：A測測量管對應吸光度；A對對照管對應吸光度；V酶反應體系總體積圖3 緩沖液PH對-淀粉酶活力的影響結論：由酶活力隨緩沖液PH變化而變化的趨勢，得出酶反應最適PH為7.0，在pH7.010.0 有較高的活力12。2.3-淀粉酶耐熱性研究關鍵技術研究-淀粉酶的耐熱性溫度設為如下7個溫度：40,50,60,70,80,90, 100，最適PH設為6.5即將過濾后的酶液PH調為6.5，反應最適溫度設為60。樣品-淀粉酶活力測定步驟：取每個溫度下4支試管，標明1支為對照

16、管，3支為測定管。于每管中各加酶液1ml,對照管中另加入4ml 0.4mol/l氫氧化鈉，在相應耐熱性溫度下保溫5min，再將試管取出放入60恒溫水浴中保溫15min,向各管分別加入60下預熱的1%淀粉溶液2ml,搖勻，立即放入對應溫度恒溫水浴，準確計時保溫5min,取出后向測定管中迅速加入4ml 0.4mol/l氫氧化鈉，終止酶活動，準備測糖。樣品的測定：取酶作用后的各管溶液2ml，分別放入相應的25ml具塞刻度試管中，各加入2ml 3,5-二硝基水楊酸試劑。以下操作同標準曲線制作。根據樣品比色吸光度，從標準曲線查出葡萄糖含量，最后進行結果計算。所測得的數據如下：表5 -淀粉酶耐熱性研究溫度

17、405060708090100對照管OD0.2980.2290.1700.2560.2450.2180.170酶活力U5.2755.256.24.8754.654.80.65酶活力計算公式：U=U=注：A測測量管對應吸光度；A對對照管對應吸光度；V酶反應體系總體積圖4 熱處理溫度研究耐熱性對-淀粉酶活力的影響結論：由上表數據得出，在100時酶活力很低但還是有活力，說明100預熱處理酶沒有完全失活2.4-淀粉酶動力學常數（Km）測定研究實驗步驟：4%淀粉溶液稱取4g可溶性淀粉加適量水溶解，沸水浴中煮沸3mim，定容至100ml1%-淀粉酶液調節PH至6.5溫度設置為恒溫水浴60在不同底物( 可溶

18、性淀粉) 濃度的反應體系中，60反應5min，測定A540 以計算酶反應的初速度，以可溶性淀粉為底物，在pH6.5，溫度60的條件下，取不同濃度的可溶性淀粉( S ) ，測得反應速度(V)，得到1/V 與1/S的關系曲線13。表6 -淀粉酶動力學常數（Km）測定試管號123456酶液ml1.01.01.01.01.01.04%淀粉ml0.250.50.751.01.251.5蒸餾水ml1.751.51.251.00.750.5淀粉液溶度0.5%1.0%1.5%2.0%2.5%3.0%0.20.10.0670.50.40.30.680.890.720.490.460.36注： 4、5、6號測量管

19、在測定吸光度時大于1，故稀釋了五倍。圖5 動力學常數Km值測定曲線由標準曲線方程得：Km=g/L2.5-淀粉酶相對分子質量測定研究本研究采用SDS-PAGE法測定-淀粉酶相對分子質量實驗方法與步驟如下： 安裝垂直板電泳槽 配膠根據所測蛋白質相對分子質量范圍，選擇分離膠濃度 制備凝膠板10%分離膠制備、4%濃縮膠制備 樣品處理及加樣:取酶液與上樣緩沖液1:1混合后沸水浴中煮沸3min 電泳 染色與脫色14原因分析如下：-淀粉酶可能沒有濃縮好，且樣品融解不佳或分離膠濃度過大引起的條帶不清晰有拖尾和擴散現象。可以選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。電泳

20、時間過長，可能由于凝膠緩沖系統和電級緩沖系統地pH選擇錯誤，即緩沖系統地pH和被分離物質的等電點差別太小，或緩沖系統的離子強度太高。標準蛋白條帶只有四條，可能是與緩沖液和分離膠的濃度有關，使蛋白未完全跑出。可以更換正確pH值的Buffer；適當降低分離膠的濃度15。3.結論 淀粉酶的最適溫度在60，在5570有較高活力，80以上活力較低。最適作用pH 值7.0，在pH7.010.0 有較高的活力。在100時酶活力很低但還是有活力，說明100預熱處理酶沒有完全失活。通過測 淀粉酶動力學常數的Km=3.8g/L。采用SDS-PAGE法測定-淀粉酶相對分子質量，由于其它原因沒有測出最終結果，原因在2.5已分析過，此處不再贅述。參考文獻1柳輝，楊江科，閆云君.產-淀粉酶菌株的分離、鑒定及酶學性質研究J.生物技術，2007,17（2）：34-37.2潘風光，劉海學，于師宇.重組耐高溫-淀粉酶的分離純化及其性質研究J.內蒙古民族大學學報：自然科學版，2007,22（1）43-47.3李輝，郭建強，岳麗麗，等.重組超耐熱酸性-淀粉酶的分離純化及其性質研究J.微生物學報，2005,45（4）：547-550.4 韋平和. 生物化學