1、MLH1基因在喉鱗癌中的表達及意義【摘要】 目的：探討人喉鱗癌中MLH1基因的表達及意義。方法：采用免疫組化法分別檢測20例喉癌組織及癌旁組織MLH1基因的表達。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統對MLH1基因的表達進行定量分析。結果：喉癌癌細胞核和細胞質中可見少量的棕黃色顆粒, MLH1基因表達弱;對照組中,細胞核及細胞質中可見一些棕黃色顆粒, MLH1基因表達強。圖像分析結果顯示: 喉癌組MLH1基因表達的平均光密度為0.0694±0.0018, 對照組MLH1基因表達的平均光密度為0.2518±0.0257;喉癌組MLH1基因表達的陽性面積率為0.

2、0738±0.0021, 對照組MLH1基因表達的陽性面積率為0.3257±0.0350，經單因素分析喉癌組與對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)。結論：MLH1基因在喉癌組織中表達降低,可能在喉癌的發生機制中起了一定的作用。 【關鍵詞】 喉鱗癌; 人類錯配修復基因; 免疫組織化學MLH1是人類錯配修復基因( human mismatch repair gene, hMMR)家族中一個重要的基因，MMR對保持遺傳信息的完整性和穩定性，避免遺傳突變的產生具有重要作用，MLH1的功能缺陷被認為是腫瘤發病的重要機制, 成為近年來研究的熱點。研究表明，MMR與結直

3、腸癌、食管癌、胃癌、宮頸癌等關系密切1，2，但在喉癌中的表達狀況報道甚少。本實驗通過免疫組化方法檢測喉癌和癌旁組織中MLH1基因的表達狀況，探討它與喉癌臨床病理特征的關系。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 材料來源 收集武漢市中心醫院病理科20072009年喉癌存檔蠟塊20例，其中男性18例，女性2例。所有切片經病理學專家診斷為喉鱗狀細胞癌，所有病例均為首次發病，并且均是術前未接受過放療、化療的病人。另取瘤組織周圍組織5例(癌旁組織選自手術切除標本遠離腫瘤端,切緣經病理證實未見癌細胞)作對照。1.1.2 材料分組 將實驗分為喉癌組和對照組。1.2 主要試劑和儀器1.2.1 主要試劑 濃縮型

4、鼠抗人MLH1基因單克隆抗體,(北京中山生物技術有限公司);超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒(福州邁新公司);DAB顯色試盒及多聚賴氨酸(北京中山生物技術有限公司)。1.2.2 主要儀器 YWY781型醫用微波儀，250 W，50 Hz (浙江臨安電子器材廠生產);家用高壓鍋;電熱恒溫干燥箱 (湖北黃石醫療器械廠生產);顯微鏡成像系統 (Olympus公司)。1.3 方法1.3.1 蠟塊切片厚5m，貼片于涂有多聚賴氨酸的潔凈載玻片上，置于烤箱烤干待用。1.3.2 免疫組織化學SP法檢測MLH1相關抗原具體步驟： 4m組織切片常規脫蠟至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3

5、5;3 min; 抗原修復(檸檬酸緩沖液微波抗原修復法)，室溫自然冷卻后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min; 滴加3%過氧化氫，37濕盒孵育10min以抑制內源性過氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 正常羊血清37濕盒孵育10min以減少非特異性背景; 甩去多余血清，分別滴加一抗，4孵育過夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min; 滴加生物素標記的二抗37濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 滴加鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物復合物37濕盒孵育10mi

6、n，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應時間(約35min)，自來水沖洗終止反應; 蘇木素復染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍; 梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢;用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為陽性對照組。1.3.3 免疫組織化學結果判斷MLH1基因以胞核或胞質出現棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(同濟千屏影像公司)對MLH1基因的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個

7、完整而不重疊的高倍鏡視野(×400) ,測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積,計算陽性面積率(陽性面積率=單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積×100%)。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.4 統計學處理數據以均數±標準差表示，用SPSS11. 5軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q) 檢驗，檢驗水準為0.05。2 結果喉癌癌細胞核和細胞質中可見少量的棕黃色顆粒, MLH1基因表達弱;對照組中,細胞核及細胞質中可見一些棕黃色顆粒, MLH1

8、基因表達強。圖像分析結果顯示: 喉癌組MLH1基因表達的平均光密度為0.0694±0.0018, 對照組MLH1基因表達的平均光密度為0.2518±0.0257;喉癌組MLH1基因表達的陽性面積率為0.0738±0.0021, 對照組MLH1基因表達的陽性面積率為0.3257±0.0350，經單因素分析喉癌組與對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)。見表1。表1 喉癌組與對照組中MLH1基因表達的平均光密度3 討論惡性腫瘤的發生發展是多步驟多因素參與的復雜過程,其發病機制在分子水平上涉及到癌基因、抑癌基因、凋亡調節基因和錯配修復基因等。人

9、類DNA錯配修復基因(MMR)包括9個，即hMLH1、hMLH3、hPMS1、hPMS2、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、 hMSH6。hMLH1位于染色體3p21-23，基因組全長約58kb，含19個外顯子，cDNA 有2 268bp的開放閱讀框架，編碼蛋白質756個氨基酸，其編碼的蛋白質產物參與hPMS2結合形成異源二聚體，識別錯配位點，參與錯配修復，主要作用是保持遺傳物質的完整性和穩定性,保證DNA復制的忠實性35。近年來研究發現錯配修復基因的改變可引起微衛星不穩定(microsatellite instability,MSI),使癌基因、抑癌基因的突變積累,導致癌基因激

10、活和抑癌基因失活,最終引起細胞惡變,腫瘤形成。其中hMLH1和hMSH2研究較為透徹,其功能缺陷或表達降低,與胃腸道、呼吸和泌尿系統等腫瘤的發病關系密切。MSI的發生與MMR的表達存在相關性，微衛星不穩定和錯配修復基因異常可能參與部分喉鱗狀細胞癌的發生6。但是也有相反結論，Smigiell7認為喉癌MLH1基因失活并不會導致MSI。錯配修復(MMR) 是DNA 修復的主要途徑之一,它針對DNA 發生錯配的堿基進行修復,是通過細胞內的錯配修復系統來完成的。該系統由錯配修復基因編碼的一系列酶組成,存在于原核生物和真核生物中,能夠特異性識別、切除并修復錯配堿基,以保證DNA 復制的忠實性,保持遺傳物

11、質的穩定性和完整性,從而避免基因突變的發生8。在錯配修復過程中,hMSH2 其蛋白表達產物分別與hMSH6 和hMSH3蛋白構成異源二聚體hMutS和hMutS,識別堿基錯本配并與之結合,啟動修復過程,而且hMSH2基因的作用處于主導地位9，10。hMLH1 蛋白在執行錯配修復時分別與hPMS2和hMLH3 蛋白構成異源二聚體hMutL和hMutL,但它們在錯配修復過程中的具體機制尚不明確11，12。錯配修復的基本功能就是去除復制過程中的堿基錯配及聚合酶滑鏈造成的插入缺失環,校正非同源染色體重組而保持整個基因組的穩定。錯配修復系統發揮作用時,整個修復過程包括三個步驟:錯配識別、含錯配堿基的區段

12、的剪切、剪切后再合成1315。實驗采用免疫組化法分別檢測了喉癌組織及癌旁組織MLH1基因的表達。結果提示，喉癌組織中MLH1基因表達弱;對照組中, MLH1基因表達強。經單因素分析喉癌組與對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)。提示MLH1基因的表達下調是喉鱗癌發病的危險因子,可能與喉鱗癌的發生發展密切有關。雖然錯配修復基因被發現以來，已對其研究已經取得很大進展，但是錯配修復基因受哪些因素影響，它能否作為惡性腫瘤的特征性指標，仍需要人們進一步研究，另外檢測錯配修復基因突變尚需尋找更有效和簡便的方法,才具有應用價值。這些都有待于我們今后的進一步研究和探討。【參考文獻】 1 范凱,

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