1、苦參堿對表皮角質形成細胞和真皮成纖維細胞P物質受體和細胞因子表達的影響劉繼勇，王玫，李鳳前，朱全剛，孫華君，胡晉紅基金項目：軍隊醫藥衛生十五重點課題（01Z66），上海市科委基礎研究重點項目（No 05JC14046） *Corresponding author Tel:86-21-25070665, Fax: 86-21-25070668, E-mail: hujh （第二軍醫大學 長海醫院 藥學部，上海 200433） 摘 要： 研究苦參堿對表皮角質形成細胞系HaCaT細胞和真皮成纖維細胞P物質受體表達的影響，并探討苦參堿對P物質誘導兩種細胞表達IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的影響

2、。采用流式細胞術和Western blotting檢測分析苦參堿對兩種皮膚細胞P物質受體表達的影響；以P物質刺激HaCaT細胞和真皮成纖維細胞，加入不同劑量的苦參堿共孵育，采用ELISA方法測定苦參堿對IFN-、IL-1、IL-6及IL-8分泌的影響。結果表明，苦參堿顯著抑制HaCaT細胞和真皮成纖維細胞P物質受體的表達；P物質刺激可以顯著增加HaCaT細胞和真皮成纖維細胞IFN-、IL-1、IL-8的分泌量；不同濃度的苦參堿均可以抑制皮膚細胞IL-1、IL-8的分泌，但對IFN-的分泌無明顯影響。P物質和苦參堿對兩種皮膚細胞IL-6的產生均無顯著影響。關鍵詞： 苦參堿；P物質受體；HaCaT

3、細胞；真皮成纖維細胞；細胞因子Effect of matrine on the expression of substance P receptor and cytokines production in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.LIU Ji-Yong, WANG Mei, LI Feng-Qian, ZHU Quan-Gang, SUN Hua-Jun,HU Jin-Hong*(Department of Pharmacy，Changhai Hospital，Second Military Medical Un

4、iversity，Shanghai 200433，China)ABSTRACT To investigate the effect of matrine on the expression of neurokinin 1 receptor (NK-1R) and cytokines production induced by substance P (SP) in HaCaT cells (a human epidermal keratinocyte cell line) and dermal fibroblasts. The effect of Matrine on the expressi

5、on of NK-1R protein was detected by flow cytometry and Western blotting analysis.The modulation of Matrine on the production of interferon (IFN)-, interleukin (IL)-1, IL-6 and IL-8 in HaCaT cells and fibroblasts was measured by ELISA. The results showed that Matrine significantly inhibited the expre

6、ssion of NK-1R in HaCaT cells and fibroblasts. SP induced the production of IFN-, IL-1 and IL-8 in both cell types. Matrine 10-100gmL-1 inhibited SP-induced IL-1 and IL-8 production in HaCaT cells and fibroblasts, while had no effect on the production of IFN- in both cells. Both SP and Matrine had n

7、o effect on the secretion of IL-6 in HaCaT cells and fibroblasts. These findings suggest that Matrine may be involved in the treatment of skin inflammation induced by SP by inhibition the expression of substance P receptor and regulation the production of IL-1 and IL-8 in epidermal keratinocyte and

8、dermal fibroblasts.Key words: Matrine; substance P receptor; HaCaT cell line; fibroblast; cytokines; skin inflammation近年來，隨著“皮膚免疫系統”概念的建立和研究的不斷深入，皮膚的免疫功能日益受到研究人員的重視。皮膚免疫細胞主要包括樹突狀細胞（dendritic cells，DC）、朗格罕氏細胞（Langerhans cells，LC）、黑色素細胞（melanocytes，MC）、淋巴細胞及巨噬細胞等，這些細胞在皮膚免疫和皮膚炎癥中的作用已得到了深入研究1。但對于占表皮組成約9

9、5的表皮角質形成細胞（keratinocytes）和構成真皮的主要細胞真皮成纖維細胞（fibroblasts）在皮膚免疫和皮膚疾病中的作用卻少有報道。P物質作為一種速發型過敏反應的炎癥介質，已被證實參與了皮膚免疫和炎癥的調控過程，如促進細胞增殖，誘導細胞分化，調節細胞因子、粘附分子和趨化因子等活性介質的釋放等。P物質通過與高親和力的P物質受體（neurokinin-1 receptor, NK-1R）結合或直接激活細胞內的G-蛋白級聯反應作用于皮膚細胞，從而調節皮膚免疫和炎癥反應，在神經-內分泌-皮膚免疫系統網絡中具有重要作用2,3。 苦參堿為豆科植物苦參Sophora flavescens

10、Ait.的主要成分，具有抗炎、抗過敏、抗心率失常及抗腫瘤等廣泛的生理活性。在治療皮膚疾病方面，苦參“苦可除熱，寒可涼血，燥可勝濕”，是外用治療銀屑病、皮膚瘙癢、蕁麻疹等炎癥性皮膚病最常用的中藥之一4。本研究采用由人腹部表皮衍化而成，具有與正常人表皮角質形成細胞相似分化特征的HaCaT細胞株和經原代培養的真皮成纖維細胞為工具，考察苦參堿對P物質受體在這兩種細胞上表達的影響，并探討了P物質和苦參堿對HaCaT細胞和真皮成纖維細胞分泌細胞因子IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的影響，為進一步闡明P物質介導皮膚變態反應的機制及苦參堿抗皮膚過敏的作用靶點提供依據。材料與方法 藥品與試劑 苦參堿（Ma

11、trine，Mat，上海融禾醫藥科技發展有限公司，純度98%）； Substance P （SP, Sigma公司）； 人角質形成細胞無血清培養基（K-SFM，Gibco/BRL公司）；DMEM培養基（Gibco/BRL公司）；新生胎牛血清（FBS，杭州四季清生物制品公司）；胰蛋白酶（tissue culture grade，AMRESCO）；膠原酶（CLS-1,Worthington Biochemical Corp.）；分散酶（AMRESCO）；山羊多克隆P物質受體抗體（美國Santa Cruz公司），工作濃度1200；HRP-兔抗山羊二抗（丹麥DAKO公司），工作濃度1100；FITC兔

12、抗山羊IgG（武漢博士德生物工程公司，Boster），工作濃度150；Human IFN- ELISA Kit（Bender Medsystems GmbH，Vienna，Austria）；Human IL-1、IL-6、IL-8 ELISA Kit 儀器 流式細胞儀 （美國Becton Dickinson公司）；垂直電泳系統（Mini-PROTEA）（美國Bio-Rad公司）；轉印系統（Mini Trans-Blot）（美國Bio-Rad公司）；UVPBioimaging Systems（美國UPLand公司）；MK2型酶標儀（芬蘭 Labsystem公司）； Multiskan 洗板機（芬

13、蘭Labsystem公司）；Camera controller（日本Hamamatsu公司）；SDJ-ZS型生物潔凈工作臺（上海淀山湖凈化設備廠）；二氧化碳培養箱（美國FORMA公司）。細胞培養 HaCaT細胞株由美國NIH米慶勝教授提供，培養基采用人角質形成細胞無血清培養基，置于5% CO2，37 飽和濕度孵箱中培養5。真皮成纖維細胞采用我室建立的培養方法進行培養6，培養基為含10%小牛血清的DMEM，置于5% CO2，37 飽和濕度孵箱中培養，每2-3天換液傳代,取第6代以后的細胞進行試驗。流式細胞分析 取生長良好的HaCaT細胞和真皮成纖維細胞，以1108個L-1密度接種于6孔培養板，分

14、為空白對照組、SP（10-8 molL-1）刺激組、Mat（10-6 molL-1）組、NK-1R特異性拮抗劑Spantide I（10-5 molL-1）組及SP分別與Mat、Spantide共孵育組，每組設3復孔，作用時間均為24 h。待各處理組細胞增殖近融合后，按文獻方法處理7，加入NK-1R山羊多克隆抗體2.5 L及兔抗山羊IgG-FITC 3 L，室溫孵育、洗滌后以流式細胞儀檢測細胞表面平均熒光強度（average fluorescence intensity，AFI）。Western blotting分析 取HaCaT細胞和真皮成纖維細胞，以2108個L-1密度接種于100 mm培

15、養皿中，置于孵箱中培養。細胞生長近融合后，棄去上清液，以無血清DMEM為空白對照，分別加入含SP、Mat和Spantide的培養基進行培養24 h。按文獻方法8進行蛋白抽提及SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，加入NK-1R山羊多克隆抗體（1100）2 L及HRP標記的兔抗山羊二抗（15000）36+ L，室溫孵育、洗膜后以顯影液顯影，置UVP成像系統中攝影，定位。ELISA測定 以1108個L-1的密度將細胞接種于24孔培養板，置恒溫培養箱中培養24 h，待細胞平穩生長7080融合后，換以無血清DMEM培養基，靜息24 h。以無血清DMEM為空白對照，加入含SP和不同濃度Mat的培養基進行培養，

16、每組平行設3復孔，繼續培養24 h。吸取上清液，1000 rpm離心5 min，-20保存。采用ELISA方法檢測上清液中IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的含量。統計分析 實驗數據以s表示，采用SPSS10.0統計軟件進行處理，組間比較采用Students t檢驗進行。結 果1 Mat抑制HaCaT細胞和真皮成纖維細胞上NK-1R的表達流式細胞術檢測表明，NK-1R在HaCaT細胞和真皮成纖維細胞表面均有顯著的陽性表達。SP （10-8 molL-1）可以使HaCaT細胞和真皮成纖維細胞上NK-1R的平均表達量上調39.3%（P0.01）和47.0%（P0.01）。Mat（100 gmL

17、-1）或Spantide（10 molL-1）單獨作用于兩種皮膚細胞，對細胞上NK-1R的表達均無顯著影響。將Mat或Spantide與SP共孵育，均能抑制SP誘導的兩種皮膚細胞上NK-1R的表達。Mat可使HaCaT細胞和真皮成纖維細胞上NK-1R的平均表達量分別下調33.0%（P0.05）和44.5（P0.01），Spantide 可使兩種細胞上NK-1R的平均表達量分別下調43.1%和46.1%（P0.01），（見圖1）。 Western blotting 分析表明，Mat可以顯著抑制NK-1R在HaCaT細胞和真皮成纖維細胞上的蛋白表達，結果見圖2、圖3。*#Fig.1 Effect

18、of matrine on the expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) in HaCaT cells and fibroblasts. Cells were preincubated as follows for 24 h before detection. The average fluorescence intensity (AFI) was determined by flow cytometric analysis. 1.control; 2.matrine 100g/mL; 3.Spantide 10mol/L; 4.SP10nmo

19、l/L; 5.SP 10nmol/L+matrine 100g/mL; 6.SP 10nmol/L+Spantide 10mol/L.Results are shown as mean SD values from three independent experiments. # P0.01 vs control. *P0.05, * P0.05）。不同濃度的Mat均可以抑制SP誘導的IL-1和IL-8的分泌，其中100 gmL-1的Mat可以使IL-1和IL-8的表達分別降低49.2%和58.4% （P0.05）。結果見表1。Tab. 1 Effect of Matrine on the p

20、roduction of IFN-, IL-1, IL-6 and IL-8 in cultured human HaCaT cells ( n=3,s )GroupDose/ molL-1IFN-IL-1IL-8IL-6C IR/ngL-1 /%C IR/ngL-1 /%C IR/ngL-1 /%C IR/ngL-1 /%ControlSPMatSP+Mat-10-810-410g/mL-150g/mL-1100g/mL-127.34.875.42.235.54.584.04.372.99.696.512.1-11.43.3-27.922.21.437.05.626.83.632.22.1*

21、22.31.3*18.81.7*13.039.849.234.13.946.99.131.75.822.82.3*21.21.7*19.52.2*51.454.858.444.39.548.57.841.85.643.44.742.53.643.34.210.512.410.7 P0.01 vs control. *P0.05, * P0.05）。不同濃度的Mat均可以抑制SP誘導的IL-1和IL-8的產生，其中10-4 molL-1的Mat可以使IL-1和IL-8的表達分別降低47.4%和39.0% （P0.05）。結果見表2。Tab. 2 Effect of Matrine on the

22、production of IFN-, IL-1, IL-6 and IL-8 in cultured human fibroblasts ( n=3,s )GroupDose/molL-1IFN-IL-1IL-8IL-6C IR/ngL-1 /%C IR/ngL-1 /%C IR/ngL-1 /%C IR/ngL-1 /%ControlSPMatSP+Mat-10-810-410g/mL-150g/mL-1100g/mL-154.55.186.414.262.57.284.910.488.22.4100.712.21.7-2.1-16.622.32.840.54.826.41.228.33.

23、5*23.22.1*21.33.2*30.142.747.4563.641.9632.653.9582.051.1476.635.6*428.138.4*386.242.3*24.732.339.017.12.720.62.520.02.119.81.918.93.218.52.34.08.310.2 P0.01 vs control. *P0.05, * P500pg/ml）。苦參堿可以顯著抑制P物質誘導的兩種細胞IL-8的產生。本研究中，無論是P物質還是苦參堿對IL-6的表達均無顯著影響，這可能與細胞種類和刺激因素有關，IL-6在皮膚炎癥中的作用機理還有待進一步研究。參考文獻1 Ansel

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