1、2010, Vol. 31, No. 11食品科學生物工程178鯽魚腸道細菌菌群初步分析侯進慧，陳宏偉，曹澤虹，高兆建，蔡 侃(徐州工程學院食品(生物 工程學院，江蘇 徐州 221008摘 要：從健康鯽魚腸道分離出62株細菌菌株，革蘭氏染色分析結果表明，其中18株為革蘭氏陽性菌株，44株為革蘭氏陰性菌株。實驗分析各菌株產纖維素酶和產淀粉酶的情況。篩選到26株產淀粉酶菌株，占篩選菌株的41.94%，沒有從鯽魚腸道內篩選到產纖維素酶菌株。使用16S rD NA 基因序列檢測，確定相關菌株分別屬于Aeromonas 、Shewanella 、Pseudomonas 等。分析產酶活性較高的菌株F2的致

2、病性和產酶活力，確定其不是鯽魚致病菌，其分泌性淀粉酶在p H 7、溫度32時表現出最大酶活力。關鍵詞：鯽魚；腸道；細菌；淀粉酶；共生菌Preliminary Analysis of Bacterial Flora of the Intestinal Tract of CarpHOU Jin-hui，CHEN Hong-wei，CAO Ze-hong，GAO Zhao-Jian，CAI Kan(College of Food Engineering (Bioengineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, ChinaAbstr

3、act ：In this study, 62 bacterial strains were isolated from the intestinal tract of healthy Carp, Carassius auratus. Totally 18 Gram-positive and 44 Gram-negative strains were identified through Gram-staining. Cellulase and amylaseproduction analysis verified 26 amylase-producing strains and no cell

4、ulase-producing strains in the intestinal tract ofcarp. Amylase-producing strain was 41.94% among all the isolated strains. Several strains were identified to beAeromonas , Shewanella and Pseudomonas through 16S rDNA gene sequencing analysis. Pathogencity and amylaseactivity of strain F2 was analyze

5、d to reveal that this strain was nonpathogenic for carp and its activity reached the peaklevel at pH 7 and 32 .Key words：Carassius auratus ；intestinal tract ；bacteria ；amylase ；symbiotic strain中圖分類號：S943 文獻標識碼：A 文章編號：1002-6630(201011-0178-04收稿日期：2009-09-16基金項目：江蘇省高校自然科學基礎研究面上項目(07KJD550202；徐州市科技計劃項目

6、(XZZD0924； 徐州工程學院引進人才科研啟動項目；徐州工程學院科研項目(XKY2008110作者簡介：侯進慧(1980 ，男，講師，博士，研究方向為生物工程。E-mail ：hou jinhui0魚類腸道正常菌群是腸道的重要組成部分，是腸道微生物與魚體以及水生環境形成的相互依賴、相互制約的微生態系，對魚類的消化吸收、免疫反應以及器官的發育等方面具有不可替代的作用，并且影響到魚類的生長、發育、生理和病理等過程。魚類腸道菌群種類繁多，數量很大。魚類的腸道微生態系統對于魚類的健康非常重要。腸道的微生態平衡是動物保持個體健康和發揮正常生產性能所必需的條件，調控魚類消化道微生態系統對提高魚類的生產

7、性能和飼料利用率，減少病原菌在腸道內的定植具有重要的意義。共生菌群調控腸道微生態系統的作用已越來越受到研究人員的關注。在魚類腸道菌的來源研究方面，Munro 等1發現腸道菌群主要來自于所攝取的活飼料而不是養殖水體。也有實驗表明腸道的菌群與魚的飼料和水體環境中的細菌并不相同2。這些問題還需要深入研究。魚類腸道菌群的平衡是腸道發揮正常生理功能的基礎。因此，積極研究和探討魚類腸道的微生態系統，促進這一系統建立穩定平衡，對于維護魚類的健康，促進養殖業發展，推動安全的水產食品生產，具有重要的理論和應用價值。同時，腸道菌群中的非致病性共生菌株可用來開發活載體疫苗，即將非致病性菌株構建成重組載體，攜帶并表達

8、其他強致病性病原體的保護性抗原，誘發機體產生特異性免疫應答。在這種疫苗中，活的細菌不僅是展示保護性抗原的載體，而且還可以充當免疫增強劑的角色。通過重組技術，使用細菌或病毒來傳遞抗原的重組活載體疫苗研究有很好的應用前景，發展潛力較大3-4。本實驗對鯽魚腸道菌群進行分析，可推動淡水魚用基因工程疫苗的開發，促進水產179生物工程食品科學2010, Vol. 31, No. 11微生態工程技術研究。材料與方法1.1材料與試劑菌株分離自蘇北地區健康鯽魚體內腸道組織。分析純生化試劑和PCR 反應引物 上海生工生物工程技術服務有限公司。Taq DNA 聚合酶、dNTP 等分子生物學試劑 天根生化科技(北京

9、有限公司。產淀粉酶菌株篩選培養基和產纖維素酶菌株篩選培養基參考文獻5-6方法進行配制，滅菌備用。1.2菌株分離將鯽魚腸道置于已滅菌過的研磨器研磨，將研磨液用移液槍轉入離心管中。對研磨液進行梯度稀釋，溶液依次為：原液、10-2、10-4、10-6，涂布LB 培養基，分離單菌落。1.3革蘭氏染色和生理生化分析參考文獻7-9進行。1.4產淀粉酶菌株篩選5使用盧哥氏碘液染色，若出現透明水解圈，則說明該菌株可產生淀粉酶，對初篩到的菌株進行復篩。測量水解圈與菌落直徑的比值初步確定產酶活性高的菌株。1.5產纖維素酶菌株篩選6 將0.5g/100mL的剛果紅倒入培養基中染色5min ，倒掉剛果紅后，使用5g/

10、100mL的NaCl 溶液浸泡脫色1h ，若菌株周圍有透明水解圈出現，則說明該菌株產纖維素酶。1.616S rDNA序列分析提取菌株基因組DNA 10，作為 PCR反應模板。根據細菌16S r D N A 序列保守性合成引物5：F ：A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G ，R ：GGTTACCTTGTTACGACTT 。反應步驟是：95預變性5min ；94變性30s ，57退火60s ，72延伸90s ，重復24個循環；72延伸10min 。將獲得的16S rDNA送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。用BLAST 程序在GenBank 基因庫中將

11、獲得的16S rDNA序列，進行比對分析，分析菌株的分類地位，并將序列提交到GenBank 基因庫中，獲得基因序列號。1.7菌株F2毒性分析將菌株F2接種于液體LB 培養基中振蕩培養，沉淀細胞后使用無菌PBS 洗滌兩次，懸浮在無菌PBS 中，細菌濃度用系列稀釋平板計數法確定。每尾鯽魚(質量約50g 一次性腹腔注射菌株F2，劑量5×106CFU /尾，記錄累積死亡率，連續記錄30d ，分析菌株F 2毒性。1.8菌株F2產淀粉酶條件分析11-12采用3,5-二硝基水楊酸顯色法(DNS對發酵培養提取的粗酶液進行相對酶活力測定。通過連續液體發酵，分析菌株F2產纖維素酶條件和酶活性，獲得酶活最

12、適pH 值和溫度。結果與分析2.1鯽魚腸道菌株數目實驗結果顯示，10-6稀釋液涂布10L 后，培養基上不見菌落，而10-4稀釋液涂布10L 后，培養基上菌落有幾十個。每尾魚腸道細菌溶液總體積是4mL 。由此可以推算出，鯽魚腸道中，可培養細菌的數目在4×108以下。從健康鯽魚腸道分離出62株菌株，革蘭氏染色分析表明，其中18株為革蘭氏陽性菌株，44株為革蘭氏陰性菌株。2.2鯽魚腸道產分泌性淀粉酶和纖維素酶菌株分析從鯽魚腸道分離到62株菌，其中產分泌性淀粉酶菌株有26株，占41.94%(圖1 。對產分泌性淀粉酶菌株的水解圈與菌落直徑比值進行分析，26株菌株的R/r(透明圈直徑/菌落直徑

13、比值見表1。菌株F2的淀粉酶活性較高，R/r達到3.25。在鯽魚腸道中沒有篩選到產分泌性纖維素酶菌株。A. 篩選的菌株；B. 產分泌性淀粉酶菌株。圖鯽魚腸道菌株篩選和產酶菌株分析Fig.1 Screening of strains from the intestinal tract of carp andanalysis of amylase-producingstrains菌株R/r菌株R/rF23.25±0.11F441.43±0.09F142.12±0.08F451.50±0.13F183.11±0.09F471.84±0.11

14、F251.50±0.04F482.83±0.08F261.33±0.06F511.83±0.12F272.67±0.09F521.81±0.06F282.40±0.15F531.64±0.05F342.01±0.12F541.75±0.06F361.67±0.08F561.79±0.12F372.20±0.16F572.08±0.10F391.17±0.11F581.81±0.07F411.43±0.05F611.92

15、7;0.12F431.70±0.07F622.25±0.07表菌株的R/r比值Table 1 Ratios of transparent circle to colony of 26 amylase-producing strains2010, Vol. 31, No. 11食品科學生物工程1802.3菌株分類分析使用PC R 方法，利用基因組D NA 為模板，獲得菌株16S rDNA ，通過測序確定菌株16S rDNA 序列，結合生理生化指標確定菌株類別。使用BLAST 程序將各序列在NCBI 網站的比對結果顯示：F1 (781bp與菌株Aeromonas media s

16、train 480a的16S 核糖體序列相似性是100%；F2 (1348bp與菌株Aeromonas veronii strain 457c的序列相似性最高，達到99%；F 6(965b p 與菌株Aeromonas hydrophila 的序列相似性最高，達到99%；F14 (1404bp與菌株Aeromonas veronii strain 457c的序列相似性是100%；F 31(655b p 與菌株S h e w a n e l l a p u t r e f a c i e n s C N -32的序列相似性是100%；F 40(548bp與菌株Pseudomonas sp. bf

17、-1的序列相似性是100%。將獲得的序列提交到NCBI 網站，獲得基因序列號(表2 。2.4菌株F2毒性分析選取產酶活性較高的菌株F2進行菌株毒性分析，通過注射不同量的菌株F2，發現注射量達到5×106CFU/尾時，連續記錄30d 未發現有魚死亡，說明該菌是鯽魚腸道非致病性共生菌。2.5菌株F2產分泌性淀粉酶相對酶活力分析由圖24可知，菌株F2液體連續發酵70h 左右達到產酶高峰，其分泌性淀粉酶相對酶活力在pH7、溫度32時，表現出最大酶活力。圖F2相對酶活力測定曲線Fig.2 Determination curve for amylase activity of strain F2

18、120100806040200相對酶活力/%時間/h20406080100討論本實驗從健康鯽魚腸道分離出62株細菌菌株，有18株革蘭氏陽性菌株和44株革蘭氏陰性菌株。鯽魚腸道中，可培養細菌的數目在4×108CFU 以下。當然，腸道細菌數目必然是超過這一數值的，因為還有很多是不可培養的菌株。魚類腸道菌株種類繁多，數量較大。有研究指出，淡水魚腸內細菌的數量基本為105108CFU 13，而海水魚腸內細菌的數量為106108CFU 14。腸道的優勢細菌為革蘭氏陰性菌，同時也存在革蘭氏陽性菌15。本研究對鯽魚腸道菌分析結果與其他魚類腸道研究結論一致。在鯽魚腸道篩選到26株產分泌性淀粉酶菌株，

19、占篩選菌株的41.94%，沒有篩選到產分泌性纖維素酶菌株。產酶菌廣泛存在于海產魚類腸道中，而產酶能力隨著菌株和宿主魚類別的不同而各異16。本研究顯示，在淡水魚中同樣存在大量可產分泌性胞外酶的菌株。對于胞外酶的種類而言，本研究發現，鯽魚腸道存在有41.94%的產分泌性淀粉酶菌株，這與鯽魚對碳水化合物的需求有關，其飼料中淀粉含量較高。在鯽魚腸道內未發現產分泌性纖維素酶的菌株，這與鯽魚的攝食習性是相關的。纖維素酶是一類非消化道酶，它主要依賴于動物消化道內的微生物分泌產生17，Saha 等18使用草和纖維素含量為20%的配合飼料分別飼喂鯪魚來分析其腸道產分泌性纖維素酶的菌株后發現，投喂草的魚腸道菌株命

20、名相近種屬(相似度 NCBI 序列號F1Aeromonas sp. F1Aeromonas media (100%FJ796227F2Aeromonas sp. F2Aeromonas veronii (99%FJ796224F6Aeromonas sp. F6Aeromonas hydrophila (99%FJ796226F14Aeromonas sp. F14Aeromonas veronii (100%FJ796225F31Shewanella sp. F31Shewanella putrefaciens (100%F40Pseudomonas sp. F40Pseudomonas s

21、p. (100%表菌株分類分析Table 2 Classification of strains注：. 序列未提交。圖值對F2相對酶活力的影響Fig.3 Effect of pH value on the amylase activity of strain F2120100806040200相對酶活力/%pH24681012圖溫度對F2相對酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the amylase activity of strain F2120100806040200相對酶活力/%溫度/20406080181生物工程食品科學2010, Vol. 31,

22、 No. 11內分泌性纖維素酶菌株比投喂配合飼料的明顯增多。這說明魚類腸道產分泌性酶類的細菌種類和數量隨著魚類攝食習慣的不同而各異。16S rDNA 基因序列檢測分析顯示，所分析菌株分別屬于Aeromonas 、Shewanella 、Pseudomonas 等屬。不同種類的魚，由于生活的環境和飲食特征各不相同，其腸道菌群構成也各異。淡水魚類腸道內的好氧和兼性厭氧細菌以Aeromonas 、Enterobacteriaceae 等為主13。本實驗對鯽魚腸道菌群的分析也顯示出Aeromonas 是其腸道的優勢菌。本實驗獲得了一株非致病性產淀粉酶活性較高菌株F2，屬于Aeromonas ，其分泌性

23、淀粉酶在pH7、溫度32時表現出最大酶活力，符合魚體腸道的一般微生態環境條件。該菌株具有被用于開發微生態制劑和疫苗合二為一的新型制劑共生菌活載體疫苗的潛力。隨著對濫用抗生素危害性認識的深入，人們開始研究更加有效且無害的病害防治方法，疫苗就是一個很好的選擇19-21。產消化酶的非致病性共生菌可以將微生態制劑和疫苗的開發合二為一，具有開發潛力。參考文獻：1MUNRO P D, BARBOUR A, BIRKBECK T H. Comparison of the gutbacterial flora of start feeding larval turbot rearedunder differe

24、nt conditionsJ. J Appl Bacteriol, 1994, 77(5 : 560-566.2NICOLAS J L, ROBIC E, ANSQER D. Bacteial flora associated with atropic chain consisting of microalgae rotifersand turbot larvae: influencesof bacteria on larval survivalJ. Aquaculture, 1999, 83: 237-248.3NOONAN B, ENZMANN P J, TRUST T J. Recomb

25、inant infectioushematopoietic necrosis virus and viral hemorrhagic septicemia virusglycoprotein epitopes expressed in Aeromonas salmonicida induceprotective immunity in rainbow trout (Oncorhynchus mykissJ. ApplEnviron Microbiol, 1995, 61(10: 3586-3591.4ZHU Kailing, CHI Zhenming, LI Jing, et al. The

26、surface display ofhaemolysin from Vibrio harveyi on yeast cells and their potentialapplications as live vaccine in marine fishJ. Vaccine, 2006, 24(35/36:6046-6052.5張應玖, 朱學軍, 關鍵, 等. 一種新型淀粉酶的鑒定及其產酶菌株的篩選J. 微生物學通報, 2002, 29(5: 38-41.6齊云, 陳飛, 袁月祥, 等. 一株能分解纖維素的高溫耐堿放線菌J.應用與環境生物學報, 2003, 9(3: 322-325.7周德慶.

27、微生物實驗手冊M. 上海: 上海科學技術出版社, 1986: 65-70; 178-180.8布坎南 R E,吉本斯 N E. 伯杰細菌鑒定手冊M. 北京: 科學出版社, 1984.9東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊M. 北京: 科學出版社, 2001.10李莉. 草魚腸道菌群的變化和免疫機能的關系D. 武漢: 華中農業大學, 2003.11王福榮, 唐景春. 耐高溫-淀粉酶活力測定法的研究J. 食品與發酵工業, 1995(2: 27-30.12林劍, 鄭舒文, 孫利芹. 溫度和pH 值對耐高溫-淀粉酶活力的影響J. 中國食品添加劑, 2003(5: 65-67.13SUGITA H, OSHIMA K, TAMURA M. Bacterial flora in thegast