1、埃博拉出血熱實驗室檢測方案（第三版） 埃博拉出血熱是一種嚴重的急性傳染病，可發生人-人傳播和院內感染,病死率高。直接接觸傳播是本病最主要的傳播途徑。可以通過接觸病人或被感染動物的體液、分泌物、排泄物及其污染物等而感染。埃博拉出血熱的早期臨床表現和其他一些病毒性出血熱相似，需要通過實驗室進行確診。在目前階段，以對病人血液標本檢測為主。為及時檢測和確認埃博拉出血熱病例，規范實驗室檢測程序，提高檢測質量，為指導病例的管理和出院提供依據，特制定本方案。一、   檢測對象包括留觀病例、疑似病例和確診病例，病例定義參見國家衛生計生委制定的埃博拉出血熱相關病例診斷和處

2、置路徑。二、標本采集、保存和運輸（一）標本采集用分離膠無菌真空促凝管采集靜脈血，每管3mL，標記后4保存，填寫標本采集登記表（附表1）。留觀病例、疑似病例采集發病3日后靜脈血2管，送具有埃博拉出血熱檢測資質的實驗室進行埃博拉病毒檢測；確診病例采集恢復期血標本，送國家疾控中心病毒病所進行檢測。（二）標本保存、運送未分離血清的全血標本應4保存，并盡快送具有埃博拉出血熱檢測資質的實驗室分離血清、檢測；血清標本長期保存應置于-70或以下冰箱，1周內保存可置-20冰箱。標本運輸應按照相關生物安全規定，采取A類包裝，低溫冷藏運輸，避免反復凍融（附件1）。三、檢測內容 埃博拉病毒核酸檢測、埃博拉病

3、毒抗原檢測和IgM、IgG抗體檢測。四、實驗室檢測方法（一）病原學檢測1核酸檢測：是目前早期診斷、早期發現埃博拉出血熱病例的主要檢測方法。為提高檢測的敏感性和特異性，用實時熒光PCR 方法針對埃博拉病毒2個不同的基因進行檢測，在病例篩查時，任一基因檢測陽性均可判為埃博拉病毒陽性；在確診病例出院時，需針對2個基因的檢測同時陰性，方可判定為陰性（附件2）。傳統RT-PCR因易出現污染，較少使用，但可以獲得病毒基因序列。發病后3天內，患者血標本中埃博拉病毒核酸檢出率低，檢測陰性不能排除埃博拉病毒感染，應結合病例的流行病學史和臨床表現進行綜合判斷。發病后310天血標本病毒核酸檢出率高。2. 病毒抗原檢

4、測：用酶聯免疫法檢測埃博拉病毒抗原。病毒抗原檢測陽性可確診（附件3）。發病后3天內，血標本中埃博拉病毒抗原檢出率低，檢測陰性不能排除埃博拉病毒感染，發病后310天血標本病毒抗原檢出率高。（二）血清學檢測1. 血清特異性IgM抗體：采用捕獲法ELISA方法檢測。IgM抗體陽性可確診（附件4）。2.血清特異性IgG抗體：目前采用間接法ELISA檢測IgG抗體。單份血清埃博拉病毒IgG抗體陽性提示曾感染埃博拉病毒，雙份血清埃博拉病毒IgG抗體陽轉或恢復期滴度較急性期4倍或者以上增高者可確診（附件5）。（三）結果的報告、復核和反饋埃博拉病毒檢測機構應將所有陽性和部分陰性血清標本送中國疾病預防控制中心病

5、毒病所進行復核檢測。實驗室檢測結果應及時反饋標本送檢單位，并盡快上報上級主管部門（附表2）。五、生物安全按照病原微生物實驗室生物安全管理條例等相關規定要求，做好生物安全工作。（一）實驗室檢測1凡涉及埃博拉病毒的分離、培養和動物實驗，需在生物安全4級（BSL-4/ABSL-4）實驗室內進行。涉及未經培養有感染性材料的實驗活動，需在BSL-3實驗室內進行。血清學檢測應在BSL-3實驗室內進行，且標本應首先601小時滅活，再進行后續實驗操作。核酸檢測時,需在BSL-3實驗室生物安全柜內將核酸提取裂解液加入標本中,充分裂解后，完成病毒RNA提取。對裝有病毒RNA的樣品管外表面進行徹底消毒后，可在BSL

6、-3實驗室以外進行擴增檢測。2在進行感染性材料操作時，每次標本份數不宜過多，每份標本量不宜過大。（二）生物安全防護在實驗室處理感染性標本時，應嚴格按照操作規范在BSL-3實驗室內進行。實驗室工作人員應穿著遮蓋全身的個人防護裝備，包括防滲漏防護服、N95或以上口罩、護目鏡、防護面具、防護手套等，當需進行感染性標本離心、較大量標本（10 mL）分裝處理等操作時應使用正壓頭盔。實驗人員有體表開放式傷口時不宜參加實驗活動。涉及感染性材料的離心應使用有密封蓋的離心桶或轉頭進行標本離心，應在生物安全柜內打開離心轉頭放入或取出裝有標本的離心管。在標本的采集、包裝和實驗室檢測等過程中所產生的醫療廢物，可能具有

7、生物危險性，應當按照醫療廢物管理條例和醫療衛生機構醫療廢物管理辦法等相關規定及時處理。實驗室檢測埃博拉病毒相關感染性標本的實驗活動發生意外時，應及時啟動相關應急預案（附件6）。附件：附件1.埃博拉出血熱相關標本采集、包裝、運輸技術指南附件2埃博拉病毒核酸檢測方法附件3埃博拉病毒核蛋白抗原檢測方法（雙抗體夾心法ELISA）附件4埃博拉病毒IgM抗體檢測方法（抗體捕捉法ELISA）附件5埃博拉病毒IgG抗體檢測方法（間接法ELISA）附件6.埃博拉出血熱相關標本實驗活動意外應急預案附表：附表1埃博拉出血熱送檢材料一覽表附表2埃博拉出血熱實驗室檢測結果一覽表附件1埃博拉出血熱相關標本采集、包裝、運輸

8、技術指南埃博拉出血熱(Ebola hemorrhagic fever)是由埃博拉病毒(Ebola virus)引起的一種急性出血性傳染病。人主要通過接觸病人或感染動物的體液、分泌物和排泄物等而感染，臨床表現主要為突起發熱、出血和多臟器損害，病死率可高達50%-90%。本病潛伏期為221天，通常為810天。2014年，在幾內亞、利比里亞和塞拉利昂等西非國家發生歷史上最嚴重的埃博拉出血熱暴發疫情。為指導醫療機構和疾病預防控制機構工作人員對埃博拉出血熱相關標本的采集、包裝和運輸工作，保證生物安全，特制定本指南。一、生物安全防護1、所有樣本的采集或處理應遵守醫院感染管理規范和病原微生物實驗室生物安全管

9、理條例等相關生物安全規定，在標準預防的基礎上采用飛沫和接觸隔離的預防措施。2、采集樣本時，應嚴格按照BSL-3級實驗室規定做好個人防護。應穿戴醫用防護服、可遮蓋口鼻的醫用防護口罩(N95)、戴雙層防護手套、護目鏡、防護面具、鞋套或橡膠靴等。二、標本采集（一）采集時間一般發病后2周內，可在患者血標本中檢測到病毒核酸和抗原，發病后310天的標本核酸和抗原的檢出率高。在發病后數月內，可在特定分泌物中持續檢出病毒。最早可從發病后2天的患者血清中檢出特異性IgM抗體，IgM抗體可維持數月。發病后7-10天可檢出IgG抗體，康復者IgG抗體可維持數年。發病10-14天以后的標本病毒特異性抗體的檢出率高。因

10、此，應根據不同檢測目的確定采樣時間，留觀病例、疑似病例診斷埃博拉病毒感染應采集發病3天以后的血標本。（二）標本采集1. 采血場所除了病人常規護理的材料外，應備有手套、防護服和防護面具等，同時備有洗手的設施和裝有消毒液的桶。2.采集埃博拉出血熱患者血樣會給醫護人員帶來風險，應由經過生物安全防護培訓的人員執行，采血時應2人在場。3.采用分離膠無菌真空促凝管采集靜脈血，每管3mL，采集后用封口膜封閉管口，標記清楚后放入自封袋或50mL離心管內，并在自封袋或離心管外表面再清楚標記，4保存，填寫標本采集登記表。4、留觀病例和疑似病例應在發病3天后，采集靜脈血2管，送指定的具有埃博拉出血熱檢測資

11、質的實驗室進行埃博拉病毒檢測。5、確診病例采集恢復期血標本，包括并不限于出院前標本2份，每份2管，采集時間間隔不少于48小時，送國家疾控中心病毒病所進行埃博拉病毒檢測，用于指導病例管理。四、標本包裝、運輸（一）所有疑似埃博拉病毒相關感染性標本的運輸應按照病原微生物實驗室生物安全管理條例和人間傳染的病原微生物名錄等相關規定，采取A類包裝，符合UN2814要求。按照三重包裝系統包裝：第一層包裝為自封袋或50mL離心管；第二層包裝為防水、防漏的安全殼容器；第三層為運輸包裝組成。樣本應用吸水紙等包裹，固定在防漏自封袋或離心管內。然后放置在堅固、防水、防漏的第二層安全殼容器中，用吸水紙等填充物將內有標本

12、的自封袋或離心管固定好，然后裝入第三層包裝。安全殼容器和外包裝須與IATA危險物品條例包裝制度650相符合。（二）填寫標本說明兩份，寫明標本的詳細情況、運送者及接收者地址，將標本說明密封在塑料袋里，用膠布分別粘在外層包裝的里面和外面并留檔以便追蹤，方便實驗室操作人員查對標本數量。（三）樣本運輸之前，應按相關生物安全規定和樣本接收單位生物安全管理部門聯系，辦理相關手續，運送日期確定后立即將運送的時間和運輸方式通知接收單位。五、樣本保存和銷毀（一）埃博拉病毒陽性血標本，應根據病原微生物實驗室生物安全管理條例等相關生物安全規定保存，實行“雙人雙鎖”和取樣“審批”管理。（二）埃博拉病毒陰性血標本，應在

13、排除埃博拉病毒感染后，轉入其他血清庫保存或銷毀。（三）所有感染性血清銷毀時，均應在在生物安全柜內待其自然融化，60 1小時滅活后，在生物安全柜內，打開樣本管，置于有效消毒劑內浸泡，然后高壓滅活。（四）所有銷毀樣本均應在相應數據庫清單內標明，并記錄銷毀的時間和操作人，陰性樣本銷毀記錄應保存1年以上，陽性樣本的銷毀記錄應保存5年以上。附件2埃博拉病毒核酸檢測方法1目的埃博拉病毒核酸的提取及PCR檢測。2 適用范圍適用于檢測血標本中埃博拉病毒核酸。3 實驗前準備核對被檢樣品，包括患者的姓名、編號及檢測項目等。4檢測儀器設備和材料實時定量核酸擴增檢測儀，常規核酸擴增檢測儀

14、，RNA提取試劑盒，一步法RT-PCR擴增試劑盒，一步法實時定量RT-PCR擴增試劑盒等。5實驗步驟5.1實驗準備5.1.1提取埃博拉病毒RNA要求在BSL-3級實驗室內操作。5.1.2進入實驗場所之前，要事先準備好所需試劑、樣品。預約實驗場所。5.2 RNA的提取使用QIAampViral RNA Mini試劑盒提取血清標本中病毒RNA（使用其他試劑盒或方法提取病毒RNA的應參照相應試劑盒說明書或實驗室操作手冊）。5.2.1吸取560l包含載體RNA的AVL緩沖液(核酸提取裂解液)至1.5ml的離心管中。5.2.2向上述的液體中加入140l樣品，蓋好蓋后，輕輕的上下顛倒混勻10次，

15、室溫孵育10分鐘，簡單離心使離心管頂端液體落到底部。5.2.3在樣品中加入560l  96100的乙醇，輕輕的上下顛倒混勻10次，再簡單離心。5.2.4小心將630l液體加入QIAamp小柱中，蓋好蓋，8000rpm/min離心1min,棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。5.2.5打開QIAamp小柱的蓋子，重復步驟5.2.4，直至完成全部樣品離心。5.2.6打開蓋子，向柱中加入500l AW1 緩沖液，蓋好蓋，8000rpm/min離心1min，棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。5.2.7打開蓋子，加入500lAW2 緩沖液，蓋好蓋

16、，14000rpm/min離心3min。5.2.8將柱子置于一新的2ml收集管上，空離1min。5.2.9將柱子置于一新的1.5ml離心管上，加入50l AVE洗脫緩沖液，室溫孵育1min,離心8000rpm/min 1min。離心液即為病毒RNA，立即檢測或-70以下保存。5.3實時熒光定量RT-PCR法檢測埃博拉病毒核酸為增加埃博拉病毒核酸檢測的敏感性和特異性，在用實時熒光定量 PCR 方法對標本進行檢測時，應采用針對埃博拉病毒2個不同的基因同時進行檢測，可采用并行的單重PCR或多重PCR方法進行檢測。5.3.1單重PCR參考引物與探針引物/探針序列熒光標記檢測埃博拉病毒核蛋白的引物和探針

17、ZEBONP-FCGCCGAGTCTCACTGAATCTGZEBONP-RAGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGTZEBONP-PCGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAFAM/BHQ-1檢測埃博拉病毒糖蛋白的引物和探針ZEBOGP-FTGGGCTGAAAAYTGCTACAATCZEBOGP-RCTTTGTGMACATASCGGCACZEBOGP-PCTACCAGCAGCGCCAGACGGFAM/BHQ-1 實時熒光定量RT-PCR擴增實時熒光定量RT-PCR擴增反應配置體系：RNA模板5µl，酶（25x）1µl，緩沖液12.5

18、81;l，引物（10µM）各1µl，探針（10µM）0.5µl，加水至總體積25µl。推薦反應條件為5030min，9510min，9515s、6045s反應40個循環。 結果判斷以定量熒光PCR反應的前315個循環的熒光信號作為本底信號，以本底信號標準差的10倍作為熒光閾值，標本擴增產生的熒光信號達到熒光閾值時所對應的循環數為循環閾值（Ct值），以Ct<35熒光信號數據線性化處理后對應循環數生成的曲線圖成“S”形的標本，可判斷為相應的埃博拉病毒核酸檢測陽性。 意義熒光定量PCR是一種靈敏、特異、低污染的病毒核酸檢測方

19、法，可以檢測標本中的埃博拉病毒。病例篩查時2個檢測基因中，任一基因檢測陽性均具有確診意義。首例病例確診應按照國衛發明電201448號埃博拉出血熱病例診斷程序進行。在病例管理時，需2個基因同時檢測陰性，方可判定為陰性。5.4一步法常規RT-PCR方法檢測埃博拉病毒核酸如果采用常規RT-PCR的方法檢測埃博拉病毒核酸，建議針對病毒基因組2個不同的基因片段同時進行檢測,并完成基因序列分析。 參考引物序列引物序列片段大小  檢測埃博拉病毒糖蛋白的引物ZEBOV-GPFTGGGCTGAAAACTGCTACAATC ZEBOV-GPRTTTTAGTTTCCCAGAA

20、GGCCCA570bp 檢測埃博拉病毒RNA聚合酶的引物 ZEBOV-LF1ATCGGAATTTTTCTTTCTCATT ZEBOV-LR1ATGTGGTGGGTTATAATAATCACTGACATG414bp ZEBOV-LF2GTCAAAGCATTTCCTAGCAACATGATGG ZEBOV-LR2ATAATAATCACTCACATGCATATAACA282bp 5.4.2 PCR擴增采用參考引物對埃博拉病毒不同檢測靶標進行PCR擴增。首先根據所采用的試劑盒說明書推薦反應條件，將病毒RNA逆轉錄為cDNA。PCR擴增參考反應條件

21、為94預變性2min，然后  94變性30s，55退火30s， 72延伸1min，反應40個循環，最后72延伸10min。如為套式PCR則開展第二輪擴增。第二輪分型PCR擴增體系配置采用正向引物ZEBOV-LF2與反向引物ZEBOV-LR2。推薦反應條件為 94預變性2min，然后 94變性30s，55退火30s， 72延伸1min，反應30個循環，最后72延伸10min。5.4.3 1.5%濃度瓊脂糖電泳分析。5.4.4 結果判讀a陽性：電泳顯示相應大小DNA片段。b陰性：無特異性核酸片段擴增。5.4.5 意義陽性結果可以初步判斷埃

22、博拉病毒感染,排除交叉污染。獲得病毒特異性基因序列具有確診意義。6清場與消毒6.1 操作結束后，及時清理生物安全柜內的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。6.2 未使用完的感染性生物材料銷毀或放入BSL-3級實驗室70冰箱，并如實填寫操作和處理記錄。6.3 實驗區內的污染材料高壓處理（121高壓20min）后，再進行集中高壓處理。附件3埃博拉病毒核蛋白抗原檢測方法（雙抗體夾心法ELISA）1 目的雙抗體夾心法ELISA檢測血清中埃博拉病毒核蛋白抗原。2 適用范圍適用于人血清中埃博拉病毒核蛋白抗原的檢測

23、。3 實驗前準備3.1 核對被檢樣品，包括患者的姓名、編號及檢測項目等。3.2檢測前將60 1小時滅活的待測樣品置于BSL-3實驗室生物安全柜內。3.3在洗扳機廢液收集桶內加入10%有效氯的消毒劑，加入量為廢液桶總體積的5% 。4 檢測項目本方法檢測項目為檢測血清中埃博拉病毒核蛋白抗原。5 檢測儀器設備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長450nm的酶標儀、埃博拉病毒抗原檢測試劑盒（雙抗體夾心法ELISA）。6操作步驟（具體請參照試劑盒說明書開展）6.1 將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30分鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。6

24、.2 配液：將新鮮配制的注入洗板機的洗液桶內。6.3 編號：將樣品對應微孔板編號，每板設陰性對照3孔，模擬陽性對照2孔和空白對照1孔。6.4 加稀釋液：每孔加稀釋液20µL，空白孔除外。6.5 加樣：分別在相應孔加入待測樣品或陰陽性對照各100µL，空白孔除外。6.6 溫育：用封板膜封板后，置37溫育60分鐘。6.7 加酶：每孔加酶標試劑50µL，空白孔除外，輕輕震蕩混勻。6.8 溫育：用封板膜封板后，置37溫育30分鐘。6.9 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍。6.10顯色：每

25、孔加入顯色劑A、B液各50µL，輕輕震蕩混勻，37避光顯色30分鐘。6.11測定：每孔加終止液50µL，10分鐘內測定結果。設定酶標儀波長于450nm處（建議使用雙波長450nm/600-650nm檢測），用空白孔調零后測定各孔A值。6.12清洗、消毒洗扳機：按洗扳機內置程序分別采用蒸餾水、乙醇和75%乙醇進行清洗消毒，30分鐘后，再用蒸餾水清洗。7結果判定7.1 臨界值計算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值（陰性對照孔A值低于0.05者以0.05計算）。7.2 陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A0.1。7.3 陽性對照的正常值范圍：A0.

26、50。7.4陽性判定：樣品A值臨界值者為埃博拉病毒抗原陽性。7.5陰性判定：樣品A值臨界值者為埃博拉病毒抗原陰性。8意義陽性結果可以判斷為埃博拉病毒感染，但陰性結果并不排除埃博拉病毒感染的可能，應結合病例的流行病學史和臨床表現進行綜合判斷。9 清場與消毒9.1 操作結束后，及時清理生物安全柜內的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。9.2 將未使用完的感染性生物材料銷毀或放入BSL-3級實驗室70冰箱，并如實填寫操作和處理記錄。9.3 將實驗區內的污染材料高壓處理（121高壓20min）后，再進行集中高壓處理。附

27、件4埃博拉病毒IgM抗體檢測（抗體捕捉法ELISA）1 目的檢測埃博拉病毒特異性IgM抗體。2 適用范圍適用于人血清中埃博拉病毒特異性IgM抗體的檢測。3 樣品接收和準備3.1核對被檢樣品，包括患者的姓名、編號及檢測項目等。3.2檢測前應將60 1小時熱滅活的待測樣品置于BSL-3實驗室生物安全柜內。3.3在洗扳機廢液收集桶內加入10%有效氯的消毒劑，加入量為廢液桶總體積的5% 。4 檢測項目本方法檢測項目為檢測血清中病毒特異性IgM抗體。5 檢測儀器設備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長450nm的酶標儀、埃博拉病毒IgM

28、抗體檢測試劑盒等。6檢測步驟（具體請參照試劑盒說明書開展）：6.1 將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30分鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。6.2 配液：將新鮮配制的注入洗板機的洗液桶內。6.3加稀釋液：每孔加入樣品稀釋液100l，空白及陰陽性對照孔除外。6.4加樣：在相應孔中加入待測樣品10µl，輕輕振蕩混勻。陰、陽性對照加100µl。6.5溫育：用封板膜封板后，置37溫育30分鐘。6.6洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍。6.7加酶：每孔加入酶標試劑100l，空白孔除外。6.8溫育：操作同6.5。6.9洗板：操作同6.6。6.10顯色：每孔加入顯色

29、劑A、B液各50µl，輕輕振蕩混勻，37避光顯色15分鐘。6.11測定：每孔加終止液50µl，輕輕振蕩混勻，10分鐘內測定結果。設定酶標儀波長于450nm處，用空白孔調零點后測定各孔A值。6.12清洗、消毒洗扳機：按洗扳機內置程序分別采用蒸餾水、乙醇和75%乙醇進行清洗消毒，30分鐘后，在用蒸餾水清洗。7結果判定7.1 臨界值計算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值（陰性對照孔A值低于0.05者以0.05計算）。7.2 陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A0.1。7.3 陽性對照的正常值范圍：A0.50。7.4陽性判定：樣品A值臨界值者為埃博拉

30、病毒IgM抗體陽性。7.5陰性判定：樣品A值臨界值者為埃博拉病毒IgM抗體陰性。8意義陽性結果可以判斷為埃博拉病毒感染，但陰性結果并不排除埃博拉病毒感染的可能，應結合病例的流行病學史和臨床表現進行綜合判斷。9 清場與消毒9.1 操作結束后，及時清理生物安全柜內的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。9.2 未使用完的感染性生物材料銷毀或放入BSL-3級實驗室70或以下冰箱，并如實填寫操作和處理記錄。9.3 將實驗區內的污染材料高壓處理（121高壓20min）后，再集中高壓處理。附件5埃博拉病毒IgG抗體檢測方法（

31、間接法ELISA）1 目的檢測埃博拉病毒特異性IgG抗體。2 適用范圍適用于人血清中埃博拉病毒特異性IgG抗體的檢測。3 實驗前準備3.1核對被檢樣品，包括患者的姓名、編號及檢測項目等。3.2檢測前應將60 1小時熱滅活的待測樣品置于BSL-3實驗室生物安全柜內。3.3在洗扳機廢液收集桶內加入10%有效氯的消毒劑，加入量為廢液桶總體積的5% 。4 檢測項目本方法檢測項目為檢測血清中埃博拉病毒特異性IgG抗體。5 檢測儀器設備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長450nm的酶標儀、埃博拉病毒IgG抗體檢測試劑盒等。6 

32、檢測步驟（具體請參照試劑盒說明書開展）6.1 將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30分鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。6.2 配液：將新鮮配制的注入洗板機的洗液桶內。6.3加稀釋液：每孔加入樣品稀釋液100l，空白孔除外。6.4加樣：在相應孔中加入待測樣品或陰、陽性對照10µl，輕輕振蕩混勻。6.5溫育：用封板膜封板后，置37溫育30分鐘。6.6洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍。6.7加酶：每孔加入酶標試劑100l，空白孔除外。6.8溫育：操作同6.5。6.9洗板：操作同6.6。6.10顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50µl，輕輕振蕩混勻，37避光顯

33、色15分鐘。6.11測定：每孔加終止液50µl，輕輕振蕩混勻，10分鐘內測定結果。設定酶標儀波長于450nm處，用空白孔調零點后測定各孔A值。6.12清洗、消毒洗扳機：按洗扳機內置程序分別采用蒸餾水、乙醇和75%乙醇進行清洗消毒，30分鐘后，在用蒸餾水清洗。7結果判定7.1 臨界值計算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值（陰性對照孔A值低于0.05者以0.05計算）。7.2 陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A0.1。7.3 陽性對照的正常值范圍：A0.50。7.4陽性判定：樣品A值臨界值者為埃博拉病毒IgG抗體陽性。7.5陰性判定：樣品A值臨界值者為埃

34、博拉病毒IgG抗體陰性。8意義陽性結果，表明曾受到埃博拉病毒感染；雙份標本檢測，恢復期血清抗體陽轉，或抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍及以上升高可判定埃博拉病毒感染。9 清場與消毒9.1 操作結束后，及時清理生物安全柜內的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。9.2 未使用完的感染性生物材料銷毀或放入BSL-3級實驗室70及以下冰箱，并如實填寫操作和處理記錄。9.3 將實驗區內的污染材料高壓處理（121高壓20min）后，再集中高壓處理。附件6埃博拉出血熱相關標本實驗活動意外應急預案1 總則1.1目的為有

35、效預防、及時發現和控制發生在實驗室范圍內的埃博拉病毒相關實驗活動意外，最大限度的減輕意外事件對實驗室人員和環境造成的危害，指導和規范生物安全工作，保障實驗室工作人員身體健康和環境安全，保障埃博拉病毒實驗室相關檢測活動的順利進行，特制定本預案。本預案為發生實驗室意外時的一般處置辦法，各單位可根據各自生物危害評估方案確定處置措施。1.2編制依據中華人民共和國傳染病防治法。突發公共衛生事件應急條例。實驗室生物安全手冊（第三版）。1.3原則以“安全第一、預防為主”為應急處置原則。1.4適用范圍發生以下緊急情況時啟動本預案1.4.1埃博拉病毒的實驗室污染事件。1.4.2工作人員發生埃博拉病毒實驗室暴露。

36、1.4.3埃博拉病毒被泄露出實驗室。1.4.4由于停電、火災等不可預測因素所引起的實驗室其他污染事件。2  應急組織體系及職責2.1 應急指揮機構在本單位生物安全委員會或相應部門的統一領導下，各行政職能部門配合下，生物安全管理部門負責組織、協調實驗室意外突發事件的應急處理工作，并制定應對意外事故的應急預案。2.2實驗室管理部門單位實驗室管理部門應制定本部門的應對意外事故處理的應急預案，并開展生物安全培訓，組織實驗室相關人員進行實地演練。2.3實驗室負責人實驗室負責人應對急救用品進行檢查和補充，組織實驗室內部人員進行生物安全培訓與考核。3預防和預警機制3.1預防3.

37、1.1加強實驗室生物安全規范化操作管理，按實驗室生物安全通用要求（GB19489-2008)做出明確規定。3.1.2建立實驗室應急物資和設備的儲備，配置個人防護、消毒藥品和醫療救援藥品，定點存放和定人定期維護保養。3.1.3埃博拉病毒相關感染性材料需登記使用，提高警惕，加強安全保衛，防止埃博拉病毒相關感染材料失竊。3.1.4建立實驗室工作人員健康檔案，定期體檢。發現與實驗室生物安全有關的人員感染或傷害應立即報告。3.1.5加強對實驗操作人員的生物安全業務培訓和演練。3.2預警3.2.1建立有效的預警機制，為埃博拉病毒相關感染性材料建立檔案和使用記錄，發現失竊，立即報告（見處理程序）。3.2.2

38、完善實驗室人員健康檔案，發現與實驗室生物安全有關的人員感染或傷害立即報告。3.2.3定期開展自查，及時發現各類安全隱患，發出預警通報。4.突發事件的報告及應急響應4.1報告人4.1.1實驗室工作人員為法定報告人。4.1.2除實驗室工作人員外，任何單位和個人如發現有實驗室感染事故均可報告。4.1.3任何單位和個人不得隱瞞、緩報、謊報、或者授意他人隱瞞、緩報、謊報。4.2報告程序和方式4.2.1報告程序：發生實驗室意外事故時，在妥善處理的同時，向實驗室負責人口頭報告，實驗室負責人應立即向單位生物安全管理部門和負責人報告，并如實填寫事故記錄和事故處理記錄。單位生物安全管理部門核實事故后2小時內向上級

39、衛生主管部門進行匯報，對事故做出危險程度評估，對可能暴露人員進行評估和隨訪。積極配合有關專業技術部門的調查和處置。事故處理后，生物安全管理部門應及時對事故的經過以及事故的原因和責任進行實事求是的分析，找出事故的根源，總結教訓寫出書面總結，吸取經驗教訓。4.2.2報告方式發生實驗室意外事故后，實驗室所在單位負責人應填報實驗室意外和事故登記表，并以最快的通訊方式2小時內向上級衛生行政部門報告。4.3突發事件應急響應。4.3.1立即停止發生意外事故實驗室的實驗活動，妥善處理后退出實驗室。4.3.2立即組織專家進入實驗室進行調查、評估。4.3.3對可能的污染情況進行評估。4.3.4如發生實驗室感染事故

40、，立即將被感染人員送定點醫院進行醫療觀察或預防性治療，對可能受到感染的人員進行評估和隨訪；暫停該實驗室所有實驗活動，開展調查評估，對所有實驗室人員進行生物安全培訓，完善生物安全體系文件，待潛在危險排除后，方可重啟實驗活動。5應急處理程序5.1由于人員活動造成的意外事故處理方法BSL-3實驗室意外事故發生后，應立即報告監控室，由監控室通知生物安全員，安全員對事件初步評估判斷后，立即報告實驗室主任，實驗室主任了解情況后報告單位生物安全委員會或相應部門，如需要，打電話120請求急救，送定點醫院處理。5.1.1感染性銳器意外刺傷或擦傷a.發生具有潛在感染性的銳器刺傷、切割傷或擦傷等情況，被視為有極大危

41、險。b.實驗人員立即停止工作，同行操作者及時向監控室報告。監控人員接報后，應立即報告實驗室主任和單位負責人，實驗室主任評估后，決定是否呼叫120請求急救或采取其他便捷方式，送定點醫院處理，并做好相應準備。c.受傷實驗人員脫掉最外層手套，在同操作者的配合下用生理鹽水沖洗傷口。d.使用大量流水盡可能沖掉損傷部位的血液，從急救箱取出急救藥品再行包扎。e.傷口進行適當的包扎后，在同行操作者的配合下，按照生物安全三級實驗室安全手冊的程序退出實驗室。f.由 120急救車或其他安全便捷交通方式，送定點醫院急救室，告知醫生所受傷的原因及可能污染埃博拉病毒，根據情況進行醫學處理，并留院觀察。g.住院后

42、，和同行的另一名操作者一起，記錄受傷原因、可能接觸的病原微生物，并保留完整的醫療記錄。5.2在實驗室內操作人員突然暈倒的急救5.2.1另一名操作人員立即停止工作。5.2.2向監控室報告，請求人員進入第二緩沖間做好準備工作，外部人員做好救助準備。5.2.3同行操作人員更換一副新手套，將暈倒的人員扶到坐的姿勢，讓暈倒的人員的背和頭靠在救護者的胸前，救護者的雙手和胳膊架在暈倒的人的腋下，在保證無障礙的情況下，將暈倒的人拖到第二緩沖間，脫掉防護眼罩、口罩，盡可能脫掉防護服（包括暈倒的人和自己的防護服）。外邊進入人員幫助將暈倒的人搬出實驗室。5.3感染性樣品外溢到皮膚粘膜5.3.1如感染性材料外溢到皮膚

43、，視為很大危險，應立即停止工作，在另一操作者的配合下對受溢灑的皮膚，采用75%的酒精進行消毒處理，然后用大量清水或肥皂水徹底沖洗。5.3.2處理后安全撤離，密切觀察3周。5.3.3填寫意外事故報告，并報相關負責人。5.4感染性物質濺入眼睛：5.4.1眼睛濺入感染性液體，在另一操作者的配合下，用洗眼器進行沖洗，然后用生理鹽水或清水沖洗，連續沖洗（注意動作不要過猛，以免損傷眼睛）。5.4.2在另一操作者的配合下，按照生物安全三級實驗室安全手冊路線退出實驗室。5.4.3撥打120講明情況，送定點醫院留院觀察。5.4.4填寫意外事故報告，并報相關負責人。5.5衣物污染5.5.1當感染性材料濺灑在防護服

44、時，應停止實驗活動，由另一操作人員立即對污染人員衣物及所處區域噴灑消毒液，30分鐘后，按照BSL-3實驗室退出程序，兩人同時退出實驗室核心區。5.5.2在緩沖間內被污染人員脫掉防護服，防止感染性材料觸及皮膚及進一步擴散。5.5.3撤離實驗室，設立警示標記。5.5.4如果皮膚接觸污染物，立即用自來水沖洗、75%酒精擦拭、沖洗消毒。5.5.5徹底淋浴，出防護區。5.5.6由其他操作人員，穿好個人防護裝備，進入試驗區，處理污染區域，將已污染的防護服裝入垃圾袋中進行高壓滅菌處理。5.5.7用含氯消毒劑消毒發生污染的區域，具體方法見本章節5.7，用含過氧乙酸或過氧化氫的消毒劑進行空間噴灑消毒。5.5.8

45、相關實驗人員應密切觀察3周；如果皮膚接觸到感染性物質，按照5.3處理。5.6外層手套撕破、損壞、被污染或需要更換5.6.1在操作埃博拉病毒相關感染性材料時應該佩戴雙層手套。在操作過程中，外層手套被污染時應立即用含1%有效氯的次氯酸鈉紙巾擦拭手套并脫下后丟棄在生物安全柜中的高壓滅菌袋中，并立即戴上新手套繼續實驗。5.6.2手套的更換：在生物安全實驗室中使用一次性手套，不可再次使用。手套用后進行高壓滅菌消毒然后丟棄。工作人員在完成感染性材料實驗離開生物安全柜之前應該脫去外層手套放入生物安全柜內的高壓滅菌袋中。然后更換新手套，以避免污染其他物品。5.6.3脫手套的過程：用一手捏起另一近手腕部處的手套外緣；將手套從手上脫下并將手套外表面翻轉入內；用戴著手套的手拿住該手套；用脫去手套的手指插入另一手套腕部處內面；脫下該手套使其內面向外并形成一個由兩個手套組成的袋狀；丟棄在高溫消毒袋中并進行消毒處理。  脫下外層手套，丟棄在高壓滅菌袋中。【注意】以上操作要遠離面部。5.7感染性材料