1、實驗一 普通光學顯微鏡的使用及其對微生物一般形態的觀察一、實驗目的1了解普通光學顯微鏡的構造及其各部分的作用。2掌握普通光學顯微鏡的正確使用和維護方法。3通過低倍鏡、高倍鏡觀察藻類、酵母培養液和新鮮活性污泥中微生物的一般形態。二、實驗原理普通光學顯微鏡由機械部分和光學部分組成。圖1-1 雙目生物顯微鏡1機械部分：（1）鏡筒：位于鏡臂上端的空心圓筒，是光線的通道。鏡筒的上端可插入目鏡，下面與轉換器相連。（2）轉換器：位于鏡筒下端，是一個可以旋轉的圓盤。有34個孔，用于安裝不同放大倍數的物鏡。（3）載物臺：載物臺是放置標本的方塊平臺，中央有透光孔，載物臺上面有玻片夾持器，側面有移動手輪，可縱向和橫

2、向移動標本。（4）調焦手輪：包括粗調手輪和微調手輪，可使載物臺上下升降，調節物鏡和標本之間的距離。2光學部分：（1）目鏡：放在鏡筒上，配有10倍（10）、16倍（16）兩種。（2）物鏡：裝在轉換器的孔上，有低倍鏡（4、10）、高倍鏡（40）和油鏡（100），是顯微鏡中最主要的部分。各種鏡頭上都刻有放大倍數和數值孔徑（）及所要求蓋玻片厚度等主要參數。物鏡的性能由數值孔徑決定，并且還依賴于物鏡的分辨率。（3）聚光器：由聚光鏡和孔徑光闌組成。聚光鏡的作用是把光線聚集在標本上，增強照明度。孔徑光闌是用來調節對比度的，使物鏡和聚光器的數值孔徑相符合。當孔徑光闌開啟到物鏡出瞳的7080%時，就可以得到足夠

3、對比度的良好圖象。如果開得太大，超過物鏡的數值孔徑，就會產生光斑；如果開得太小，則分辨率下降，降低物像的清晰度。（4）電光源：在顯微鏡的下部，提供觀察標本時所用光源。三、實驗器材1普通光學顯微鏡（雙目生物顯微鏡）2載玻片、蓋玻片若干3玻璃棒、滴管4濾紙、擦鏡紙5藻類、酵母培養液，新鮮活性污泥四、實驗方法低倍鏡的操作（）首先把目鏡放入鏡筒上，將物鏡（4、10、40、100）旋緊在轉換器上。（2）標本放在載物臺上，用玻片夾持器挾緊。并用移動手輪移動所要觀察的目的物到圓孔的正中央。（）打開電源開關，調整聚光器，使光路對準載物臺中央的光孔，光亮度要適宜。（）旋動轉換器，將10倍物鏡對準光孔。（5）用粗

4、調焦手輪使物鏡與標本距離至最小，同時要側臉觀察，以免壓壞標本玻片或損壞物鏡。（6）調節瞳距。（7）眼睛接近目鏡觀察，左（右）手用移動手輪輕輕移動玻片夾持器，右（左）手用粗調焦手輪將載物臺下移（向內旋轉調焦手輪），如果見到目的物，但不是十分清楚，再用細調焦手輪調節，至目的物清晰為止。（8）如果粗調焦手輪旋得太快，超過焦點，必須從第（5）步重調，不要在正視目鏡的情況下調粗調手輪，防止沒有把握的旋轉使物鏡與載玻片相撞碰壞。注：觀察時兩眼同時睜開，雙眼不感覺疲勞。2高倍鏡的操作（1）使用高倍鏡前，先用低倍鏡觀察（操作方法同低倍鏡的操作）。（2）旋動轉換器，換用高倍鏡（40）觀察，如果高倍鏡觸及載玻片應

5、立即停止旋動，說明原來低倍鏡觀察沒有調準焦距，目的物沒有找到，須用低倍鏡重新調節。如果調節正確，換用高倍鏡時基本可以看到目的物，如果模糊，用微調焦手輪稍微調節一下就清晰可見。3微生物形態觀察取一干凈的載玻片，用滴管或玻璃棒在培養液內沾一滴菌液，用干凈的蓋玻片覆蓋在滴液上（注意不要有氣泡）即成標本片，用低倍鏡和高倍鏡觀察。記錄微生物的形態特征。四、實驗記錄及結果表1-1微生物的形態觀察記錄項 目放大倍數 低倍鏡觀察 高倍鏡觀察五、思考題1鏡檢標本時，為什么要先用低倍物鏡觀察？2畫一個細胞結構的示意圖。實驗二 微生物的計數（酵母菌的顯微鏡直接計數）一、實驗目的1了解并掌握常用的血球計數板的構造。2

6、學會一般的顯微鏡直接計數方法。二、實驗原理測定微生物數量方法很多，通常采用的有顯微鏡直接計數法和平板計數法。鏡檢計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板；一般細菌則采用彼得羅夫霍澤（Petroff Hausser）細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，故細菌不易看清。血球計數板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個方格網（圖2-1）。每個方格網共分9大格，其中間的一大格（

7、稱為計數室）常被用作微生物的計數。計數室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數室是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即每個大方格都由400個小方格組成（圖2-2）。每個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，每個小方格的面積為1400mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數室底部之間的間隙為0.1mm，所以每個計數室（大方格）的體積為0.1mm3。使用血球計數板直接計數時，先要測定每個小方格（或中方格）中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。 圖

8、2-1 血球計數扳的構造a.平面圖（中間平臺分為兩半，各刻有一個方格網)） 圖2-2 血球計數板計數網的分區和分格b.側面圖（中間平臺與蓋玻片之間有0.1毫米的間隙）三、實驗器材1雙目生物顯微鏡1臺2血球計數板1塊3新鮮酵母培養液4蓋玻片、擦鏡紙、濾紙四、實驗方法1取潔凈的血球計數板一塊。2將酵母菌液搖勻，用滴管吸取少許，將菌液直接滴加在計數室上，然后加蓋蓋玻片(勿使產生氣泡)。3靜置約5分鐘，先在低倍鏡下找到計數室后，再轉換高倍鏡觀察計數。4計數時用16中格的計數板，按對角線方位，取左上、左下、右上、右下的4個中格(即100小格)的酵母菌數。如果是25中格計數板，除數上述四格外，還需數中央1

9、中格的酵母菌數(即80小格)。由于菌體在計數室中處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時必須不斷調節微調手輪，方能數到全部菌體，防止遺漏。如菌體位于中格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。5凡酵母菌的芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復分數2次，取其平均值，按下述公式計算出每毫升菌液所含酵母菌細胞數。每毫升菌液含菌數400101000（稀釋倍數）6血球計數板用后，在水龍頭上用水柱沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗凈后自行晾干。表2-1實驗記錄 項目計次各 中 格 菌 數每毫升菌液總菌數1234512平 均五、實

10、驗結果及分析按上面的公式求出每毫升菌液總菌數和平均值，分析產生誤差的原因。實驗三 微生物的大小測定一、實驗目的1.加深幾大類微生物實際大小的概念2.掌握測量微生物的大小（長寬）的一般技術二、實驗原理微生物細胞的大小是微生物重要的形態特征之一，也是分類鑒定的依據之一。由于菌體很小,只能在顯微鏡下來測量。用于測量微生物細胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。目鏡測微尺是一塊圓形玻片，其中央刻有精確等分的刻度。測量時，將其放在目鏡中的隔板上來測量經顯微鏡放大后的細胞物象。由于不同的顯微鏡放大倍數不同，同一顯微鏡在不同的目鏡、物鏡組合下，其放大倍數也不相同，而目鏡測微尺是放在目鏡的隔板上，每格實際表示

11、的長度不隨顯微鏡的總放大倍數的放大而放大，僅與目鏡的放大倍數有關，只要目鏡不變，它就是定值。而顯微鏡下的細胞物象是經過了物鏡、目鏡兩次放大成象后才進入視野的。即目鏡測微尺上刻度的放大比例與顯微鏡下細胞的放大比例不同，只是代表相對長度，所以使用前須用置于鏡臺上的鏡臺測微尺校正，以求得在一定放大倍數下實際測量時的每格長度。三、實驗器材1.雙目生物顯微鏡1臺2.目鏡測微尺1個3.鏡臺測微尺1個4.載玻片、蓋玻片、濾紙5.酵母、綠藻培養液，新鮮活性污泥6.玻璃棒、滴管四、實驗方法1.目鏡測微尺的校正 把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，使刻度朝上

12、。鏡臺測微尺是一與載玻片大小相同的玻璃片，中央有一個圓形的蓋玻片，中央刻有1mm長的標尺，等分為100格，每格為0.01mm即為10 um。先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野中看清鏡臺測微尺的刻度后，然后轉換成高倍鏡，同時轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動移動手輪，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度。計數兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數和鏡臺測微尺的格數。因為鏡臺測微尺的刻度每格長10微米，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的長度： 表3-1目鏡測微尺校正記錄 項 目實 驗 數目鏡測微尺格數（A）鏡臺測微尺格數(B)目鏡測微尺每

13、格長度m12平 均10m注：當更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須重新校正目鏡測微尺每一格所代表的長度。2.微生物個體大小的測量校正好目鏡測微尺后，取出鏡臺測微尺放回盒內 ，放回原處。此時不要再隨意變動目鏡和物鏡放大倍數，微生物個體大小的測定只能在這特定的情況下進行。取一干凈的載玻片滴一滴水樣，蓋上蓋玻片，首先使用低倍鏡找到目的物，然后轉換成高倍鏡進行測量，用目鏡測微尺測出微生物長、寬各占幾格(不足一格的部分估計到小數點后一位數)，測出的格數乘上目鏡測微尺每格代表的長度，即等于該微生物的大小，記錄，尋找同類生物個體測量3次，求出平均值。表3-2 微生物個體大小測量記錄 單位：m 項 目次 數1

14、23平 均五、實驗結果及分析求出所觀察的微生物個體大小的平均值，討論與理論值的誤差原因。實驗四 培養基的制備及滅菌一、實驗目的1熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備工作。2掌握培養基的制備方法。3掌握高壓蒸汽滅菌技術。二、實驗原理培養基是按照微生物生長發育的需要，用不同組分的營養物質調制而成的營養基質。人工制備培養基的目的，在于給微生物創造一個良好的營養條件。把一定的培養基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環境和場所。自然界中，微生物種類繁多，由于微生物具有不同的營養類型，對營養物質的要求也各不相同，加之實驗和研究上的目的不同，所以培養基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類和不同組成的培

15、養基中，均應含有滿足微生物生長發育的水分、碳源、氮源、無機鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養基還應具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。根據制備培養基對所選用的營養物質的來源，可將培養基分為天然培養基、半合成培養基和合成培養基三類。按照培養基的形態可將培養基分為液體培養基和固體培養基。根據培養基使用目的，可將培養基分為選擇培養基、加富培養基及鑒別培養基等。固體培養基是在液體培養基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其主要成份為多糖類物質，性質較穩定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學成份變化。瓊脂

16、在95的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到45才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養基在一般微生物的培養溫度范圍內(25-37)不會融化而保持固體狀態。滅菌是用物理或化學的方法來殺死或除去物品上或環境中的所有微生物。消毒是用物理或化學的方法殺死物體上絕大部分微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒實際上是部分滅菌。在微生物實驗、生產和科研工作中，需要進行純培養，不能有任何雜菌，因此，對所用器材、培養基要進行嚴格滅菌，對工作場所進行消毒，以保證工作順利進行。三、實驗器材1培養皿（90mm）5套2試管（15150mm）5支，（18180mm）2支，試管架3吸量管（10mL）2支，（1mL）8支

17、4錐形瓶（250mL）3個5燒杯（500mL）1個，50mL1個6吸耳球，玻璃棒，滴管7紗布、脫脂棉、報紙、精密pH試紙8漏斗、漏斗架910% NaOH溶液、10% HCl溶液10牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水11高壓蒸氣滅菌器12電熱恒溫培養箱13天平、電爐、鑷子、牛角勺四、實驗方法1玻璃器皿的洗滌和包裝（1）洗滌玻璃器皿在使用前必須洗滌干凈。培養皿、試管、錐形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自來水沖凈。移液管先用洗液浸泡，再用自來水沖洗干凈。洗刷干凈的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干，備用。（2）包裝培養皿由一底一蓋組成一套，用包裝紙將5套培養皿包好。移液管的吸端用細鐵絲將少許棉花塞

18、入構成11.5cm長的棉塞，將塞好棉花的移液管的尖端，放在45cm寬的長紙條的一端，移液管與紙條約成30夾角，折疊包裝紙包住移液管的尖端，左手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉，紙條螺旋式包在移液管外面，余下的紙頭折疊打結。按實驗需要，可單只包裝或多只包裝，待滅菌。用棉塞將試管管口和錐形瓶瓶口部塞住棉塞的制作：按試管口和錐形瓶瓶口大小估計用棉量，將棉花鋪成中心厚，周圍逐漸變薄的圓型，對折后卷成卷，一手握粗端，將細端塞入試管或錐形瓶口內，棉塞不宜過松或過緊，用手提棉塞，管、瓶不掉下為準。棉塞四周應緊貼管壁，不能有皺折，以防空氣中的微生物沿棉塞皺折侵入。棉塞插入2/3，其余留在管口外，便于拔塞。試管、

19、錐形瓶塞好棉塞后，用包裝紙包好，放在滅菌桶內待滅菌。2培養基的配制（1）培養基配方牛肉膏：1g；蛋白胨：2g；氯化鈉：1g；瓊脂：4g；蒸餾水：200mL；pH：7.47.6（2）操作方法取一個500mL的燒杯，裝入200mL的蒸餾水。用天平依次稱取配方中各成分，放入水中加熱溶解，待瓊脂完全融化后停止加熱，補足蒸發損失的水量。用10NaOH或10HCl調節pH至7.47.6。分裝試管，將培養基分裝2支試管中，其余倒入250mL的錐形瓶中，分別塞上棉塞，包扎好待滅菌。3-1 培養基的分裝裝置與棉塞A：培養基的分裝圖B：棉塞的做法1：正確；2：管內太短，外部太長；3：整個棉塞太松；4：管內太緊，外

20、部太短松3滅菌滅菌的方法：滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、照射和使用化學藥品等方法。加熱滅菌是最主要的，加熱滅菌法有兩種：干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌比干熱滅菌優越，因為濕熱的穿透力和熱導傳導都比干熱強。濕熱時微生物吸收高溫水分，菌體蛋白很容易凝固變性，所以濕熱滅菌效果好。濕熱滅菌的溫度一般是在121滅菌15-30分鐘，而干熱滅菌的溫度則是160滅菌2小時才能達到濕熱滅菌121的同樣效果。干熱滅菌法培養皿、移液管及其它玻璃器皿可用干熱滅菌。現將已包裝好的上述物品放入干燥箱中，將溫度調至160后維持2小時，關掉加熱開關，待溫度降至50左右，將物品取出。注：滅菌時溫度不得超過170，

21、以免包裝紙燒焦。滅菌好的器皿應保存好，切勿弄破包裝紙，否則會染菌。高壓蒸汽滅菌法此法使用高壓蒸汽滅菌器，微生物實驗所需的一些器皿、器具、培養基（不耐高溫者除外）等都可用此法滅菌。滅菌的操作過程實驗室中常用的高壓蒸汽滅菌鍋有立式、臥式和手提式等幾種。本實驗介紹手提式高壓蒸汽滅菌器的使用方法。手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作方法：1首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。2放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣

22、槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4用電加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除滅菌器內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用1.05kg/cm2，121，20分鐘滅菌。5滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。6將取出的滅菌培養基

23、放入電熱恒溫培養箱于溫度37下培養24小時，經檢查若無雜菌生長，即可待用。注：每次使用高壓蒸汽滅菌器前，認真察看滅菌器內的水位是否合適。五、思考題1培養基根據什么原理配制成的？基礎培養基中不同的成分各起到什么作用？2說明濕熱滅菌比干熱滅菌的優越性。實驗五 活性污泥法污水處理過程中細菌菌落總數（CFU）的測定一、實驗目的1了解細菌總數指標的意義。2掌握稀釋平板法。3掌握細菌菌落總數的計數方法。二、實驗原理細菌種類很多，有各自的生理特性，必須用適合他們生長的培養基才能將他們培養出來。但在實際工作中不易做到，通常用一種適合大多數細菌生長的培養基培養腐生性細菌，以它的菌落總數表明有機物污染程度。活性污

24、泥菌含量（細菌總數）是微生物指標，是許多行業運行管理的重要參數之一。在給水工程中，細菌總數在一定程度上反映了微生物污染程度。在污水處理過程中，污泥混合菌濃度及進出水的細菌總數直接反映了活性污泥活性的好壞和水質的變化情況。在實際測定中，通常用適合大多數異養細菌生長的營養瓊脂培養基進行培養，以24h、37恒溫培養產生的菌落總數進行計算。三、實驗器材1培養皿（90mm）5套（已滅菌）2試管（15150mm）5支（已滅菌）、試管架3吸量管（10mL）2支、（1mL）8支）（已滅菌）4錐形瓶（250mL）1個（已滅菌）5營養瓊脂培養基1瓶（已滅菌）6無菌水（200mL）1瓶7燒杯（100mL）1個8酒精

25、燈9吸耳球四、實驗方法1稀釋水樣將1瓶90mL和5管9mL的無菌水排列好,按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次編號，在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10 mL水樣置于第一瓶90mL無菌水（內含玻璃珠）中，將移液管吹洗3次，用手搖10分鐘將顆粒狀樣品打散。即為10-1濃度的菌液。用1mL的無菌移液管吸取1 mL10-1濃度的菌液于一9mL無菌水中，將移液管吹洗3次，搖勻即為10-2濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10-6。注：視水體污染程度定稀釋倍數，取在平板上能長出30300個菌落的水樣稀釋倍數。2接種用無菌移液管吸取3個適宜濃度的稀釋液1mL加入無菌培養皿內，并傾注約15 mL已融化且冷卻至45左右的營養瓊脂培養基，并立即旋搖平皿（順時針或逆時針），使菌液和培養基充分混勻，冷凝后即成平板，翻轉平皿，使底面朝上，置于37恒溫培養箱培養。3計菌落數將培養24h的平板取出計菌落數。五、菌落計數及報告方法用肉眼觀察，計平板上的細菌菌落數，也可用菌落計數器計數，記下同一濃度的三個平板的菌落總數，計算平均值，再乘以稀釋倍數得出1mL水樣中細菌菌落總數。各種不同情況的計算方法如下：1