1、腦心舒口服液微生物限度檢查法的方法學研究實驗資料1目的 對供試品進行微生物限度檢查時，確認所采用的細菌、霉菌及酵母菌計數方法和控制菌檢查方法是否適合于該藥品的微生物限度檢查。本試驗依據中國藥典2010年版一部附錄 C對其進行了微生物限度檢查法的研究并驗證，建立了該品種的微生物限度檢查的方法。2樣品：腦心舒口服液 批 號：規格： 生產單位： 3實驗儀器：高壓蒸汽立式滅菌器LMQ.C 山東新華醫療器械公司微波爐 SANYO EM-311EB1 合肥榮事達三洋電器股份有限公司電子天平 Sartorius BP2114 北京賽多利斯儀器系統有限公司凈化工作臺 JB-CJ-2FQ 蘇州佳寶凈化工程設備有

2、限公司生物安全柜 BHC-1300 A2 蘇州安泰空氣技術有限公司細菌培養箱 DG-1 上海醫療器械修理廠霉菌培養箱 MJX-250C 上海博迅實業有限公司醫療設備廠集菌儀 HTY-2000B 杭州高德醫療器械有限公司一次性使用薄膜過濾器4培養基膽鹽乳糖發酵培養基 批號：20091018膽鹽乳糖培養基 批號：20090908玫瑰紅鈉瓊脂培養基 批號：20090405營養瓊脂培養基 批號：090315營養肉湯培養基 批號：091012改良馬丁液體培養基 批號：090608改良馬丁瓊脂培養基 批號：091006曙紅亞甲藍瓊脂培養基批號：0810015菌種枯草桿菌 (Bacillus subtili

3、s) CMCC(B)63501金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 44102白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98001黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC(F)980036菌液制備6.1取上述經35培養1824小時的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮營養肉湯培養物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5 10-7，約為50100cfu/ml，做活菌計數備用。6.2取經25 培養1824小時的白色念珠菌改

4、良馬丁液體培養物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5 10-6，約為50100cfu/ml，做活菌計數備用。6.3取經25 培養1周的黑曲霉改良馬丁斜面培養物，加5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量稀釋，用標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，取1 ml稀釋后的孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-4，約為50100cfu/ml，做活菌計數備用。7細菌計數法：7.1供試液制備 取供試品原液作為供試液。 7.2回收率測定：培養基稀釋法（1）試驗組：取供試液1 ml等量分注2個平皿中，同時加入50100c

5、fu 試驗菌，立即傾注營養瓊脂培養基，置3035培養箱培養2472小時逐日觀察結果。（2）菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數。（3）供試品對照組：取供試液1 ml等量分注2個平皿中，立即傾注營養瓊脂，置3035培養箱培養2472小時逐日觀察結果，測定供試品本底菌數。（4）回收率的計算：按如下公式計算試驗組的加菌回收率： 為該株陽性菌的回收率。結果見表1。8 霉菌、酵母菌計數法 ：8.1 供試液的制備：取供試品原液作為供試液。 8.2 回收率的測定：平皿法（1）試驗組：取供試液1 ml和50100cfu 試驗菌同時加入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，置2328培養箱培養2472小時

6、，逐日觀察結果。（2）菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數。（3）供試品對照組：取供試液1 ml加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養2472小時逐日觀察結果，測定供試品本底菌數。（4）回收率的計算 按如下公式計算試驗組的加菌回收率： 為該株陽性菌的回收率。結果見表1。表1 細菌、霉菌和酵母菌計數方法學驗證的試驗結果方法供試液濃度陽性菌代數菌液組（CFU）試驗組（CFU）供試品對照組（CFU）回收率（%）培養基稀釋法（0.5ml/皿）原液大腸埃希菌 2104105100108 0，0100%枯草芽孢桿菌 260594645 0，076%金黃色葡萄球菌 21089791109 0

7、，098%平皿法白色念珠菌 276767472 0，096%黑曲霉 288889191 0，0103%培養基稀釋法（0.5ml/皿）原液大腸埃希菌 295949595 0，0101%枯草芽孢桿菌 261665656 0，088%金黃色葡萄球菌 246414445 0，0102%平皿法白色念珠菌 248513940 0，080%黑曲霉 277777175 0，095%培養基稀釋法（0.5ml/皿）原液大腸埃希菌 288918095 0，098%枯草芽孢桿菌 249504640 0，087%金黃色葡萄球菌 2115116114109 0，097%平皿法白色念珠菌 250494241 0，084%黑

8、曲霉 2868191920，0110%9控制菌檢查方法：大腸埃希菌檢查法：供試液的制備：取供試品原液作為供試液。試驗組：取供試液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養基中，同時加入上述大腸埃希菌液10100cfu，置35培養24小時，取上述培養物0.2ml，接種至含5mlMUG培養基的試管內，培養，于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。觀察后，沿管壁加入數滴靛基質試液，觀察。同時取膽鹽乳糖培養基的培養物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基，培養1824小時，觀察結果。陰性菌對照組：取供試液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養基，同時加入上述金黃色葡萄球菌10100cfu，置35培養箱培養24小時，以下步驟同試驗組，結果見表2 。表2 控制菌檢查法方法學驗證試驗結果大腸埃希菌檢查試驗組（供試液+大腸埃希菌）陰性菌對照組（供試液+金黃色葡萄球菌）BL培養基 + MUG 靛基質試驗 + + EMB平板 典型菌落生長 無菌落生長加入菌數（cfu） 54,58 55,6010結論經過試驗驗證，腦心舒口服液微生物限度檢查法可采用以下方法：10.1 細菌計數法：培養基稀釋法(取混勻的原液2ml，每ml等量分注2個平皿) 取供試品原液作為供試液，采用培養基稀釋法，取上述供試液2ml，每1ml供試液等量分注2個平皿，依法測定。