1、第五章 現代色譜技術簡介第一節 高效毛細管電泳分析法（high performance capillary electrophoresis, HPCE）一、 概述1、 發展1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳第一次的自由溶液電泳。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發生了根本變革，迅速發展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術高效毛細管電泳分析法。2、 特點 儀器簡單、易自動化 分析速度快、分離效率高 操作方便、消耗少 應用范圍極廣二、 高效毛

2、細管電泳理論基礎1、 高效毛細管電泳(HPCE)基本原理電泳：帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度。當帶電離子以速度在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：阻力：故：-離子所帶的有效電荷；-電場強度；-離子在電場中的遷移速度；-平動摩擦系數 ( 對于球形離子：,-離子的表觀液態動力學半徑；-介質的粘度)。所以，遷移速度：淌度（mobility） ：單位電場強度下的平均電泳速度。淌度不同是電泳分離的基礎。2、 電滲現象與電滲流(1) 電滲流現象當液體兩端施加電壓時，就會發生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現象叫電滲

3、現象。電滲現象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡稱EOF）。 (2) HPCE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度V電滲流表示，取決于電滲淌度和電場強度。電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的性質： 內表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內表面帶正負電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極； 石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；(3) HPCE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很?。?；液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。(4) HP

4、CE中電滲流的作用 可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離； 改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性； 電滲流的微小變化影響結果的重現性。3、 HPCE中影響電滲流的因素(1) 電場強度的影響 電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。(2) 毛細管材料的影響 不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產生的電滲流大小不同；(3) 電解質溶液性質的影響對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大；pHV電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

5、2、 膠束電動毛細管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC)緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內核、外部帶負電的膠束。在電場力的作用下，膠束在柱中移動。電泳流和電滲流的方向相反，且V電滲流 V電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長；色譜與電泳分離模式的結合。3、 其它分離模式 毛細管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis ，CGE） 毛細管等電聚焦（capillary isoelect

6、ric focusing，CIEF） 毛細管等速電泳（capillary isotachophoresis ，CITP） 毛細管電滲色譜（capillary electroosmostic chromatography ，CEC）六、 應用 離子分析 藥物分析 手性化合物分析 氨基酸分析 毛細管等電聚焦(CIEF) 核酸分析及DNA測序七、 進展 微型化 聯用儀器 CE-MS 陣列毛細管凝膠電泳第二節 液相色譜質譜聯用技術一、 概述發展：Horning、20世紀70年代。特點：集液相色譜的高分離效能與質譜的強鑒定能力于一體，對研究對象不僅有足夠的靈敏度、選擇性，同時還能夠給出一定的結構信息，分

7、析快速而且方便，具有其他分析方法所不能比擬的優點。地位：隨著接口技術的不斷發展，液相色譜-質譜(LC-MS)聯用技術在藥物分析等領域的地位越來越重要,分析范圍更廣。二、 LC-MS的基本組成LC-MS聯用儀的基本組成包括HPLC裝置、接口裝置與離子源、質量分析器。1、 接口技術(1) 接口的作用 將洗脫劑及樣品分子氣化； 分離除去大量的洗脫劑分子； 完成對樣品分子的離解； 在樣品分子已經電離的情況下，最好能進行碰撞誘導解離（CID）。(2) 接口的種類LC-MS采用過的接口：直接液體導入接口(DLI)、傳送帶接口(MBI)、粒子束接口(PBI)、熱噴霧接口(TSI)、大氣壓離子化接口(API)

8、、電噴霧接口(ESI)、音噴離子化接口(SSI)、動態快原子轟擊接口(FAB)、等離子體噴霧接口(PSP)、基質輔助激光解吸離子化接口(MALDI)等。大氣壓離子化(API)接口的應用,徹底改變了LC/MS的面貌。使其迅速成為體內藥物分析中應用最廣的分析儀器。三、 大氣壓離子化接口技術（API）1、 分類 電噴霧離子化(electrospray ionization, ESI) 氣動輔助電噴霧離子化(pneumatically assisted electrospray ionization) 大氣壓化學離子化(atmospheric pressure chemical ionization,

9、 APCI) 它們的共同點是樣品的離子化在處于大氣壓下的離子化室內完成，離子化效率高，大大增強了分析的靈敏度和穩定性。2、 電噴霧離子化（ESI）(1) 工作原理及結構示意圖樣品溶液通過毛細管導入大氣壓電離源內，在氣化氣的幫助下和源內毛細管終端與反電極之間強電場的作用下，樣品溶液形成帶電荷的霧，即電噴霧。這些霧滴在熱氮氣流下蒸發，半徑逐漸縮小，霧滴表面的電場不斷增強到某一臨界點時發生離子的場發射，或溶劑完全蒸發。生成的樣品氣相離子經質量分析器分析，測得它們的質荷比。ESI過程： 靜電噴霧 去溶劑 離子蒸發。(1) 特點 高的離子化效率； 多種離子模式供選擇； “軟”離子化方式使熱不穩定化合物得

10、以分析并產生高豐度的準分子離子峰；(2) 應用 小分子藥物及其各種體液內代謝物的測定 農藥及化工產品的中間體和雜質鑒定 大分子的蛋白質和肽類的分子測定 氨基酸測序及結構研究 分子生物學領域的應用3、 大氣壓化學離子化（APCI）(1) 工作原理及結構示意圖在大氣壓條件下采用電暈放電方式使流動相離子化，然后流動相作為化學離子化反應氣（氣相試劑）使樣品離子化。樣品分子的離子化通過質子化（）或電荷轉移（）來實現。此外，還可通過去質子（樣品為酸），電子捕獲（鹵素、芳香化合物）及形成加合物（如、）的方式來實現。(2) 特點 軟電離接口技術； 電離過程只產生單電荷峰，非常適合弱極性小分子化合物的測定； A

11、PCI還與高流量的梯度洗脫和高低水溶液變換的流動相兼容，通過調解離子源電壓，可以得到不同斷裂程度的質譜圖。 四、 質量分析器1、 四極桿質譜儀（quadrupole mass spectrometer）(1) 工作原理及結構示意圖離子從一端進入四極桿，沿z方向恒速前進，由于在四極桿上加了直流電壓和射頻磁場（Vrf）,離子在x軸和y軸方向進行復雜振蕩。有一個穩定的振蕩能是特定的離子從四極桿的一端飛到另一端而沒有碰到電極上。這一振蕩取決于一個離子的質荷比。因此在一定條件下，僅一個質荷比的離子通過四極桿，其它離子由于不穩定的振蕩將會碰到四極桿上而丟失。(2) 特點 在較低的真空度下工作； 掃描速度較

12、快，有利于色譜儀聯用； 四極質譜儀為低分辨率儀器； 掃描時間短（100ms）,特別適合色譜峰的實時掃描； 缺點：四極質譜儀還有質量歧視效應。 2、 飛行時間質譜儀（time-of-flight mass spectrometer, TOF MS）(1) 工作原理及結構示意圖其中由103104V的電場脈沖將離子源產生的樣品離子加速到無場的飛行管內。所有離子進入到飛行管內時具有相同的動能，但他們的飛行速度與它們的質量成反比，輕的離子較重的離子早飛行到達檢測器，典型的飛行時間時130m。(2) 特點 靈敏、分辨率高、快速； 理論上質量范圍無限； 可以得到化合物的精確質量數； 結構簡單。3、 其它質量分析器 離子阱質譜儀（ion trap mass spectrometer, ITMS） 傅立葉變換質譜儀（Fourier transform mass spectrometer, FTMS） 扇形磁場質譜儀（magnetic sector mass spectrometer）4、 串聯質譜三級四極桿質量分析器（trilple-quadrupole analyzer）（空間串聯質譜法）由三個順序連接的四極桿質量分析器組成，第一級和第三級四極桿分析器均可用于離子選擇（母離子掃描和子離子掃描