1、PCRPCR反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成： 模板的熱變性模板的熱變性； 引物復(fù)性到單鏈模板上引物復(fù)性到單鏈模板上； 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶催化的聚合酶催化的延伸延伸變性變性p在應(yīng)用在應(yīng)用 Taq DNA Taq DNA 聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行 PCR PCR 時(shí)，變性時(shí)，變性溫度在溫度在94-9594-95下進(jìn)行，這也是下進(jìn)行，這也是Taq DNATaq DNA聚合聚合酶進(jìn)行酶進(jìn)行3030個(gè)或個(gè)或3030個(gè)以上個(gè)以上PCRPCR循環(huán)而活力不受到循環(huán)而活力不受到過多損失時(shí)能耐受的最高溫度。過多損失時(shí)能耐受的最高溫度。p有時(shí)把變性時(shí)間設(shè)計(jì)為有時(shí)把變性時(shí)間設(shè)計(jì)為 5min5mi

2、n，以便大分子模，以便大分子模板板 DNA DNA 徹底變性的概率。徹底變性的概率。p對(duì)于對(duì)于 GC GC 含量為含量為 55% 55% 或更低的線性或更低的線性 DNA DNA 模模板，推薦板，推薦 PCR PCR 的變性條件是的變性條件是 94-95 94-95 變性變性45s45s。 復(fù)性溫度（復(fù)性溫度（退火溫度退火溫度）至關(guān)重要！）至關(guān)重要！ 退火溫度太高，退火溫度太高，引物不能與模板很好地復(fù)性，引物不能與模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率會(huì)非常低；擴(kuò)增效率會(huì)非常低； 退火溫度太低，退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性而導(dǎo)致非特異性DNADNA片段的擴(kuò)

3、增；片段的擴(kuò)增； 退火溫度，通常比理論設(shè)計(jì)的引物和模板的退火溫度，通常比理論設(shè)計(jì)的引物和模板的TmTm值值低低 3-5 3-5 下進(jìn)行。下進(jìn)行。 最好通過對(duì)最好通過對(duì)復(fù)性溫度復(fù)性溫度比兩條比兩條引物的引物的Tm Tm 值低值低 2-2-10 10 內(nèi)進(jìn)行內(nèi)進(jìn)行PCRPCR預(yù)實(shí)驗(yàn)（梯度）來對(duì)復(fù)性條件預(yù)實(shí)驗(yàn)（梯度）來對(duì)復(fù)性條件的優(yōu)化的優(yōu)化。引物和模板引物和模板DNA 的復(fù)性的復(fù)性 對(duì)對(duì) Taq Taq DNA DNA 聚合酶來說，最適溫度為聚合酶來說，最適溫度為72-72-78 78 ，時(shí)間約為，時(shí)間約為1min1min。引物的延伸與循環(huán)數(shù)目引物的延伸與循環(huán)數(shù)目 哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物 DNA DNA

4、為模板時(shí)，至少進(jìn)行為模板時(shí)，至少進(jìn)行2525個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)才能得到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般為才能得到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般為30-3330-33個(gè)個(gè)循環(huán)。循環(huán)。引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)（1 1）堿基組成：）堿基組成： GCGC含量應(yīng)在含量應(yīng)在40%-60%40%-60%（ 45%-55% 45%-55% ）之間，）之間，4 4中堿基在引物中分配均勻。沒有多聚嘌呤或中堿基在引物中分配均勻。沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如多聚嘧啶序列，如AAAAAAAAAA等，沒有二核苷酸等，沒有二核苷酸重復(fù)序列，如重復(fù)序列，如GCGCGCGCGCGC等；等；（2 2）引物長(zhǎng)度：）引物長(zhǎng)度： 引物中與模板互補(bǔ)的區(qū)應(yīng)為引

5、物中與模板互補(bǔ)的區(qū)應(yīng)為18-2518-25個(gè)個(gè)核苷酸核苷酸長(zhǎng)度，上下引物長(zhǎng)度長(zhǎng)度，上下引物長(zhǎng)度差別不能大于差別不能大于3bp3bp，如，如上游引物為上游引物為19bp19bp，下游引物為，下游引物為24bp24bp等。等。（3 3）重復(fù)或自身互補(bǔ)序列：）重復(fù)或自身互補(bǔ)序列： 形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會(huì)阻止引物和模板之間的復(fù)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會(huì)阻止引物和模板之間的復(fù)性。性。（4 4）上下引物的互補(bǔ)性：）上下引物的互補(bǔ)性： 一個(gè)引物的一個(gè)引物的33末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上，因?yàn)楹挝稽c(diǎn)上，因?yàn)镻CRPCR中引物濃度較高，會(huì)形成引物二中引物濃度較高，會(huì)形成引物二聚

6、體。聚體。 當(dāng)一個(gè)當(dāng)一個(gè)PCRPCR有多對(duì)引物時(shí)，注意檢查任何一個(gè)有多對(duì)引物時(shí)，注意檢查任何一個(gè)33末端末端都不能和都不能和 其他任何引物互補(bǔ)。其他任何引物互補(bǔ)。（5 5）解鏈溫度（）解鏈溫度（Tm Tm 值）：值）： 計(jì)算出來的兩個(gè)引物的計(jì)算出來的兩個(gè)引物的 Tm Tm 值相差不能大于值相差不能大于5 5 ，擴(kuò)增產(chǎn)物的，擴(kuò)增產(chǎn)物的 Tm Tm 值與引物的值與引物的 Tm Tm 值相差不值相差不能大于能大于10 10 ；引物的；引物的 Tm Tm 值一般為值一般為50-7050-70。 這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每一個(gè)這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每一個(gè) PCR PCR 循環(huán)循環(huán)可有效變性?？捎行ё冃?/p>

7、。（6 6）33末端末端3 3末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。如果可能的話，每個(gè)引物的如果可能的話，每個(gè)引物的3 3末端堿基為末端堿基為G G或或C C；最；最好不要好不要A A，或，或AAAA等多聚等多聚A A；但不推薦但不推薦3 3末端有末端有.NNNCG.NNNCG或或.NNNGC.NNNGC序列的引物，序列的引物，GCGC高自由高自由能促進(jìn)發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生。能促進(jìn)發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生。 當(dāng)末端堿基為當(dāng)末端堿基為 A A 時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成的效率大大時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成的效率大大降低；降低； 當(dāng)末端堿基為當(dāng)末端堿基為T T時(shí)，錯(cuò)配情況下亦能引發(fā)鏈的合成，時(shí)，錯(cuò)配情況下亦能引

8、發(fā)鏈的合成，所以一般所以一般 PCR PCR 反應(yīng)中，引物反應(yīng)中，引物3 3末端的堿基最好選末端的堿基最好選T T、C C、G G，而不選，而不選A A。 引物引物33端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為差異，當(dāng)末位的堿基為A A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T T時(shí)，錯(cuò)配的引時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，發(fā)效率大大降低，G G、C C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A A、T T之之間，所以間，所以33端最好選擇端最好選擇T T。？。？（7 7）5

9、5端序列添加限制性酶切位點(diǎn)：端序列添加限制性酶切位點(diǎn)：一些概念一些概念 有意鏈（有意鏈（Sense strandSense strand），正義鏈（），正義鏈（positive positive strandstrand），編碼鏈（），編碼鏈（coding strandcoding strand）；無意鏈）；無意鏈（anti-sense strandanti-sense strand），負(fù)義鏈（），負(fù)義鏈（negative negative strandstrand），模板鏈（），模板鏈（template strandtemplate strand） 正向引物正向引物 （forward pri

10、merforward primer）：處于：處于DNADNA雙鏈上游的引物。如雙鏈上游的引物。如用于測(cè)序，則從用于測(cè)序，則從5 533方向讀出方向讀出 DNADNA正鏈的序列。正鏈的序列。 反向引物反向引物 （Reverse primerReverse primer）：處于目的：處于目的DNADNA雙鏈下游的引物。雙鏈下游的引物。如用于測(cè)序，則讀出如用于測(cè)序，則讀出 DNADNA負(fù)鏈從下游到上游的反向序列。負(fù)鏈從下游到上游的反向序列。 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物軟件設(shè)計(jì)引物 是由加拿大的是由加拿大的 Premier Premier 公司開發(fā)的專業(yè)用于公司開發(fā)的專業(yè)用于P

11、CRPCR或測(cè)序引物以及雜交探針或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件軟件 主要界面分為序列主要界面分為序列編輯窗口編輯窗口（genetankgenetank）、）、primer designprimer design、酶切分析酶切分析（restriction restriction sitesite）和）和 MotifMotif 正向（正向（As isAs is）、反向（）、反向（reversedreversed）、互補(bǔ)（）、互補(bǔ)（complementedcomplemented）及反向互補(bǔ)（及反向互補(bǔ)（reverse complemented reverse complem

12、ented ）。）。正向（正向（As isAs is）反向（反向（reversedreversed）互補(bǔ)（互補(bǔ)（complementedcomplemented）Enzyme 軟件默認(rèn)以軟件默認(rèn)以表格方式表格方式顯示酶切結(jié)果。單擊顯示酶切結(jié)果。單擊SeqSeq 或或 MapMap，分別以，分別以序列或圖示的方式顯示結(jié)果。序列或圖示的方式顯示結(jié)果。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：不能以文本的形式保存結(jié)不能以文本的形式保存結(jié)果。果。Motif Primer點(diǎn)擊點(diǎn)擊 SearchSearch，進(jìn)行引物搜索，進(jìn)行引物搜索Search criteriaSearch criteria 窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。窗口：多種參數(shù)可

13、以調(diào)整。Primer LengthPrimer Length常設(shè)置在常設(shè)置在181830bp,30bp,短了特異性不好，長(zhǎng)了沒有必要。短了特異性不好，長(zhǎng)了沒有必要。當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶切位點(diǎn)什么的。切位點(diǎn)什么的。PCR Product sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之間，小于之間，小于100bp100bp的的PCRPCR產(chǎn)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。求苛刻。ManualManualSearch par

14、ameters Search parameters 人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。Search stringencySearch stringency應(yīng)選應(yīng)選HighHigh。GCGC含量一般是含量一般是40406060。其它參數(shù)默認(rèn)就可以。其它參數(shù)默認(rèn)就可以。Search progress Search progress 窗口中顯示窗口中顯示Search CompletedOKSearch CompletedOK鍵鍵結(jié)果窗口結(jié)果窗口有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對(duì)顯示。有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對(duì)顯示。引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為10

15、0100。選其中的一對(duì)引物，在主。選其中的一對(duì)引物，在主窗口顯示結(jié)果。窗口顯示結(jié)果。對(duì)于上述引物，如果其它各項(xiàng)指對(duì)于上述引物，如果其它各項(xiàng)指標(biāo)還可以，可在引物末端去掉一標(biāo)還可以，可在引物末端去掉一個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看看引物的評(píng)估參數(shù)有沒有變好點(diǎn)?？匆锏脑u(píng)估參數(shù)有沒有變好點(diǎn)。搜索出來的引物，按搜索出來的引物，按RatingRating排序，排序，逐個(gè)送逐個(gè)送OligoOligo軟件里評(píng)估。軟件里評(píng)估。當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它。物很短，你可以不選擇它。引物引物3 3端端22個(gè)個(gè)A A或或T,T,或引物內(nèi)部或

16、引物內(nèi)部連續(xù)的連續(xù)的G G或或C C太多，或引物太多，或引物3 3端端22個(gè)個(gè)G G或或C C，這樣的引物應(yīng)作，這樣的引物應(yīng)作為次選，沒得選了就選它。為次選，沒得選了就選它。該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”S”和和“A”A”可查看有義鏈可查看有義鏈或反義鏈的引物。右邊是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模或反義鏈的引物。右邊是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模板及引物序列的配對(duì)情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。板及引物序列的配對(duì)情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。注意：尾末給出該注意：尾末給出該引物的最佳退火溫度引物的最

17、佳退火溫度！第四層：四種重要指標(biāo)的分析！第四層：四種重要指標(biāo)的分析引物長(zhǎng)度：引物長(zhǎng)度：控制著引物的特異性和在控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火反應(yīng)中的退火溫度。長(zhǎng)的溫度。長(zhǎng)的PCR引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以通過降低退火溫度提高反應(yīng)的靈敏度，不過長(zhǎng)引物易形通過降低退火溫度提高反應(yīng)的靈敏度，不過長(zhǎng)引物易形成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級(jí)結(jié)構(gòu)。適宜引物成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級(jí)結(jié)構(gòu)。適宜引物長(zhǎng)度為長(zhǎng)度為18-27 nt。Tm 融鏈溫度融鏈溫度：根據(jù)相：根據(jù)相鄰二堿基對(duì)作用原理來鄰二堿基對(duì)作用原理來計(jì)算融鏈溫度。計(jì)算融鏈溫度。PCR 反反應(yīng)的合

18、適應(yīng)的合適 Tm 范圍為范圍為56-63 （50-70）GC% 含量含量：對(duì)于：對(duì)于PCR 反應(yīng)來說反應(yīng)來說 GC含量在含量在50% 左右比左右比較合適。較合適。（40-60%,45-55%）Degeneracy多義性多義性，盡量減少，盡量減少引物多義性，這樣會(huì)帶來更好引物多義性，這樣會(huì)帶來更好的特異性，盡量避免的特異性，盡量避免3末端末端的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位置即使的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位置即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。延伸。 BLAST 驗(yàn)證引物驗(yàn)證引物 進(jìn)入進(jìn)入http: //BLAST/, 點(diǎn)擊點(diǎn)擊Basic BLAST

19、中的中的 nucleotide blast 選項(xiàng)選項(xiàng) 在在Enter Query SequenceEnter Query Sequence欄中輸入引物序列：欄中輸入引物序列： 例：例：引物為引物為5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3; 5-TGCCCATCACAACATCATCT-35-TGCCCATCACAACATCATCT-3 同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物都從同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物都從5 5 33。輸入上游引物后，加上。輸入上游引物后，加上2020個(gè)字母?jìng)€(gè)字母n n，再輸入下，再輸入下游引物。游引物。 在在Ch

20、oose Search SetChoose Search Set欄中：欄中：DatabaseDatabase根據(jù)預(yù)操作基根據(jù)預(yù)操作基因的種屬定了，可選因的種屬定了，可選Human genomic + transcriptHuman genomic + transcript或或OthersOthers 在在Program SelectionProgram Selection中：選擇中：選擇Somewhat similar Somewhat similar sequences (blastn)sequences (blastn)項(xiàng)，如下圖：項(xiàng)，如下圖： 在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊在此界面最下面關(guān)鍵要

21、點(diǎn)擊Algorithm parametersAlgorithm parameters參參數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。 在在General ParametersGeneral Parameters中：中：Expect thressholdExpect thresshold期望閾值須改為期望閾值須改為10001000，大于，大于10001000也可以；在也可以；在Word sizeWord size的下拉框?qū)?shù)字改為的下拉框?qū)?shù)字改為7 7。 圖中圖中：序列與引物匹配的得分值小于：序列與引物匹配的得分值小于4040分、分、40405050分、分、50-8050-80分、分、

22、80-20080-200分等分等，分值越高，特異性越好；，分值越高，特異性越好；線段代表上或下游線段代表上或下游引物引物，其顏色和上面對(duì)照后就可得出該條引物的分值。兩線段，其顏色和上面對(duì)照后就可得出該條引物的分值。兩線段間沒有連線的，表示單條引物與該基因一致。有連線的代表這間沒有連線的，表示單條引物與該基因一致。有連線的代表這些序列與上游引物匹配（些序列與上游引物匹配（Strand=Plus/PlusStrand=Plus/Plus）、并與下游引物）、并與下游引物互補(bǔ)（互補(bǔ)（Strand=Plus/MinusStrand=Plus/Minus），），理論上可以擴(kuò)增出基因片斷。理論上可以擴(kuò)增出基

23、因片斷。點(diǎn)擊線段，就能跳轉(zhuǎn)到該基因的結(jié)果信息概要。點(diǎn)擊線段，就能跳轉(zhuǎn)到該基因的結(jié)果信息概要。Accession，數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫系列的身份證：點(diǎn)系列的身份證：點(diǎn)擊之后可以獲得該擊之后可以獲得該序列的信息序列的信息Desscription序序列列的簡(jiǎn)單描述的簡(jiǎn)單描述高的就是有兩線段間高的就是有兩線段間有連線的有連線的代表隨機(jī)匹配的可代表隨機(jī)匹配的可能性能性。E值值接近零時(shí)接近零時(shí)最有意義，也就是最有意義，也就是說序列完全匹配了。說序列完全匹配了。比對(duì)到的序列長(zhǎng)度比對(duì)到的序列長(zhǎng)度E值越小為好！值越小為好！匹配上的堿基數(shù)占總匹配上的堿基數(shù)占總序列長(zhǎng)度的比例序列長(zhǎng)度的比例缺失或插入，用缺失或插入，用“-”

24、來表來表示示Query1、2表示輸入表示輸入的兩對(duì)引物，的兩對(duì)引物，Sbjct表表示在庫里比對(duì)的序列示在庫里比對(duì)的序列Primer BLAST的詳細(xì)結(jié)果的詳細(xì)結(jié)果ncbi 在線在線 primer 設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到到1000，這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如圍改小，比如480-500 至于至于RT-PCR所用的引物，最好是所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在在DNA對(duì)對(duì)RT-PCR的干擾。的干擾。 用用OligoO

25、ligo軟件軟件設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)/ /評(píng)估評(píng)估PCRPCR引物引物 啟動(dòng)啟動(dòng)OligoOligo，選擇，選擇FileFileopenopen，打開要進(jìn)行引物分析，打開要進(jìn)行引物分析的序列。的序列。圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：TmTm值、值、GG和和 Frequencies Frequencies。退火溫度窗口是設(shè)計(jì)引物退火溫度窗口是設(shè)計(jì)引物的的主窗口主窗口，其他兩個(gè)具有，其他兩個(gè)具有輔助輔助作用。作用。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動(dòng)窗口的因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動(dòng)窗口的Cascade Cascade 排列排列方式不太方便，可從方式不太方便，可從windowswindows菜單改為菜單改為T

26、ileTile方式。方式。用用TileTile方式方式顯示窗口顯示窗口TmTm，退火溫度窗口，退火溫度窗口TmTm值曲線以選取值曲線以選取7272附近為佳；附近為佳；5 5到到33端的下降性狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。端的下降性狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。圈出來的序列部分及黃色的圈出來的序列部分及黃色的barbar即即代表當(dāng)前分析的代表當(dāng)前分析的2121個(gè)堿基的個(gè)堿基的TmTm值值 可點(diǎn)擊窗口的左下角的可點(diǎn)擊窗口的左下角的UpperUpper、LowerLower按鈕選擇上游引物、下游引物。按鈕選擇上游引物、下游引物。 TmTm值似乎太低了值似乎太低了TmTm值似乎太高了值似乎太高了顯示了裝載

27、的整個(gè)序列的顯示了裝載的整個(gè)序列的 6-7 mers6-7 mers寡核苷酸順序寡核苷酸順序的相對(duì)頻率。寡核苷酸的的相對(duì)頻率。寡核苷酸的3 3端如果在一個(gè)特定端如果在一個(gè)特定的數(shù)據(jù)庫（的數(shù)據(jù)庫（GenBankGenBank的子數(shù)據(jù)庫）更普遍（即的子數(shù)據(jù)庫）更普遍（即出現(xiàn)的頻率更高），那么更容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。出現(xiàn)的頻率更高），那么更容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。FrequenciesFrequencies，堿基頻率窗口，堿基頻率窗口如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點(diǎn)作為如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點(diǎn)作為3 3末端，那么就減少了在末端，那么就減少了在復(fù)雜的底物（比如整個(gè)復(fù)雜的底物（比如整個(gè)基因組基因組DNADNA）內(nèi)的許

28、多位點(diǎn)結(jié)合、）內(nèi)的許多位點(diǎn)結(jié)合、引發(fā)的幾率，從而減少了非特異性引發(fā)的幾率，從而減少了非特異性PCRPCR產(chǎn)物的形成。產(chǎn)物的形成。 平均頻率為平均頻率為10001000的話，的話，CTTGGCCTTGGC的頻率為的頻率為15001500以上，而以上，而TTGGCGTTGGCG德頻率很低，約德頻率很低，約300300。GG，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口 顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性性( (五聚體的自有能五聚體的自有能) )。-1.9-1.9值值=-=-（3.1+3.1+3.1+1.63.1+3.1+3.1+1.6）GG值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度；值反應(yīng)了序

29、列與模板的結(jié)合強(qiáng)度；最好引物的最好引物的GG值在值在55端和中間值比較高，而端和中間值比較高，而在在33端相對(duì)低。端相對(duì)低。在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性是由其在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的，以自由能鄰近堿基決定的，以自由能GG表示。表示。dAdCdGdTdA-1.9-1.3-1.6-1.5dC-1.9-3.1-3.6-1.6dG-1.6-3.1-3.1-1.3dT-1.0-1.6-1.9-1.9第二個(gè)核苷酸第二個(gè)核苷酸第一個(gè)（第一個(gè)（55）核苷酸）核苷酸例子：例子：雙鏈雙鏈d d（ACGG/CCGTACGG/CCGT）的）的GG是：是： G G（ACGGACG

30、G）=G=G（ACAC）+ +GG（CGCG）+ +GG（GGGG） =- =-（1.3+3.6+3.11.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol=-8.0kcol/mol 顯示了顯示了3 3末端序列末端序列GG值較值較低，適合引發(fā)。低，適合引發(fā)。 3 3末端序末端序列列GG太太高。高。你可以在三個(gè)窗口你可以在三個(gè)窗口中自行設(shè)計(jì)引物。中自行設(shè)計(jì)引物。選擇了自己認(rèn)為順眼選擇了自己認(rèn)為順眼的位置，此時(shí)，的位置，此時(shí)，點(diǎn)擊點(diǎn)擊UperUper，上游，上游引物即可顯示。引物即可顯示。同時(shí)在序列下游尋找同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊下游引物，點(diǎn)擊LowerLower，即可顯示，即可顯示下游引物

31、。下游引物。對(duì)你設(shè)計(jì)的引物對(duì)你設(shè)計(jì)的引物質(zhì)量進(jìn)一步分析。質(zhì)量進(jìn)一步分析。同時(shí)在序列下游尋找同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊下游引物，點(diǎn)擊LowerLower，即可顯示，即可顯示下游引物。下游引物。 參數(shù)設(shè)置與搜索選擇參數(shù)設(shè)置與搜索選擇searchfor primers and probessearchfor primers and probes，進(jìn)行如右圖設(shè)置。進(jìn)行如右圖設(shè)置。 點(diǎn)擊點(diǎn)擊search rangessearch ranges，設(shè)置引物范圍和，設(shè)置引物范圍和 PCR PCR產(chǎn)物的大小產(chǎn)物的大小 點(diǎn)擊點(diǎn)擊parametersparameters，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。因?yàn)樵O(shè)計(jì)

32、的是一對(duì)引物，正、負(fù)鏈的復(fù)選框因?yàn)樵O(shè)計(jì)的是一對(duì)引物，正、負(fù)鏈的復(fù)選框都要選上。同時(shí)選都要選上。同時(shí)選compatible pairscompatible pairs默認(rèn)下，默認(rèn)下，對(duì)引物的要求對(duì)引物的要求：無二：無二聚體、聚體、33高度特異、高度特異、GC%GC%含量有限定、去除錯(cuò)誤引發(fā)含量有限定、去除錯(cuò)誤引發(fā)引物等。引物等。 引物的長(zhǎng)度及產(chǎn)物的長(zhǎng)度設(shè)置。引物的長(zhǎng)度及產(chǎn)物的長(zhǎng)度設(shè)置。 Primer LengthPrimer Length設(shè)設(shè)置在置在181830bp,30bp,短短了特異性不好，了特異性不好，長(zhǎng)了沒有必要長(zhǎng)了沒有必要; ; PCR Product sizePCR Product

33、size最好是最好是100100500bp500bp之間，小于之間，小于100bp100bp的的PCRPCR產(chǎn)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊。上限沒有太多的限定。模糊。上限沒有太多的限定。 普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù)普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù) 從高到低六個(gè)等級(jí)的設(shè)從高到低六個(gè)等級(jí)的設(shè)定，最后有一個(gè)用戶定定，最后有一個(gè)用戶定制選項(xiàng)。當(dāng)對(duì)軟件功能制選項(xiàng)。當(dāng)對(duì)軟件功能不了解時(shí)，應(yīng)選不了解時(shí)，應(yīng)選very very high/Highhigh/High。 選選automatically change automatically change string string 后，

34、搜索引物時(shí)，如后，搜索引物時(shí)，如果在高等級(jí)設(shè)定中無法搜索果在高等級(jí)設(shè)定中無法搜索到引物對(duì)時(shí)自動(dòng)降級(jí)一個(gè)等到引物對(duì)時(shí)自動(dòng)降級(jí)一個(gè)等級(jí)來搜索，直到找到為止。級(jí)來搜索，直到找到為止。反向引物時(shí)用反向引物時(shí)用讓引物的長(zhǎng)度可以改變，讓引物的長(zhǎng)度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的以適應(yīng)設(shè)定的TmTm值或值或PEPE（prime Efficeinceprime Efficeince）值（引發(fā)效率）。值（引發(fā)效率）?？梢韵薅ㄋx引物對(duì)的最可以限定所選引物對(duì)的最大數(shù)目。大數(shù)目。實(shí)際上需要我們改動(dòng)的只實(shí)際上需要我們改動(dòng)的只有有引物的長(zhǎng)度引物的長(zhǎng)度，根據(jù)實(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求做相應(yīng)改動(dòng)。驗(yàn)需求做相應(yīng)改動(dòng)。其他的參數(shù)就使用其他的參數(shù)就

35、使用OligoOligo默認(rèn)值，一般無需改動(dòng)。默認(rèn)值，一般無需改動(dòng)。直接使用直接使用OligoOligo默認(rèn)值，默認(rèn)值，一般也無需改變。一般也無需改變。 參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)OKOK，程序即進(jìn)行引物搜，程序即進(jìn)行引物搜索。索。引物搜索結(jié)果如入：引物搜索結(jié)果如入：OligoOligo提供了按引物位提供了按引物位置、產(chǎn)物大小、退火溫置、產(chǎn)物大小、退火溫度、度、GCGC含量等的排列含量等的排列方式。方式。OligoOligo最突出的功能不在于引物搜索最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析而在于引物分析。它提供了多種分析方法并以不同的形式展現(xiàn)出來。它提供了多種分析方法并以

36、不同的形式展現(xiàn)出來。選擇其中的一對(duì)引物，這時(shí)程序自動(dòng)彈出一個(gè)選擇其中的一對(duì)引物，這時(shí)程序自動(dòng)彈出一個(gè)PCRPCR分分析窗口。析窗口。PCRPCRoptimal annealing temperature optimal annealing temperature （最佳（最佳退火溫度）數(shù)值得參考。在退火溫度）數(shù)值得參考。在PCRPCR摸索條摸索條件的時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減件的時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減2 2的的范圍就可以了。范圍就可以了。產(chǎn)物產(chǎn)物TmTm值與引值與引物物TmTm值（低的那個(gè)）值（低的那個(gè)）的差異，一般控制在的差異，一般控制在2020度以內(nèi)。度以內(nèi)。引引物間物間TmTm值的差

37、異，一值的差異，一般控制在般控制在5-65-6度以內(nèi)。度以內(nèi)。引發(fā)效率：上（下）引物對(duì)引發(fā)效率：上（下）引物對(duì)于正、負(fù)鏈正確引發(fā)效率比。于正、負(fù)鏈正確引發(fā)效率比。最佳引物濃度最佳引物濃度在在Analyze Analyze 菜單中，菜單中，Oligo Oligo 提供了眾多分提供了眾多分析功能。選擇相應(yīng)的析功能。選擇相應(yīng)的功能，分析結(jié)果。功能，分析結(jié)果。點(diǎn)擊點(diǎn)擊Selected primersSelected primers，會(huì)給，會(huì)給出兩條引物的概括性信息出兩條引物的概括性信息; ;其中包括引物的其中包括引物的TmTm值值，此，此值值OligoOligo是采用是采用nearest neares

38、t neighbor methodneighbor method計(jì)算，會(huì)計(jì)算，會(huì)比比Primer5Primer5中引物的中引物的TmTm值略值略高高; ;引物的引物的Delta GDelta G和和33端的端的Delta GDelta G: 3: 3端的端的Delta GDelta G過過高，會(huì)在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈高，會(huì)在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起結(jié)構(gòu)并引起DNADNA聚合反應(yīng)，聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一些，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一些，最好不要超過最好不要超過9 9。Key InfoKey InfoDuplex formation Duplex formation ，引物二聚體，引物二聚體引

39、物二聚體是影響引物二聚體是影響PCRPCR反應(yīng)異常的重要因素反應(yīng)異常的重要因素應(yīng)避免，至少也要使應(yīng)避免，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其GG值應(yīng)該偏低值應(yīng)該偏低由由退退火溫度火溫度決定，決定，5050的退火溫度和的退火溫度和6565對(duì)二聚體的影響肯定不一樣。對(duì)二聚體的影響肯定不一樣。The most stable 3-Dimer The most stable 3-Dimer Delta GDelta G絕對(duì)值一般不要超絕對(duì)值一般不要超過過4.5kcal/mol4.5kcal/mol。G G絕對(duì)絕對(duì)值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。結(jié)合堿

40、基對(duì)不要超過結(jié)合堿基對(duì)不要超過3 3個(gè)。個(gè)。the most stable Dimer overallthe most stable Dimer overall絕對(duì)值一般應(yīng)小于多少絕對(duì)值一般應(yīng)小于多少kcal/molkcal/mol跟跟PCRPCR退火溫度有關(guān)。退火溫度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明在實(shí)驗(yàn)表明在PCRPCR退火溫度退火溫度6565時(shí)，時(shí)，6.7kcal/mol6.7kcal/mol沒有問題。沒有問題。Hairpin formation Hairpin formation ，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)Delta GDelta G絕對(duì)值一般不要絕對(duì)值一般不要超過超過4.5kcal/mol4.5kc

41、al/mol。結(jié)合堿基對(duì)不要超過結(jié)合堿基對(duì)不要超過3 3個(gè)。個(gè)。特定的發(fā)夾如果沒有顯示特定的發(fā)夾如果沒有顯示TmTm值，值，那么發(fā)夾結(jié)構(gòu)就不容易形成那么發(fā)夾結(jié)構(gòu)就不容易形成 。結(jié)合堿基對(duì)已經(jīng)超過結(jié)合堿基對(duì)已經(jīng)超過3 3個(gè)。個(gè)。在在3 3形成發(fā)夾會(huì)引發(fā)形成發(fā)夾會(huì)引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參加正式反應(yīng)減少了參加正式反應(yīng)引物的數(shù)量引物的數(shù)量。Composition and TmComposition and Tm上下游引物的上下游引物的GCGC控制在控制在40406060。最后一種是最后一種是Primer5Primer5所采所采用的方法。用的方法。Td is a normal

42、ized Tm in Td is a normalized Tm in 1M salt conditions1M salt conditionsthe Tm is a variable value, that the Tm is a variable value, that depends on salt and DNA depends on salt and DNA concentration set in the Search concentration set in the Search Parameters windowParameters windowTmTm值高時(shí)錯(cuò)配很少，值高時(shí)錯(cuò)

43、配很少，特異性強(qiáng)。特異性強(qiáng)。False priming sitesFalse priming sites，錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)oligooligo會(huì)給會(huì)給正確引發(fā)效率正確引發(fā)效率和和錯(cuò)錯(cuò)誤引發(fā)效率誤引發(fā)效率。一般的原則：使誤引發(fā)效率一般的原則：使誤引發(fā)效率控制在控制在100100以下。以下。有時(shí)候有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很很高的話，比如達(dá)到高的話，比如達(dá)到400400500500，錯(cuò)誤引發(fā)效率超過錯(cuò)誤引發(fā)效率超過100100幅度若幅度若不大的話，也可以接受。不大的話，也可以接受。PrimerPrimer的的priming efficiencypriming efficie

44、ncy應(yīng)該應(yīng)該是錯(cuò)配地方的是錯(cuò)配地方的4 4倍左右，更多倍左右，更多當(dāng)然更好。當(dāng)然更好。下游引物對(duì)下游引物對(duì)于負(fù)鏈，沒于負(fù)鏈，沒有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤引發(fā)。引發(fā)。Selected OligoSelected OligoPrimer pairsPrimer pairs系統(tǒng)設(shè)計(jì)出的所有引物對(duì)。系統(tǒng)設(shè)計(jì)出的所有引物對(duì)。internal stabilityinternal stabilityInternal stabilityInternal stability很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證間高、兩邊低的弧形，最起碼保證3 3端不要

45、過于穩(wěn)定。端不要過于穩(wěn)定。引物引物3 3端過于穩(wěn)定，很端過于穩(wěn)定，很容易導(dǎo)致不適當(dāng)擴(kuò)增。容易導(dǎo)致不適當(dāng)擴(kuò)增。上游引物的參數(shù)上游引物的參數(shù)注意：注意：必需把方框拉到上游引物處。必需把方框拉到上游引物處。對(duì)應(yīng)的下游引物的對(duì)應(yīng)的下游引物的參數(shù)參數(shù)注意：注意：必需把方框拉到下游引物處。必需把方框拉到下游引物處。Hybridization timeHybridization time，雜交時(shí)間，雜交時(shí)間該窗口顯示了不同長(zhǎng)度、不同濃度的該窗口顯示了不同長(zhǎng)度、不同濃度的寡核苷酸的雜交時(shí)間寡核苷酸的雜交時(shí)間 ConcentrationConcentration您只需點(diǎn)一下鼠標(biāo)，就輕您只需點(diǎn)一下鼠標(biāo)，就輕松地實(shí)

46、現(xiàn)對(duì)你地引物、松地實(shí)現(xiàn)對(duì)你地引物、PCRPCR產(chǎn)物、產(chǎn)物、DNADNA模版鏈即模版鏈即時(shí)的濃度、體積、時(shí)的濃度、體積、ODOD值、值、分子量的轉(zhuǎn)換。分子量的轉(zhuǎn)換。該濃度窗口是一個(gè)強(qiáng)大的該濃度窗口是一個(gè)強(qiáng)大的時(shí)間保存計(jì)算器。時(shí)間保存計(jì)算器。OligoOligo不僅能以圖表的方式將結(jié)果展示出來，還能以文不僅能以圖表的方式將結(jié)果展示出來，還能以文本的形式保存。本的形式保存。在軟件所出現(xiàn)的任何一個(gè)窗口，選擇在軟件所出現(xiàn)的任何一個(gè)窗口，選擇Filedata AsFiledata As，把數(shù)據(jù)存為一個(gè)文本文件。把數(shù)據(jù)存為一個(gè)文本文件。文本保存的結(jié)果如下：文本保存的結(jié)果如下：最佳退火溫度最佳引物濃度、鹽濃度Primer premier 5Primer premier 5設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物OligoOligo引物評(píng)估引物評(píng)估 舉例說明：舉例說明：ncbincbi里查找里查找基因基因 LIF LIF 的的mRNAmRNA序列，序列，用用FASTAFASTA格式直接保格式直接保存改基因的存