1、細胞工程實驗報告專業：生物技術 班級： 0801 姓名：勵丹 學號： 30804305一、實驗目的1、了解動物細胞培養的相關實驗器材以及實驗前器材的清洗與消毒、無菌室滅菌與消毒等 基本方法，以建立起無菌操作的概念。2、了解和掌握動物細胞原代培養的基本方法，熟悉組織塊法和消化法培養的基本操作過程。初步掌握無菌操作技術。3、學習與了解細胞超低溫凍存于復蘇的基本原理，初步掌握培養細胞常規超低溫凍存于復 蘇以及玻璃化超低溫凍存于復蘇的方法。4、掌握 ELISA 測定抗體效價的方法，細胞的超低溫凍存和復蘇，及MTT法測定細胞活性的方法。5、學習和掌握制備飼養層細胞的方法，為雜交瘤細胞的制備做準備。6、學

2、習從脾臟組織制備免疫細胞的方法，從免疫脾臟中制備免疫細胞懸液，用于雜交瘤細 胞的融合。7、學習和掌握動物細胞融合的基本方法，通過免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細 胞，并進行選擇。8、學會細胞形態的觀察和分析，細胞技術等細胞培養中常見的問題。二、實驗原理1、原代培養原代細胞培養是指直接從動物體內獲取的細胞、 組織或器官， 經體外培養后直到第一次 傳代為止。 原代培養首先用無菌操作的方法， 從動物體內取出所需的組織或器官， 切成一定 大小的組織塊， 直接或經消化分散成單個游離的細胞， 在人工培養條件下， 使其不斷地生長、 繁殖。2、細胞活性測定 MTT法MTT 法是利用細胞線粒體呼吸鏈上的琥

3、珀酸脫氫酶四氮唑藍還原成難溶的藍紫色結晶 甲瓚，經二甲基亞砜（ DMS）O 溶解后，在 490nm處測吸收值，其吸收值可間接反映細胞 的活性狀態及活細胞數量。3、培養細胞的超低溫凍存于復蘇建立了細胞為了保持細胞株 （系） 遺傳的穩定性以及非連續使用細胞的長期保存， 超低溫凍存于復蘇技術。 目前細胞超低溫凍存技術主要有兩種方法， 即常規超低溫凍存和玻 璃化超低溫凍存。活細胞在超低溫下克服了分子間的熱運動， 因而可長期保存而不影響活力。 在不加任何條件下直接凍存細胞時， 細胞內和外環境中的水都會形成冰晶， 能導致細胞內發生機械損傷、 電解質升高、滲透壓改變、脫水、 PH 改變、蛋白變性等，能引起細

4、胞死亡。如向培養液加 入保護劑， 可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下， 能使細胞內水份在凍結前透出細胞。 貯存 在 130以下的低溫中能減少冰晶的形成。4、飼養層細胞的制備在體外培養細胞實驗中，對于難養的細胞或者數量較少的細胞，常常需要預先在培養 瓶或培養板底部加入一些活的原代細胞或者靜息的腫瘤細胞以輔助目的細胞的生長， 這就是 飼養層細胞。 它可能在飼養細胞的生長過程中會釋放一些細胞生長刺激因子或提供細胞接觸 的信號。5、免疫脾細胞的制備小鼠經抗原多次免疫后，可從脾臟組織細胞分裂和分化出較多能分泌相應抗體的 B 淋巴細胞， 脾臟內細胞連接不緊密可通過機械分離和過濾網篩選， 將這些細胞制備成游離

5、的單 個細胞懸液。6、雜交瘤細胞的制備（細胞融合）通過對免疫動物 B 細胞和某一個永久細胞系進行融合， 雜交后代稱之為雜交瘤。 雜交 瘤細胞可以將分泌特異性抗體 B 細胞的遺傳特性和骨髓瘤細胞系體外增殖的遺傳特性合二 為一。一種淋巴細胞克隆只產生一種特異性抗體； 細胞融合技術產生的雜交瘤細胞可以保持 親代雙方的特性；雜交瘤細胞的篩選，體外培養大量增殖，獲得所需抗體。7、ELISA 檢測使抗原或抗體結合到某種固相載體表面， 并保持其免疫活性。 使抗原或抗體 與某種酶連接成酶標抗原或抗體， 這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性， 又保 留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗

6、原或抗 體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。 用洗滌的方法使固相載體 上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開， 最后結合在固相載體上的酶量與標本 中受檢物質的量成一定的比例。 加入酶反應的底物后， 底物被酶催化變為有色產 物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關， 故可根據顏色反應的深淺刊物定 性或定量分析。 由于酶的催化頻率很高， 故可極大地地放大反應效果， 從而使測 定方法達到很高的敏感度。三、實驗內容1、動物細胞培養技術2、雜交瘤技術與單克隆抗體制備3、細胞工程相關技術1）動物細胞培養實驗器材的準備 無菌室：首次啟用的無菌室一般可采用福爾馬林熏蒸（56m2 無菌室用 KMnO4

7、 50g，倒入100ml 甲醛（用搪瓷盤） ，冒濃煙， 24hr ，氨水中和至無甲醛味） ，經常使用的無菌室在每次 實驗前必須開啟紫外燈照射 0.5 至 l 小時，然后避光 0.5 至 l 小時后方可進入操作。 培養器材的消毒：干熱滅菌法：玻璃器皿、金屬器具等的消毒方法，140150， 23 小時；濕熱滅菌法：橡膠制品、無菌衣、帽和口罩以及除菌過濾器的清毒，高壓蒸汽滅菌 15 磅 20 30分鐘；紫外線照射滅菌：多孔培養板的滅菌30 分鐘。抽濾除菌：培養基等（培養基通過 0.22 過濾裝置除菌）2）雜交瘤技術與單克隆抗體制備1、小鼠的免疫方法：脾臟直接注射：一般免疫后34 天即可制備抗體。其它

8、途徑注射：一般采用間隔免疫的方法，分 3 次，間隔 23 周進行免疫。步驟：取綿羊靜脈血 0.2mL（加肝素或枸櫞酸鈉抗凝）用 0.9 NaCl或 PBS 1000 1500rpm 離心 5 分鐘滌洗 3次，收集血細胞。 血球計數板計數， 用 0.9 NaCl或 PBS調整細胞濃度至 4107個/ml（10 個/小格）。 向小鼠腹腔注射血細胞懸液 0.5ml 。每隔 15 天重復注射作加強免疫， 共重復 2 次，第 2 次加強免疫后 10 天，檢測血清 效價，若血清效價低則要繼續免疫。小鼠處死前 23 天加強免疫 1次，以活化 B淋巴細胞。 注：細胞計數：一個大方格被分成 16 個中方格。每一

9、個大方格邊長為 1mm，蓋上蓋玻片后， 載玻片與蓋玻片之間的高度為 0.1mm，所以計數室的容積為 0.1mm3。一個大方格被分成 16 個中方格。 每一個大方格邊長為 1mm，蓋上蓋玻片后， 載玻片與蓋玻片之間的高度為 0.1mm， 所以計數室的容積為 0.1mm3。細胞濃度 （個 /ml ）=細胞數 / 體積即： 細胞濃度 （個 /ml ）= 一 個大格的細胞數 104。打入的免疫紅細胞數要在一定范圍內，細胞數量太多會免疫耐受； 太少得到的免疫細胞數少。2、小鼠血清的制備取五只沒有免疫過的小鼠 - 每只小鼠眼球取血 0.5mL以上于 1mLEP管中 小鼠短頸處死 后，放于裝有 75%酒精的

10、燒杯中消毒滅菌， 帶入無菌室備用取出血清放于37水浴保溫30min 2000 轉離心 10min取上清于干凈的離心管中，作為ELISA 的陰性對照取五只免疫過的小鼠同上操作取血清作為 ELISA 的陽性對照4、骨髓瘤細胞的培養1、選擇生長旺盛，形態良好的細胞2、將上清倒入離心管內， 剩余貼壁的細胞用 0.02 EDTA消化液消化細胞 5 分鐘后倒入同 一離心管， 1000 1500rpm 離心 5 分鐘，收集細胞。3、加 6mL含 10小牛血清的 DMEM培養液懸浮細胞，分裝于兩個細胞培養瓶，5CO2培養箱 37培養。5、飼養層細胞的制備1、每組 1 只小鼠，斷頸處死后浸泡在 75乙醇消毒 5

11、 分鐘。2、在無菌室內小心剪開小鼠腹部皮膚，暴露腹腔，用注射器腹腔注射34ml 1640 培養液，按摩片刻。3、左手用鑷子夾起腹腔肌肉，右手用剪刀剪開一個小口，小心用吸管吸出腹腔液體于離 心管。4 、低速離心洗滌細胞一次后，用 1215ml 1640 培養液懸浮細胞（ 5104） ，取 100200 l 滴 96 孔板（一般用吸管滴 23 滴）。5、免疫脾細胞的制備1. 將免疫過并取完血清后的浸泡在75乙醇中的小鼠帶入無菌室。2. 小心剪開腹腔，取出脾臟。3. 用一次性注射器將脾臟刺幾個洞，再吸34mLPBS液吹打脾臟。4. 收集吹打的細胞懸液，經低速離心洗滌后將細胞懸浮在培養液。6、雜交瘤細

12、胞的制備（細胞融合）1. 將骨髓瘤細胞 （2 107）與脾細胞按 1:10 的比例混合，低速離心后棄上清，用手指彈 勻細胞。2. 將 1mL50的 PEG在 1 分鐘內緩緩加到混合的細胞內， 注意邊滴加 PEG邊搖動離心管。3. PEG 作用 1 分鐘后，迅速滴加培養液終止PEG作用，低速離心洗滌細胞。4. 用 10mLDEME培養液懸浮融合細胞，按每孔 3 滴的量滴加到含滋養層的 96 孔板內，置 375 CO2培養箱中培養。（注：因為實驗時間有限，我們只是操練單克隆抗體的制備方法和過程，并沒有制備到 單克隆抗體，但是單克隆抗體的制備過程和操作注意事項已經基本了解。 ）3）原代細胞的培養 組

13、織塊法培養小鼠肝臟組織 :1. 取出肝臟，經 PBS漂洗三次后，放在表面皿中。2. 在表面皿中， 用滴管加入少量 PBS（RPMI1640含 20小牛血清， 0.2%白蛋白， 10ug/ml 胰島素， 100U 青霉素和鏈霉素）用鋒利的剪刀將組織塊剪成約1mm3的小塊。0.5cm，每3. 用彎頭鑷子將組織小塊移入細胞瓶中，把它們排列成行，每塊組織相距約瓶細胞貼 2030 小塊，隨即翻轉細胞瓶， 使貼組織塊的一面朝上， 然后加培養液 3ml。 4將細胞瓶置于 37， 5 CO2培養箱中靜置 24 小時，然后將瓶輕輕翻轉，使組織 塊浸入培養液中，繼續靜止培養。572 小時后在顯微鏡下檢查，若見細胞

14、自組織邊緣長出，則繼續培養3-5 日，再換部分或全部培養液，待多數組織塊的生長暈相接時，可進行傳代培養。肝細胞培養的實驗結果： 若培養液顯為淡黃且清澈，一般顯示細胞生長良好。培養 35 日，在相差顯微鏡下觀察， 若見細胞自組織邊緣長出， 更換部分或全部培養 液，待多數組織塊的生長暈相接，小心挑掉組織塊，繼續培養34 天。7 天左右后， 生長暈擴大到直徑為 15mm左右小鼠肝臟細胞原代培養的生長暈是多角形 上皮樣細胞與梭形細胞混合的細胞群體。2448 小時后若培養液變成黃色且混濁，表示已被污染； 若培養液變成紫色，一般細胞生長不好，則培養液pH過高；消化法培養小鼠腎細胞 :1、將消毒過的小鼠，剖

15、腹取出腎臟于放有的培養皿中洗滌。2、盡量剪碎腎臟。3、用洗滌次。4、加入 mL胰酶， 37（ 30min ）。5、過篩，轉離心 min ，用 PBS洗滌 23 次。6、加培養液，計數至 35105/Ml.（1.5 個每中格 ） 。7、細胞懸液裝瓶 3mL 放于 CO2培養箱培養。4）抗體 IgG ELISA 檢測1. 取 0.2ml 綿羊紅細胞，加 6ml PBS 1000rpm 離心 10min 洗滌，重復一次。2. 取下層紅細胞，加 1.2ml 磷酸鹽緩沖液（ Na2HPO45mmol/L, NaH2PO45mmol/L pH7.6）（低 滲）混勻后，常溫處理 2025min，412000

16、13000 rpm 離心 15min，去上清，重復一次。3. 取乳白色沉淀（血影）用包被液稀釋至后，按50g（老師制備） 加入 96 孔酶標板內，放于濕盒 4冰箱過夜，備用。4. 吸去孔中的抗原液（自制吸頭，這樣沖擊力會小，不會使包被的抗原脫落） ，用洗滌液洗 滌 3 次（將洗滌液沿孔壁注入 200 L/ 孔，放置 3 分鐘，甩去洗滌液，重新注入） ，加封閉 液（含 1牛血清白蛋白的洗滌液） 200 L/ 孔，封閉 30min。5. 甩去封閉液，用洗滌液 3 次。6. 待測抗體作 1:500 、1:1000 、1:2500 、1:5000 稀釋后，按每孔 100uL 加入，置濕盒內于 37作用

17、 1 小時。同時設陰性、陽性、空白對照（調零孔）。7. 用洗滌液 3 次。8. 每孔加適當稀釋的酶標兔抗鼠IgG試劑 100uL，置濕盒內 37作用 1小時。9. 用洗滌液 3 次。10. 每孔加入 100uL 新配制的底物溶液（ TMB），暗處室溫作用 5-10 分鐘。11. 每孔加 100 uL2MH2SO4 終止反應，檢測。12. 用酶聯免疫檢測儀測定 OD450nm光吸收值，若試驗孔的光吸收值比陰性孔的光吸收值大 于或等于 2.1 ，可判定為陽性。（注： TMB, 2MH2SO4操作時要帶手套， TMB中有過氧化氫對皮膚有腐蝕作用。酶標板在操作 過程中不能用手接觸其底部，會影響折光率，

18、在測吸光值時板底的水要擦干。 ）5）細胞的超低溫凍存與復蘇1. 小鼠斷頸處死后，分別取腎臟（剪碎） 、脾臟（注射器吹打）細胞， 10001500rpm 離心 5min，收集細胞。2. 用 1640 培養液懸浮細胞，計數，調整細胞密度至51062 107 個/ml ，分裝成 3 管，每管 0.8ml ，經以下處理后 -196 （液氮）凍存過夜。分組：A組：直接凍存；B 組：細胞懸浮在 10 DMSO-1640培養液中凍存；C 組：細胞先經 10濃度的玻璃化保護劑處理（ PVS2），4過渡 5min，然后 4 1000rpm 離心 10min，棄上清，再用 100 PVS2保護劑， 4 過渡 5m

19、in 后凍存；（注：為了 MTT法測定細胞活性比較三種方法時減小誤差，按C組平行離心 AB 組。）3、MTT法測定細胞活性1. 從液氮中取出凍存管， 直接投入 37 40的水浴中，并不時搖動，使其快速（ 1 分鐘 之內）融化。2. 轉移到 1.5ml 離心管后，加 0.5ml 1640 培養液， 1500rpm離心 5min，棄上清，收 集細胞。3. 用 0.5ml 1640培養液懸浮細胞后， 再加 80uL MTT反應液， 37水浴中培養 3小時。 4.15002000rpm 離心 5min，棄上清，收集細胞；再用 800uL DMSO溶解細胞，按每孔200uL的量轉移至 96孔酶標板內，室

20、溫放置 10 分鐘，并不時搖動，以溶解細胞。5. 無細胞組為調零孔。 選擇 570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定 MTT反應孔的光吸 收值（ OD570）6. 比較不同處理方法，細胞的存活情況。四、實驗結果及分析1、細胞培養觀察：培養液顯為淡黃且清澈，無污染現象；細胞呈球狀，密集2、細胞的超低溫凍存與復蘇后活性檢測：OD123410.0000.1060.1090.08720.0880.0890.06630.1010.1070.08540.0980.1120.07850.0840.0660.07360.0710.0760.06870.0610.0640.06380.1060.1260.0951

21、-1 ：調零孔-1 、2、3、4：腎細胞直接凍存-1 、2、3、4：腎細胞加 10%DMSO凍存-1 、2、3、4：腎細胞玻璃化凍存-5 、 6、7、 8：脾細胞直接凍存-5 、 6、7、 8：脾細胞加 10%DMSO凍存-5 、 6、7、 8：脾細胞加玻璃化凍存234234就結果而言：加 10%DMSO凍存的細胞存活率最高， 而理論上是玻璃化凍存的細胞存活率最高。從液氮中取出時玻璃化凍存也結成冰晶，與理論不符，實驗存在問題。 我們小組將兩只小鼠的細胞混在一起，細胞數增多，損傷也增多。3、ELISA 檢測：12345678910111210.000.160.120.040.020.200.13

22、0.060.0300834823420.000.150.120.040.020.190.130.050.0260647303830.010.160.140.050.030.180.120.070.0420265911940.000.160.130.040.010.190.120.040.0279107587850.040.120.080.020.020.180.090.040.0308762132060.160.120.080.020.020.150.090.030.0127772162770.180.130.090.020.010.160.090.040.0392575612780.130.

23、100.020.010.150.100.040.0450432327：調零孔、：、：陰性對照、：陽性對照、：、：、：于相同加入底物溶液（ TMB）后，陽性孔呈藍色，陰性孔無色；加入終止液后，陽性孔呈黃色，陰性孔無色。結果（ OD ）：陰性對照：陰性對照：陰性對照：陰性對照：陰性對照：陰性對照：陰性對照：陰性對照：陰性對照：（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（），為陽性就結果而言：以為準：陰性對照：陰性對照 ，為陰性則效價為：，為陽性以為準：陰性對照：陰性對照 ，為陰性則效價為：實驗時加液可能存在的誤差或不準確，使液面有高低，影響折光率，使實驗數據不準確；實驗時手碰到了

24、酶標板底部， 留有指紋等， 影響折光率， 使實驗數據不準確； 測 OD值時酶標板底部有水，影響折光率，使實驗數據不準確五、實驗要點及討論1、酶聯反應常見問題： 1 、顯色步驟結束后，所有孔均無色，陽性對照不顯色 原因：錯加、漏加試劑底物、顯色劑； 洗板及加樣過程中，酶標受污染失活，失去催化顯色劑顯色的能力； 終止液誤做洗滌液或底物溶液配制；蒸餾水有問題2 、所有孔均較淡原因：加入試劑的體積和時間有誤，或移液器槍頭不潔； 洗板及加樣過程中，酶標受污染失活，失去催化顯色劑顯色的能力； 培養時間及溫度為達到要求； 洗板次數過多，或洗滌液不符合要求，洗滌沖擊力太大，浸泡時間過久； 底物作用時間不夠3、

25、陰陽性對照正常，待測品未檢出 原因：樣品高溫放置過久，或反復凍溶致待測物濃度下降4、出現隨機性的花板、跳板現象 原因：樣品離心不完全，反應孔內發生凝血或殘留細胞成分； 加樣時交叉污染；手工洗板時造成交叉污染；5、假陽性原因：洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留；血清標本處理不當；加酶量過多；培養溫度超 37 度，或酶結合物反應時間或底物顯色超時；底物或樣品污染2、細胞超低溫凍存于復蘇的要點1. 冷凍速度冷凍速度也就是降溫的速度， 它與冷凍效果直接相關。 冷凍速度、 細胞收縮引起細胞膜 和細胞器的變化是造成損傷的主要因素目。 冷凍速度不同， 細胞內水分向細胞外流動的情況 也會不同。如果冷凍速度過慢，

26、細胞內水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，同時細胞內溶質 濃度增高， 細胞內不發生結冰； 冷凍速度過快，細胞內水分沒有足夠時間外滲，隨著溫度的 下降， 細胞內會發生結冰； 如果冷凍速度非常快， 細胞內形成的冰晶反而非常小或不結冰而 呈玻璃狀凝固 （ 玻璃化冷凍 ）。不同細胞的最適冷凍速度不同， 主要取決于水分滲透過程是否與降溫速度相匹配； 同時 還取決于細胞的表面積與體積之比， 以及細胞膜的滲透率。 一般來說。 小細胞 （ 如紅細胞等 ） 對水通透性強，適用于快凍，最佳冷凍速率較高，可達103oC min 或更高；相反大的細胞或組織，如直徑 100 m以上的胚胎，對水的通透性弱，則適于慢凍。此外，最佳冷凍速度還 受是否應用防凍劑、 防凍劑的含量以及培養的細胞所處的狀態等多方面的因素影響。 目前被 普遍接受的是皮