1、理解分子熒光分析的基本原理理解激發光譜發射光譜 同步光譜 三維熒光光譜的含義掌握分子熒光發射光譜的特性了解熒光光譜儀器的組成及各部分作用掌握影響熒光強度的內部結構因素和外部環境因素了解光譜分析法的應用范圍第一章 分子熒光光譜分析1概述分子熒光光譜分析也叫熒光分光光度法，是當前普遍使用并有發展前途的一種光譜分析技術。物質的分子吸收了紫外和可見光后它的電子躍遷到激發態，然后以熱能的形式將這一部分能量釋放出來，本身回復到基態。如果吸收輻射能后處于電子激發態的分子以發射輻射的方式釋放這一部分能量，再發射的波長可以同分子所吸收的波長相同也可以不同，這個現象叫光致發光，最常見的光致發光現象是熒光和磷光。當

2、用一種波長的光照射某種物質時，這個物質會在極短的時間內發射出比照射波長更長的光，這種光稱為熒光。對于熒光來說，當激發光停止照射后，發光過程幾乎立即（10-9-10-6 S）停止;當用一種波長的光照射某種物質時，這如果種物質在較長的時間內發射出比照射波長更長的光，這種光稱為磷光。對于磷光來說，當激發光停止照射后，發光過程將持續一段時間（10-1-10 S）;磷光和熒光的發光機理是不同的。由于物質分子結構不同，所吸收的光的波長和發射的熒光波長也有所不同，利用這個特性可以定性鑒別物質。同一種分子結構的物質用同一波長的激發光照射可以發射相同波長的熒光，若該物質的濃度不同，則濃度大時，所發射的熒光強度也

3、強，利用這個性質可以進行定量測定。用熒光進行定性和定量的方法叫熒光分析法。2熒光分析的原理2.1分子熒光發生過程 熒光與磷光.1 分子的電子能級與激發過程分子除了電子不斷運動外，分子本身還有振動和轉動。量子力學表明，這些運動的能量是量子化的，所以分子有電子能級，分子振動能級，及分子轉動能級。每個電子能級中有包含一系列的振動能級和轉動能級。.圖1 分子電子能級，振動能級和轉動能級示意圖室溫下大多數分子處于基態的最低振動能級。處于基態的分子吸收能量（電能，熱能， 光能，化學能）后被激發為激發態。激發態不穩定將很快衰變為基態，若返回到基態伴隨著光子的輻射，這種現象稱為發光。現在從分子結構上討論熒光發

4、光產生的機理。每個分子具有一系列嚴格分立的能級，稱為電子能級。而每個電子能級中又包含者一系列振動能級和轉動能級。我們用S0 S1 Sn表示電子的基態，第一電子激發的單線態和第N電子激發的單線態。T1表示第一電子激發的三線態。電子激發的單線態和相應的三線態的區別在于電子自旋方向不同，另外三線態的能級稍微低一些。電子能態的的多重性用M= 2S+1表示 , S為電子自旋量子數的代數和，其數值為0或1。大多數分子含有偶數個電子。基態時這些電子成對地填充在能量最低的各個軌道中。根據Pauli不相容原理,一個給定軌道中的兩個電子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子數分別為1/2和-1/2，其總自旋量子數S

5、=0，就是說基態沒有凈自旋。分子的多重度M=1，該分子體系便處于單線態，用符號S表示。大多數有機物分子的基態是處于單線態的。基態分子在吸收光能后其價電子從成鍵軌道或非成鍵軌道躍遷到高能量的反鍵軌道上，產生激發態分子，此為分子光吸收過程。但是激發態分子不穩定，通常很快失去能量回到基態。如果激發態分子在返回基態時以光輻射的形式失去能量，這種光輻射過程叫做光致發光。分子吸收能量后，如果電子在躍遷過程中不發生自旋方向的改變，這時分子處于激發的單線態。分子吸收能量后如果電子在躍遷過程中伴隨自旋方向的改變，這時分子便具有兩個自旋不配對的電子。即S=1，分子的多重度M= 2*1+1=3，這時分子處于激發的三

6、線態，用符號T表示。處于分立軌道上的非成對電子，平行自旋比成對自旋更穩定些（洪特規則）。因此三線態的能級總是比相應的單線態能級略低。 單線基態 激發單線態 激發三線態 圖 2 單線態和三線態.2 熒光的產生 根據波滋曼分布(Boltzmann distribution ) 分子在室溫時基本上處于電子能級的基態，當吸收了紫外可見光后，基態分子中的電子只能躍遷到激發單線態的各個不同振動-轉動能級，根據自旋禁率, 不能直接躍遷到激發三線態的振動-轉動能級。處于激發態的分子是不穩定的，它可能通過輻射躍遷和無輻射躍遷等多種分子內去活化過程釋放多余的能量而返回基態，發射熒光是其中途徑之一。下面幾種方式為基

7、本去活化過程；振動弛豫：(VR vibrational relaxation ) 在溶液中的物質分子受入射光激發后形成的激發態分子，通過與溶劑分子碰撞，將部分能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回同一電子激發態的最低振動能級。在這個過程中，分子被激發時吸收的能量不是以發出光輻射的形式耗散，因而屬于無輻射躍遷。振動弛豫只能在同一電子能級進行，所需時間約為10-8秒數量級。內轉換：(IC Internal conversion): 指相同多重態電子能級中等能級間的一種無輻射躍遷過程。當兩個電子激發態之間能量相差較小，以至其振動能級有重疊時，則可能發生電子由高能級以無輻射躍遷方式轉移到低電子能級的激發態。

8、上述的振動能級之間很接近時，內部能量轉換容易發生。外轉換（Ecexternal conversion）： 溶液中激發態分子與溶劑分子及其他溶質分子之間發生碰撞而消耗能量，所消耗的能量轉換為熱能。外轉換常發生在第一激發單線態或第一激發三線態的最低振動能級向基態轉換的過程中。轉換時間為10-9-10-7秒，其發生可以降低熒光強度，這一現象叫熒光熄滅或猝滅。系間跨越 (Intersystem crossing, ISC)： 系間跨越指不同多重度狀態之間的一種無輻射躍遷過程。它涉及到受激電子自旋狀態的改變S1T1，使原來兩個自旋配對的兩個電子不再配對，這種躍遷是禁阻的，但如果兩個電子的能級的振動能級有

9、較大的重疊時，例如激發單線態S1的最低振動能級與激發三線態T1的較高振動能級重疊, 則可能通過自旋-軌道耦合等作用使S1態轉入T1態的某一振動能級.。系間跨越可以使熒光強度減弱或熄滅。熒光發射： （Fluorescence emission）.當分子被激發到任意一個激發單線態，并通過內轉換及振動弛豫返回到第一激發單線態的最低振動能級后， 再以輻射形式發射光量子并返回到基態的各個不同的振動能級上，在這個過程中發射的光量子即稱作熒光。由于從較高的激發態的振動能級返回到第一激發單線態的最低振動能級耗散了部分能量，熒光的能量小于激發光能量，所以發射熒光的波長比激發光的波長要長。發射熒光的過程約需10-

10、910-7秒，電子返回到基態時可以停留在基態的任意振動能級上，因此得到的熒光譜線有時呈現幾個互相靠近的峰。通過進一步振動弛豫，這些電子很快回到基態的最低振動能級。根據kasha 規則，熒光多為S1S0躍遷。熒光產生的過程和條件：熒光物質產生熒光的過程可以分為4個步驟1 處于基態最低振動能級的熒光物質分子受到紫外線的照射，吸收了和它所具有的特征頻率相一致的光線，躍遷到第一電子激發態的各個振動能級；2被激發到第一電子激發態的各個振動能級的分子，通過無輻射躍遷，返回到第一電子激發態的最低振動能級；3返回到第一電子激發態的最低振動能級的分子繼續降落到基態的各個不同振動能級，同時發射出相應的光量子，這就

11、是熒光；4 到達基態的各個不同振動能級的分子，再通過無輻射躍遷最后返回的基態的最低振動能級。磷光發射 激發態分子通過振動弛豫下降到第一電子激發態的最低振動能級后，有可能經過體系間跨越轉移到激發三線態的高振動能級上。從單線態到三線態的分子系間跨越躍遷發生后，接著發生快速的振動弛豫而達到三線態的最低振動能級上。分子在三線態的最低振動能級可以停留一段時間，然后發出光輻射躍遷至基態的各個振動能級，這種光輻射叫磷光。磷光與熒光的根本區別是熒光是由激發單線態最低振動能級至基態各振動能級間躍遷產生的。由于激發三線態的最低振動能級比激發單線態的最低振動能級能量低，故磷光輻射的能量比熒光更小，亦即磷光的波長比熒

12、光更長。從紫外光照射到發射熒光的時間約為10 8秒10 5秒，而發射磷光則更遲一些，約在照射后10 4秒10秒。 圖 2 熒光的產生分子熒光的激發光譜與發射光譜任何熒光化合物都有兩個特征光譜： 激發光譜和發射光譜，這是定性和定量分析的基本參數和依據。激發光譜：熒光是光致發光，因此必須選擇合適的激發波長。這可由激發光譜曲線來確定。繪制激發光譜曲線時選擇熒光的最大發射波長為測量波長，改變激發光的波長，測定熒光強度的變化。以激發光波長為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，即可得到熒光化合物的激發光譜。激發光譜的形狀與吸收光譜的形狀極為相似，經校正后的真實激發光譜與吸收光譜不僅形狀相同，而且波長位置也一樣，

13、這是因為物質分子吸收能量的過程就是激發過程。區別在于紫外吸收光譜測定對紫外光的的吸收度，而熒光激發光譜測定發射的熒光強度。發射光譜： 簡稱熒光光譜。將激發光波長固定在最大激發波長處，然后掃描發射波長，測定不同發射波長處的熒光強度得到熒光發射光譜。圖3 是室溫下蒽在環己烷溶液中熒光激發光譜和發射光譜。從圖中可見在蒽的激發光譜中350nm 激發峰處有幾個小峰，這是由于吸收能量后由基態躍遷到第一電子激發態中各個不同振動能級引起的。在蒽的發射光譜中也有幾個小峰，這是由于蒽分子從激發態中各個不同振動能級躍遷到基態中不同振動能級發射出的熒光量子的能量不同引起的。熒光光譜的特征： .1 Stockes位移

14、在溶液熒光光譜中觀察到的熒光發射光波長總是大于激發光波長，Stockes 1852年首先觀察到這種波長移動現象，因而稱之為Stockes位移。激發峰位和發射峰位的波長差稱為Stockes位移，它表示分子回到基態之前，在激發態壽命期間的能量消耗。用公式表示如下：單位是cm-1Stockes位移=10 7(1/lex -1/lem)lexlem 分別為校正后的最大激發波長和發射波長。Stockes位移說明在激發和發射之間存在著一定能量損失，激發態分子通過內轉換和振動馳豫過程迅速到達第一激發單線態的最低振動能級，這是產生Stockes位移的主要原因。激發態分子與溶劑分子的碰撞也造成能量損失，加大了S

15、tockes位移。.2熒光發射光譜的形狀與激發波長無關原因：熒光分子吸收了不同波長的激發光后可被激發到不同能級，然后通過振動弛豫和內部能量轉換, 最終都將回到第一激發單線態的最低振動能級，再發射熒光。因此熒光發射與熒光物質的分子發射到哪個能級無關，即與激發能量無關。一般說來， 熒光發射光譜的形狀與激發波長的選擇無關，激發電子都是從電子第一激發態的最低振動能級返回到基態的各個振動能級，所以熒光發射光譜的形狀與激發波長無關。.3 熒光光譜與激發光譜的鏡像關系熒光物質的熒光發射光譜與激發光譜存在著近似的“鏡像對稱”關系。圖 3是蒽的熒光激發和發射光譜圖.。 蒽的熒光激發光譜左邊灰色圖譜有一個a峰它是

16、由分子吸收光后能后從基態S0躍遷到第二電子激發態S2形成的。在高分辨率的熒光光譜圖上可以觀察到B0 b1、b2、b3、b4 、等小峰組成的一蔟，他們分別由是由分子吸收光能后從基態S0躍遷到第一電子激發態S1的各個振動能級形成的（見光譜圖上方與之對應的能級示意圖）。各小峰間波長遞減值Dl與振動能級差DE有關，各個小峰的高度與躍遷幾率有關（b1的躍遷幾率最大，b0次之，b2、b3、b4依次遞減。蒽的熒光發射光譜（右邊黑色圖譜）同樣包含C0、C1、C2、C3、C4 一蔟小峰, 他們分別由分子從第一電子激發態S1的最低振動能級躍遷至基態S0的各個振動能級發出光輻射形成的。由于電子基態的振動能級分布與與

17、激發態相似但不相同 , b1峰與 c1 峰b2峰與c2峰都是以 lb2 為中心基本對稱。再加上C0、C1、C2、等峰的高度也與躍遷幾率有關，c1的躍遷幾率最大，c0次之，c2、c3、c4依次遞減.）因此形成了激發光譜和熒光發射光譜的對稱鏡像現象。2.2熒光與分子結構的關系熒光與分子結構的關系是一個比較重要問題，弄清他們之間的關系可以預示分子能否發生熒光，在什麼條件下發生熒光。這對研究分子熒光分析的應用很有意義。熒光壽命與熒光效率熒光壽命與熒光效率是熒光物質重要的發光參數熒光壽命Fluorescence life time)：當除去激發光源后，分子的熒光強度降低到激發時最大熒光強度的1/e所需的

18、時間稱為熒光壽命。常用tf。表示。當熒光物質受到一個極短的光脈沖激發后，它從激發態躍遷到基態的變化可用指數衰減規則表示：Ft=F0e-Kt. 式中F0， ，Ft 分別是在激發開始t=0和激發后時間 t 的熒光強度，K是衰減常數。假定在時間t=tf 測得得熒光強度 Ft 為F0的1/e，即Ft=1/e F0， 根據上述公式，1/e F0= F0e-Ktf ， 由此得到1/e= e-Ktf Ktf=1，K=1/tf所以上述公式可以寫成Ft=F0e-Ktf 或者 Ln F0/Ft = t/tf如果以Ln F0/Ft對時間t作圖 ，直線斜率即為1/tf。由此可以計算出熒光壽命。利用分子熒光壽命的差別，

19、可以進行熒光混合物的分析。熒光效率（Fluorescence Efficiency）：又稱為熒光量子產率(Fluorescencequantum yield)；是指激發態分子發射熒光的光子數與基態分子吸收激發光的光子數之比，它表示物質發射熒光的能力。通常用下式表示jfjf =發射熒光的光子/吸收激發光的光子= Kf/( Kf + Ki ) Kf 熒光發射過程的速率常數，Ki 為其他有關過程的速率常數之和。許多物質并不發射熒光，因為在激發態分子釋放激發能的過程中除了熒光發射外，還有許多輻射和非輻射躍遷過程與之競爭。 如果在受激分子回到基態過程中沒有其它去活化過程與熒光發射過程進行競爭，那麼在這一

20、段時間內，所有激發態分子都將以發射熒光的方式回到基態，這一體系的熒光效率等于1。事實上，任何物質的熒光效率不可能等于1，而是在01 之間。例如一些被作為熒光標準物質的9-氨基口丫啶（在水中），為0.99；蒽在乙醇中為0.30 ;硫酸奎寧二水化合物（在0.5 mol/l硫酸溶液中）為0.55。熒光效率低的物質即使有較強的紫外吸收，所吸收的能量都以無幅射躍遷形式釋放，內轉換外轉換的速度很快，所以沒有熒光發射。分子結構與熒光的關系.1物質分子產生熒光的條件物質分子產生熒光必須具備兩個條件；1物質分子必須具有與照射的輻射頻率相適應的吸收結構，才能吸收激發光； 實驗表明，分子結構中含有pp*躍遷或np*

21、躍遷的化合物都有紫外可見吸收，但np*躍遷引起的R帶是弱吸收帶，電子躍遷幾率小，由此引起的熒光很弱。所以實際上只有分子結構中存在pp*躍遷，也就是K帶強吸收時才可能有熒光發生。2 吸收了與其本身特征頻率相同的能量后必須具有一定的熒光量子產率。.2分子結構與熒光性質熒光通常發生在具有共軛雙鍵體系的分子中。能產生熒光的分子都具有共軛雙鍵和大p鍵。長共軛結構絕大多數熒光物質都含有芳環或雜環，因為具有這些結構的分子具有長共軛的pp*躍遷。p電子的共軛程度越大，熒光強度越大，而熒光波長也將紅移。如苯萘蕙三個化合物的共軛結構與所發射的熒光的關系如下 ：苯 萘 蕙lex 205nm 286 356lem 2

22、78 321 404 jf 0.11 0.29 0.36 除了芳香烴外，含有長共軛雙鍵的的脂肪烴也可能有熒光，但這一類化合物的數目不多。維生素A是能夠發射熒光的脂肪烴之一。分子的剛性和共平面性在同樣的長共軛分子中，分子的剛性和共平面性越大，熒光效率越大，且熒光波長產生長移。例如，在相似的測定條件下，聯苯和芴的熒光效率分別為0.18 和1，芴的分子中亞甲基使其分子的剛性增加，兩個苯環不能自由旋轉，共軛電子的共平面性增加，使芴的熒光效率大大增加。導致兩者的熒光性質有顯著差別。聯苯 芴 同樣情況還有酚酞和熒光素。他們分子中共軛雙健長度相同，但熒光素分子中多一個氧橋，使分子中三個環成一個平面，隨著分子

23、剛性和共平面性增加，p電子的共軛程度增加，因而熒光素有很強烈的熒光，而酚酞的熒光則很弱。不發生熒光或發生較弱熒光的物質與金屬離子形成配位化合物后，如果剛性和共平面性增強，那麼就可以發生熒光或熒光增強。如 8-羥基喹啉是弱的熒光物質，與鎂，鋁離子形成配位化合物后，熒光就增強。8-羥基喹啉 8-羥基喹啉鎂配合物如果原來結構中共平面性較好，但分子中取代了較大的基團，由于位阻的原因使分子的共平面性下降，則熒光會減弱。例如：1-二甲氨基萘-8-磺酸鹽的jf = 0。03，而2-二甲氨基萘-8-磺酸鹽的jf = 0.75, 這是因為二甲氨基與磺酸鹽之間的位阻效應，使分子發生了扭轉，兩個環共平面性變差，結果

24、熒光減弱。結構式 結構式2-二甲氨基萘-8-磺酸鈉 1-二甲氨基萘-8-磺酸鈉jf = 0.75 jf = 0.03 對于順反異構體，順式分子的兩個基團在同一側，由于位阻效應使分子不能公平面而沒有熒光。例如 1，2 二苯乙烯的反式異構體就有強烈熒光，而其順式異構體就沒有熒光發射。取代基效應熒光物質分子上的各種取代基對分子的熒光光譜和熒光強度都會產生很大的影響。取代基可以分為3類：第一類取代基 為給電子基團：包括 OH、 OR、 NH2、 CN、 NR2等使熒光增強。這是因為產生了Pp共軛作用，增強了p電子的共軛程度，使最低激發三線態與基態之間的躍遷幾率加大的緣故。第二類取代基 為吸電子基團：如

25、 COOH， C=O， NO2, NO, SH , NHCOCH3, Cl, Br,I ，由于減弱了分子p電子的共軛程度，從而減弱甚至猝滅熒光。第三類取代基：對電子的共軛作用較小對熒光影響不明顯。如R SO3H， NH3 。表1 列出了部分取代基對苯的熒光效率和強度的影響.表 1 苯環取代基在乙醇溶液中的熒光相對強度化合物 分子式 熒光波長 熒光相對強度苯 C6H6 270-310 10甲苯 C6H5CH3 270- 320 17 丙基苯 C6H5C3H7 270- 320 17 氟代苯 C6H5F 270-320 10 氯代苯 C6H5Cl 275-345 7 溴代苯 C6H5Br 290-

26、380 5 碘代苯 C6H5I - 0苯酚 C6H5OH 285-365 18 酚離子 C6H5O+ 310-400 10 苯甲醚 C6H5O- 285-345 20苯胺 C6H5 NH2 310-405 20苯胺離子 C6H5NH3+ - 0苯甲酸 C6H5 COOH 310-390 3苯基氰 C6H5CN 280-360 20硝基苯 C6H5NO2 - 0 - 取代基位置對應光強度有影響。對芳烴而言，一般鄰位對位取代基增強熒光。間位取代基抑制熒光（CN例外）。當取代基存在使共軛增加時，取代基影響下降。當兩個取代基共存，可能其中一個起主導作用。重原子取代基存在如I- 則會使熒光減弱。這是因為

27、重原子的存在，使熒光體的電子自旋-軌道耦合作用加強，S1 T1間的跨越顯著增強的緣故。2.3影響熒光強度的外部因素分子所處的外界環境如溫度、溶劑、酸度、熒光猝滅劑等，都能影響熒光效率，甚至影響分子結構及立體構象，從而影響熒光光譜的的形狀和強度。了解和利用這些因素的影響，有助于提高熒光分析的靈敏度和選擇性。 溫度溫度對熒光強度影響敏感。在一般情況下，隨著溫度的升高，溶液中熒光物質的熒光效率和熒光強度將降低。因為當溫度升高時分子運動速度加快，分子間碰撞幾率增加，使無輻射躍遷增加，從而降低了熒光強度。例如熒光素鈉的乙醇溶液在零度以下溫度每下降10度，jf增加3%，在零下80度時jf接近1。溶劑溶劑的

28、影響分為一般溶劑效應和特殊溶劑效應。一般溶劑效應指溶劑的折射率和介電常數的影響 。特殊溶劑效應指熒光體和溶劑分子之間的特殊化學作用，如氫健的形成和化合作用。一般溶劑效應是普遍的，而特殊溶劑效應則取決于溶劑和熒光體的化學結構.。特殊溶劑效應大于一般溶劑效應的影響。同一熒光物質在不同溶劑中，其熒光光譜形狀和強度都有差別。一般情況下，熒光波長隨溶劑的極性增大而紅移，熒光強度增強。因為在極性溶劑中，pp*躍遷所需的能量差DE減少，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均紅移，熒光強度增大。溶劑粘度減少，分子碰撞機會增加使無輻射躍遷增加 而熒光減弱，故熒光強度隨溶液的黏度降低而減弱。一般溫度上升

29、，溶劑黏度變小，因此溫度上升熒光強度下降。溶液的pH當熒光物質本身是弱酸或弱堿時，溶液的酸度對熒光物質分子的熒光強度有較大的影響。這是因為其分子結構和離子結構是不同的，它們的電子構型不同，在不同的酸度條件下分子和離子之間的平衡發生改變，因此熒光強度發生改變 。每一種熒光物質的分子都有其最適宜的發射熒光的存在形式，即最適宜的pH 范圍 。在pH 7-12 的溶液中， 苯胺以分子形式存在，會發生蘭色熒光，但在pH2 或 13的溶液中苯胺以離子形式存在不發生熒光。金屬離子與有機試劑形成的發光螯合物也受溶液pH值的影響。一方面pH值會影響螯合物的形成，另一方面也影響螯合物的組成，因而影響他們的熒光性質

30、。例如鎵與2，2二羥基偶氮苯在pH 3-4的溶液中形成1：1的螯合物，能發射熒光。而在pH 6-7的溶液中則形成非熒光性的1：2型螯合物。2 3 4溶液熒光的猝滅 熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現象叫熒光猝滅。能引起熒光強度降低的物質叫猝滅劑。熒光猝滅的形式：碰撞猝滅：是熒光猝滅的主要類型。處于激發單線態的熒光分子M*與猝滅劑分子Q相碰撞，使熒光分子以無輻射躍遷的形式回到基態，產生猝滅作用。這一過程可以表示如下：碰撞猝滅 M+ hn M* M+hn (發生熒光)M (非輻射猝滅)M+Q （碰撞猝滅） 靜態猝滅： 由于部分熒光物質分子M與猝滅劑分子Q 生成了本身

31、不發生熒光的的配位化合物而產生。這一過程往往還會引起溶液吸收光譜的改變。轉入三線態猝滅：在熒光物質分子中，引入溴和碘后易發生體系間跨越，而轉變為三線態。轉變為三線態的分子在常溫下不發光，他們在與其它分子碰撞中消耗能量而引起熒光猝滅。溶解氧引起的熒光猝滅：溶解氧的存在使熒光物質氧化，或者由于氧分子的順磁性，促進了熒光物質激發態分子體系間跨越躍遷，使激發單線態的熒光分子轉變至三線態，從而引起熒光熄滅。 發生電子轉移反應的熒光猝滅：某些猝滅劑分子與熒光物質分子相互作用發生了電子轉移反應，引起熒光猝滅。如甲基藍溶液的熒光被Fe2+ 離子猝滅就是這種情況。其他的I- 、Br、 CNS- 、S2O32-

32、等易給出電子的陰離子，對奎寧，羅丹明及熒光素鈉的物質的熒光也會發生猝滅作用。熒光物質的自猝滅：在濃度較高的熒光物質溶液中往往會發生自猝滅現象。其原因是單線激發態的分子在發生熒光之前和未激發的熒光分子碰撞引起自熄滅，如蒽和苯。有些熒光物質分子在溶液濃度高時會形成二聚體或多聚體，使其吸收光譜發生變化，也引起溶液熒光強度的降低或消失。解決方法： 稀釋樣品； 標準加入法。Stop 散射光的干擾當一束平行光照射在液體樣品上，大部分光線透過溶液，小部分由于光子和物質分子相碰撞，使光子的運動方向發生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。瑞利散射：當光子和物質分子發生彈性碰撞時，不發生能量交換，僅僅是光子的

33、運動方向發生改變，這種散射叫瑞利散射光。其波長與入射光波長相同。 拉曼散射：光子和物質分子發生非彈性碰撞時，在光子運動方向發生改變的同時，光子與物質分子發生能量交換。光子把部分能量轉給物質分子后，在一定條件下，分子所獲得的能量使得圍繞其中某一健分布的電子云產生瞬時彈性變形，這時輻射能量暫時保留在變形的極化分子的一個虛態上。這個虛態并不存在常規電子能級圖中，電子在那里只能保持10-15-10-14秒時間，隨后回到其電子能態基態的不同振動能級上，發射出比入射波長長或稍短的光，稱為拉曼光。散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，因為一般同時產生的多條拉曼輻射線，可以復合成一個覆蓋

34、一定波長范圍的較寬的帶，如果這種輻射帶正好和熒光輻射的波長相近，就會對熒光測定產生干擾。因此在熒光測定中必須采取措施避免這種干擾。選擇適當的激發波長可以消除拉曼光的干擾。以硫酸奎寧為例。從圖4可見，無論選320nm或者350nm 為激發光,熒光峰總是在448 nm。分別在320nm和350nm激發光下測定空白溶劑的發射光譜， （這種情況下并沒有發生熒光發射，得到的是拉曼散射光）。從圖b 可見， 當激發波長為320 nm 時瑞利光波長是320 nm ，拉曼光波長是360 nm ，拉曼光對熒光無影響；。當激發波長為350 nm 時瑞利光波長是350 nm ，拉曼光波長是 400 nm ，拉曼光對熒

35、光有干擾，因而影響測定結果。圖4 硫酸奎寧在不同波長激發下的熒光與散射光譜水， 乙醇，環己烷，四氯化碳，氯仿這5種溶劑是最常用的溶劑，他們自身都能發射拉曼散射光，從而可能干擾熒光測定。表2 列出了不同波長激發光照射下的拉曼輻射波長，可供選擇激發波長或溶劑時參考。表2 不同波長激發光下主要溶劑的拉曼光波長溶劑 激發波長 248 313 365 405 436 - 水 271 350 416 469 511 乙醇 267 344 409 459 500 環己烷 267 344 408 458 499四氯化碳 - 320 375 418 450氯仿 - 346 410 461 502 內濾光作用和自

36、吸收現象 溶液中如果存在著能吸收激發或熒光物質所發射的光能的物質，就會使熒光減弱，這種現象稱為“內濾光作用“。例如在1ng/ml的色氨酸溶液中如果有重鉻酸鉀存在，由于在色氨酸的激發和發射峰附近正好是重鉻酸鉀的兩個吸收峰，吸收了色氨酸的激發能和色氨酸發射的熒光，使測得的色氨酸熒光大大降低。內濾光作用的另一種情況是熒光物質的熒光發射光譜短波長一端與與該物質的吸收光譜的長波長的一端有重疊。在溶液濃度較大時一部分熒光發射被自身吸收，產生所謂自吸收現象，降低了溶液的熒光強度。3定量分析方法3.1強度與濃度的關系由于熒光物質是在吸收光能被激發之后才發射熒光的，因此溶液的熒光強度與該溶液中熒光物質吸收光能的

37、程度以及熒光效率有關。溶液中熒光物質被入射光（I0）激發后可以在溶液的各個方向觀察熒光強度（F）。.但由于激發光有部分透過（I），這部分透過的入射光會干擾對熒光的測定，因此應該在與激發光源垂直的方向進行測定。設溶液中熒光物質的濃度為C，液層厚度為L，熒光強度F正比于被熒光物質吸收的光強度，即：F (I0It) ，F IaF= K Ia, 公式中K為常數, 其數值取決于熒光效率。根據Lambert Beer定律Ia= I0It=I0 (110-ECL) = I0 (1e -2.3ECL)e -2.3ECL =1+ (-2.3ECL)1/1! +(-2.3ECL)2/2!+(-2.3ECL)3/3

38、! +(-2.3ECL)4/4!+.若濃度很小，ECL值也很小，ECL0.05時 ，式中第二項以后的各項可以省略，于是e -2.3ECL =1 2.3ECL F = K Ia = K I0 (1e -2.3ECL)= 2.3 K I0 ECL 當入射光光強度和液層厚度一定，上式簡寫為F= KC 在低濃度時溶液的熒光強度與溶液中熒光物質的濃度呈線性關系。熒光分析方法定量的依據是熒光強度與熒光物質的濃度的線性關系，而熒光強度的靈敏度取決于檢測器的靈敏度，即只要改進光電倍增管和放大系統使極弱的熒光也能被檢測到，可以測定很稀的溶液的濃度，因此熒光分析法的靈敏度很高。3.2定量分析方法標準曲線法：濃度為

39、橫坐標，熒光強度為縱坐標繪制工作曲線，在同樣實驗條件下測定樣品溶液。在繪制工作曲線時常采用系列中某一個標準溶液作為基準，將空白溶液的熒光強度讀數調到0% 將該標準溶液的熒光強度調到100%或50%。在實際工作中當儀器調零之后先測定空白溶液的熒光強度，然后再測定標準溶液的熒光強度, 從后者減去前者即可, 然后繪制標準曲線。為了使在不同時間所繪制的標準曲線能夠一致，在每次繪制曲線時均采用同一個標準溶液對儀器進行校正。如果試樣在紫外光下不穩定，可以改用另一種穩定的標準溶液作為基準，只要其熒光峰和試樣溶液的熒光峰相近似，例如測定維生素B1時，可采用硫酸奎寧作為基準。在使用工曲線法定量時須注意熒光分析所

40、用的試劑標準品一定要純，樣品池要清潔。被分析的樣品不能用激發光長時間照射，以免熒光物質發生分解。標準溶液樣品溶液應該在同一條件進行測定熒光強度。熒光猝滅法； 在一般熒光分析方法中一些熒光猝滅劑應該事先分離。但也可以利用猝滅現象用于熒光分析。若某一物質本身不會發射熒光，也不與其他物質形成熒光物質，但他們會使另一種發射熒光的物質熒光強度下降，下降程度與該物質的濃度成比例，以次建立的熒光分析方法叫熒光猝滅法。例如氟離子會使鋁-八羥基喹啉洛和物的熒光強度下降，在適當條件下熒光強度與氟離子的濃度成反比例，可用于痕量氟的測定。動力學熒光分析法化學反應時其中反應物或產物中有熒光物質，隨著反應的進行，因為濃度

41、變化引起熒光強度隨時間的變化，可以求出物質的含量，以此建立動力學熒光分析法。例如Fe(III) pH=3.4時，1，4二氨基-2，3二氫蒽醌（A）與其發生氧化還原反應，產生深綠色熒光產物（B）, (lex =400nm, lem= 470nm), 反應式Fe(III) + H+ +A Fe(II) + B 當pH值一定時dB/dt = hA Fe(III)式中t 為時間； h為比例常數。在反應初期可以認為A不變，并對上式進行積分，則B= hFe(III)t又由于IFB = kB， 公式中IFB為熒光物質的發射強度，則有IFB = hFe(III) t或 IFB /t= hFe(III)通過測量

42、不同Fe(III)下的標準系列濃度，由Fe(III)對IFB /t作圖，得到工作曲線。如果有些化學反應的產物雖能夠產生熒光但反應進行緩慢，而在加入某些微量金屬離子的催化作用下，反應速率加快，熒光強度隨之增強，那麼反應速率與該痕量金屬離子濃度存在著定量關系，以此可以測量作為催化劑的痕量金屬，此法成為催化熒光測定方法。直接比較法 也叫比例法。如果熒光分析方法的標準曲線通過原點，就可以選擇其線性范圍，用比例法進行測定。取一個標準溶液使其濃度在線性范圍內,測定其熒光強度Fs。之后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度Fx， 然后計算物質的含量。空白溶液的熒光強度調不到0%，必須從標準和試樣的值扣除空白溶液

43、的熒光強度F0，然后計算。Fs F0 =K CsFx F0 =K Cx對于同一熒光物質，常數K相同（Fs F0 ）/（Fx F0）= Cs /CxCx =（Fx F0）/（Fs F0 ）* Cx多分混合物分析.:如果不同組分的熒光光譜相互重疊可以考慮利用熒光強度的加合性質在適宜的波長處測定混合物的熒光強度，再根據被測各個組分的各自在適當的熒光波長處的熒光強度 列聯立方程求出各自含量。導數熒光光譜分析法也叫微分熒光光譜分析法，用物質熒光強度對對其熒光波長的導數值與其對應波長作圖可得導數熒光光譜。 dI/dll 曲線 一階導數熒光光譜隨著導數階數的增加，熒光峰的尖銳程度增大，帶寬減少，分辨率提高。

44、將靠的很近的，重疊的熒光峰分別開來，還可以清楚地辨認陡坡上的弱小峰肩蜂，寬峰可以準確給出峰位。提供更多的結構信息，用于定性。用熒光導數值與樣品濃度值呈線性關系可以用導數熒光光譜分析法定量。4熒光分析方法的特點靈敏度高 與紫外可見分光光度法法比較,熒光是從與入射光成直角方向檢測，即在黑背景下（有很小的噪聲背景）檢測熒光發射信號。所以可以用增強入射光強度或增大熒光放大倍數來提高靈敏度；在吸收光度法中不但要測定透過試樣的光強度I，還要測量入射光強度I0. 當試樣濃度很低，吸收微弱，I 和I0非常接近，檢測器很難區分兩個較大信號之間的微小差別。此外在分光光度法中如果增加入射光強度I0，I也按比例變化，

45、若提高檢測器信號的放大倍數，其放大作用I0和I是同樣的。因此熒光分析的靈敏度要比分光光度法光高2-4個數量級。測定下限在0.1-0.001ng/ml之間。紫外可見分光光度法的靈敏度為10-7g/ml 而熒光光度法測定的靈敏度在 10-1010-12g/ml之間。選擇性好 既可根據特征發射又可以根據特征吸收來鑒定物質。如果某幾個物質的發射光譜相似，可以從其激發光譜的差異將其區分開來。而如果他們的吸收光譜相同，則使用發射光譜將其區分。所需樣品量少，方法簡便提供較多的物理參數 可以提供激發光譜，發射光譜，熒光強度，熒光效率，熒光壽命，熒光偏振等參數，可以從不同角度反映熒光物質分子的各種特性，并通過這

46、些物理參數得到被研究的物質的更多的信息。缺點 應用范圍不夠廣泛，本身能夠發射熒光的物質較少，加入某種試劑經衍生化后才能測定的物質也不是很多。由于熒光分析的靈敏度高，測定時對環境因素敏感，干擾因素較多。如溫度 溶劑，酸度，散射光等。5 熒光分析儀51 儀器組成用于熒光測定的儀器由以下四個部件組成： 激發光源；樣品池，單色器，檢測器（圖 5）。由光源發出的光經過第一單色器得到所需要的激發光波長，激發光通過樣品池，熒光物質被激發后發射熒光。為了消除入射光和散射光的影響通常在與激發光垂直的方向上測定熒光。為了消除可能存在的其他光的干擾，如激發光產生的反射光，瑞利散射光和拉曼散射以及溶液中雜質產生的熒光

47、，以便獲得所需要的熒光，在樣品池和檢測器之間設置了第二個單色器，熒光作用于檢測器上，記錄相應的電信號。經過放大被記錄下來。圖5 熒光光度計基本組成框圖圖6 F-4500熒光光度計光路圖激發光源 在紫外可見光范圍， 常用的光源是高壓氙燈和高壓汞燈。氙燈內裝有氙氣，氙燈發射的光譜強度大，而且是連續光譜分布在200-700nm 范圍內，并且在300-400 波長之間的強度幾乎相等。目前大多數熒光計使用它作光源。高壓氙燈是一種氣體放電燈，外套為石英，內充氙氣，室溫下壓力0.5Mpa (5 atm) ，工作時壓力為2Mpa (20 atm)。氙燈內充氣總是處于高壓狀態先燈壽命約為2000小時，在安裝或更

48、換時要戴上防護鏡或者嚴格按照操作規程進行以便防止以外發生。由于氙燈的啟動電壓在 20-40 KV，不僅人體要注意安全，在儀器配有計算機是，應先點著氙燈帶穩定后再開計算機。 樣品池 液體樣品池通常用石英材料制成，形狀以方型或者長方形為好，因為這種形狀散射光干擾較少。固體樣品用可用樣品架。單色器 包括色散元件和狹縫。較高級的單色器采用光柵。其優點是在所有波長都能夠色散而且色散均勻，有相同的分辨率。入射光的80%能量在一級光譜中。第一單色器用于選擇所需要的激發波長第二單色器用于分離出熒光發射波長。狹縫關系到單色器分辨率的優劣， 用于控制譜帶寬度和光強度。一般說來，狹縫越窄單色性越好。但光強隨之減小而

49、降低靈敏度。在實際使用時應該兩者兼顧。檢測器要求有較高的靈敏度，一般應用光電倍增管作檢測器。52儀器的校正靈敏度校正熒光光度計的靈敏度可以用被檢測出的最低信號來表示，通常以硫酸奎寧的檢出限或者以純水的的拉曼峰的信噪比（S/N）表示。熒光光度計的靈敏度與光源強度，單色器（包括透鏡，反射鏡）的性能，放大系統的特征，和光電倍增管的靈敏度有關；與所選用的波長，狹縫寬度有關。與被測空白溶劑的拉曼散射，激發光，雜質熒光有關。由于影響因素多，同一型號的儀器，甚至同一臺儀器在不同時間操作，所測得的結果也不盡相同。因而在每次測定時，在選定波長和狹縫寬度的條件下，先用一種熒光性質穩定，濃度固定的標準液進行校正，將

50、每次所測得的熒光強度調整到相同數值（50%或100%）。如果被測定的物質所產生的熒光很穩定，自身就可以作為標準溶液。紫外可見范圍內最常用的是1mg/ml（0.05mol/l 硫酸中）硫酸奎寧標準溶液。因為其產生的熒光十分穩定。波長校正熒光分光光度計的波長出廠前都經過了校正，若儀器的光學系統和檢測器有所變動，或較長時間使用后，或在重要部件更換后，有必要用汞燈的標準譜線對單色器刻度重新校正，這一點在要求較高的測定工作中尤為重要。激發光譜和熒光光譜的校正 熒光分光光度計所測得的激發光譜或熒光光譜往往隨著儀器不同而不同。原因：單色器波長的準確度，拉曼散射光的影響，以及狹縫寬度等。其最主要的原因有光源的

51、強度隨波長變化 ，檢測器對不同波長光的接受敏感程度不同，檢測器的響應與光強不成線性。由于以上原因，在用單光束儀器測定激發和發射光譜時，因為不能用參比溶液進行相對校正，誤差較大。尤其是當波長處于檢測器靈敏度曲線的陡坡時得到的“表觀光譜”中的值之間的相對關系不能反映真實情況，產生了顯著誤差。因此可先用儀器上附有的校正裝置將每一個波長的光源強度調整到一致，然后根據表觀光譜每一個波長的強度除以檢測器對每一個波長的感應強度進行校正以消除誤差。目前生產的光度計大都是雙光束光路，可以用參比光束抵消誤差。5.3 熒光分析儀器的維護要正確提供主機及附件所需的供電電壓和頻率，不可接錯電源。拿燈時不要碰窗口，如果不

52、小心碰觸，及時用無水乙醇擦凈，燈源不穩定或強度太弱而影響測定時，應換燈；不要用肉眼直視燈源，以免損傷眼睛。單色器不得輕易拆卸，保持內部干燥，以防色散元件和反射鏡受潮。放樣品池時要固定一個方向，免得液池各透光面被池架的彈簧片擦壞，增加散射。液池要洗凈，不得留有痕跡影響測定。新的液池常常掛水，可用3mol/l 鹽酸和50%乙醇等量混合液浸泡。保持光電倍增管室干燥，保證絕緣良好，光電倍增管通電后避免不必要的爆光 要養成隨時關閉光閘的習慣，以免損壞光電倍增管，或因為“疲勞”降低靈敏度。5.4 熒光測定物理條件的選擇熒光測定可變因素比較多，只有選好條件才能獲得滿意的激發和發射光譜。由于樣品和儀器各不相同，因此測定條件不能固定不變。應當尋找儀器最佳條件。燈電流 光源燈電流不能超過測定范圍，但為了提高測定靈敏度，可以調節燈電流到最大允許值。波長掃描范圍： 對已知光譜特性的樣品，不需進行廣泛掃描。在測試一個未知光譜特性的樣品的激發和發射光譜時 掃描樣品時范圍應該寬一些。如掃描發射光譜時，在短波方向應該多掃一些，以觀測瑞利散射和喇曼散射的影響。狹縫寬度 選好激發和發射單色器狹縫單色器寬度，是獲得一個好圖譜的關鍵。對定性分析來說，希望窄一些，因為狹縫窄譜帶純，能