1、肺癌外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表達的臨床意義 作者：仲崇俊，蔣庚西，陶國華，王永旺【摘要】 目的：應用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測肺癌患者腫瘤組織和外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA的表達，探討其作為肺癌微轉移檢測分子標志物的可行性。方法：應用RT-PCR技術檢測40例非小細胞肺癌組織和15例肺良性病變組織中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA的表達；檢測40例肺癌患者外周血中靶基因的表達，并以15例良性肺疾病患者和10名健康人外周血作為對照。結果：40例肺癌患者病理組織中EGFR mR

2、NA、SP-D mRNA、LUNX mRNA的表達率為77.5%（31/40）、100%（40/40）、100%（40/40），外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表達陽性率分別為55.0%（22/40）、52.5%（21/40）和57.5%（23/40）；對照組中15例肺良性病變患者病理組織中EGFR mRNA表達率為13.3%（2/15），無SP-D mRNA和LUNX mRNA表達，15例肺良性病變患者和10名健康人的外周血中無EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表達。結論：EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA作為

3、檢測肺癌組織及肺癌外周血微轉移的分子標志物具有良好的敏感度和特異性；三者表達與肺癌TNM分期、組織學類型和癌細胞分化程度關系密切。 【關鍵詞】 肺腫瘤；微轉移；表皮生長因子受體；肺表面活性蛋白D；肺特異性蛋白X肺癌細胞在術前、術中脫離原發灶，以非常少的數量轉移到淋巴結、血液、骨髓或遠處器官中，常規臨床檢查難以發現，此為腫瘤的微轉移。RT-PCR技術的發展，使檢測外周血中微量癌細胞成為可能。但目前在肺癌微轉移的檢測中，缺少公認的特異的分子標記物1。本實驗采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測了40例非小細胞肺癌（NSCLC）患者外周血中EGFR、SP-D和LUNX的表達，分析其與病理生理

4、學特征的關系，以探討靶基因作為診斷肺癌微轉移的價值。1 材料和方法1.1 一般資料 病例 40例NSCLC患者均來源于本院胸心外科手術患者，病理學診斷明確，且臨床影像學檢查未見遠處轉移，其中，55歲31例，55歲9例，男30例，女10例，腺癌22例，鱗癌18例；另選15例肺部良性疾病患者（包括良性腫瘤、肺大泡、支氣管擴張等）及10名健康人作為對照組。1.2 試劑與引物設計 參照GenBank，采用Primer Premier5引物設計軟件設計EGFR、SP-D和LUNX基因內外引物，EGFR上游:5-CATCTCCGAAAGCCAACA-3，EGFR下游:5-CGACGGTCCTCCAAGTA

5、G-3，擴增產物長度244bp；SPD上游:5-AAAGTGTCGGGGAGAAGA-3，SPD下游:5-TCAGTCATGCTCAGGAAA-3，擴增產物長度178bp；LUNX上游:5-GGGCATTCTGGAAAACCT-3，LUNX下游:5-GGCGTATTCACTTGGAGC-3，擴增產物長度237bp；內參引物為GAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶）以檢測RNA的完整性，GAPDH上游:5-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3，GAPDH下游:AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3，擴增產物長度306bp，由上海生工合成。1.3 標本的收集與總RNA抽提 對

6、所有肺癌患者于治療前抽取新鮮肝素抗凝血5ml，用淋巴細胞分離液進行有核細胞的分離，Trizol試劑一步法抽提總RNA，另對手術切除腫瘤于手術室內切取小塊新鮮腫瘤組織液氮速凍保存，取約50100mg行總RNA的抽提。1.4 RNA鑒定 對所抽提的總RNA行紫外分光光度定量，并行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。cDNA第一鏈合成取樣品總RNA約2g加入20l反應體系中，按照試劑盒提供的條件進行逆轉錄。PCR擴增EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA與GAPDH(內參)。按照文獻報道方法46，結合實驗優化條件進行。具體反應條件分列如下：EGFR、SP-D、LUNX PCR反應體系25l，

7、其中cDNA 2l,10PCR buffer 2.5l,TaqDNA 5U/l 聚合酶0.2l,2mmol/L dNTPmix 2.5l,20mmol/L MgCl2 1.5l, EGFR上、下游引物(10pm/L)各1l,加入適量的雙蒸水，使總體積達25l。反應條件:95C預變性5min, 95C變性45s， 50C 45s， 72C 45s，共45個循環，在第15個循環末時加入GAPDH上、下游引物(10pmol/L)各1l，最后72C延伸7min。PCR產物分析 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在四星凝膠成像系統下拍照和分析。1.5 統計學方法 使用STATA 7.0統計軟件對資料進行分析，相關

8、數據采用2檢驗和Fisher確切概率法進行處理，P0.05、P0.01為差異有統計學意義。2 結果2.1 總RNA鑒定 實驗中抽提的總RNA OD260/280值在1.761.97之間，外周血抽提總RNA約50100g，電泳后EB染色可見28s,18s亮帶。2.2 EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA檢測結果 NSCLC組織和肺良性病變組織檢測結果見表1。肺癌組織中，EGFR mRNA與SP-D mRNA、LUNX mRNA的表達差異具有統計學意義（P=0.002）。外周血肺癌與對照組EGFR mRNA、SP-D mRNA與LUNX mRNA檢測結果見表2。由表2可見EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 3項指標在肺癌組中的表達陽性率有差異，但不具有統計學意義(P=0.904)。在同一分期中，EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 3項指標的表達陽性率有差異，但不具有統計學意義（期：P=0.632；期：P=0.924；期：P=0.120）。在同一病理分型中，EGFR mRNA、SP-D mRNA