1、實驗一 細胞的基本形態結構的觀察實驗原理與目的 （1） 通過觀察動、植物細胞，了解細胞形態的多樣性并掌握光鏡下細胞的基本形態結構。（2） 初步掌握臨時制片技術和顯微繪圖的方法。 實驗原理 細胞是生命活動的基本結構單位和功能單位。構成人體或其他高等動物或植物的細胞種類繁多，形態各異。細胞的形態都與它們的功能相適應。如具有運輸O2和CO2功能的紅細胞為雙凹盤狀；具有感受刺激與傳導功能的神經細胞呈星芒形，附有長短不等的樹枝狀突起；上皮細胞是柱形或扁平形；巨噬細胞則呈不規則形狀，并能伸出偽足，以利于為執行吞噬和消滅外源的病原微生物的功能。雖然細胞在形態上多種多樣、大小不同，但卻具有共同的基本結構特點，

2、即都是由細胞膜（cell membrane）、細胞質(cytoplasm)和細胞核(nucleus)組成。實驗用品1器具：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、推片、吸管、鑷子、牙簽、擦鏡紙、吸水紙、小剪刀。2材料：洋蔥、人口腔上皮細胞、雞血液、人血細胞涂片、蟾蜍血細胞涂片。3試劑：2 %碘液、Giemsa 染液。試劑配制12 %碘液：稱取碘片2g，碘化鉀5g，蒸餾水100ml 混勻溶解即可。2吉姆薩(Giemsa) 染液：吉姆薩粉(Giemsa stain) l.0g 甘油(AR) 66ml 甲醇(AR) 66ml 將Giemsa粉放入研缽中，先加入少量甘油，研磨至無顆粒為止，然后再將全部甘油倒入，放56

3、溫箱中2h后，加入甲醇，將配制好的染液密封保存棕色瓶內(最好于04保存)。內容與方法一、洋蔥鱗莖表皮細胞制片與觀察：1. 臨時制片：取一擦凈的載玻片，在玻片中央滴一滴2%的碘液，將洋蔥莖用小刀分為幾塊，取一塊肉質鱗葉，用鑷子在其表面輕輕撕下一小塊膜質表皮，再用剪刀剪成34mm2的小塊，置于載玻片的染液中鋪平，染色23分鐘，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去蓋玻片周圍多余的染液。2. 觀察：將標本置于低倍鏡下觀察，可見許多長柱狀排列整齊、彼此相連的細胞，選擇其中較典型的細胞移至視野中央，然后換成高倍鏡觀察以下結構： 1）細胞壁：在每兩個細胞相連處，可看到二層壁狀結構，是相鄰細胞各自的細胞壁，有纖維素構成。

4、細胞膜緊貼在細胞壁內側，不易看到。 2）細胞核：呈橢圓形，位于中央，被染成黃色，成熟的細胞由于液泡的擠壓，核位于質膜邊緣。細胞核一般有12個折光較強并染成黃色的核仁。 （3）細胞質：是細胞膜以內，細胞核以外的物質，染色較淺，有1至數個液泡及微細顆粒（圖1 - 1）。二、人口腔粘膜上皮細胞制片與觀察： 1.臨時制片：在一張擦凈的載玻片中央滴一滴2%的碘液，取一根牙簽，用其粗端在自己口腔中的臉頰上刮幾下，將其刮下的粘膜上皮細胞涂布在碘液中，染色23分鐘，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去蓋玻片周圍多余的染液。 色23分鐘，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去蓋玻片周圍多余的染液。 2. 觀察：將制好的玻片標本置于低倍鏡

5、下觀察，可見細胞被染成黃色，成群或分散存在。由于該細胞體積較小，著色較淡，觀察時應稍降低視野中的亮度，選擇較分散且輪廓清楚的細胞移至視野中央，換成高倍鏡觀察以下結構。1）細胞膜：是包圍在細胞最外層的膜狀結構，細胞呈扁平不規則的類圓形，細胞膜有些地方出現皺褶。2）細胞核：圓形或橢圓形的細胞核呈深黃色位于細胞中央，核中有時可見一致密的結構，即為核仁。3）細胞質：是細胞膜與細胞核之間染色較淺的物質（圖1 2； 圖1-3）。2. 觀察：將已經染好的血涂片標本（肉眼可見血膜呈粉紅色）放置在低倍鏡下，檢查整個血涂片，選擇細胞均勻分布、較少重疊的區域，然后轉換高倍鏡下仔細觀察，在人的血涂片上紅細胞數目多、體

6、積小、呈圓餅狀，無細胞核（圖1-4），胞質呈粉紅色；白細胞比例較小，尋找較困難，但胞體較大，細胞核明顯，形態多樣，呈蘭紫色。雞的血細胞、蛙的血細胞的形態與人類有很大不同，在雞或蛙血的紅細胞涂片中，可見紅細胞呈卵圓形，并且有橢圓形的細胞核（圖1-5）。圖1-4 人血紅細胞的形態? 圖1-5雞血紅細胞的形態作業與思考題1.繪制高倍鏡下洋蔥鱗莖表皮細胞、人口腔黏膜上皮細胞圖，并注明各部分結構的名稱。 2.生物繪圖的基本要求是什么？實驗二細胞大小的測量實驗目的 學習顯微測量方法實驗原理 應用顯微鏡的成像原理，同時借助顯微鏡的鏡臺測微尺和目鏡測微尺，兩尺配合使用，進行測量和運算，得出細胞的大小。(目鏡測

7、微尺測量倍率比照表)實驗材料、用品材料：人口腔上皮細胞,雞血紅細胞、洋蔥鱗葉表皮細胞。儀器(請參看儀器圖庫)：測微尺、顯微鏡。物鏡測微尺 目鏡測微尺實驗步驟(一) 測微尺的使用操作1. 卸下目鏡的上透鏡，將目鏡測微尺有刻度一面向下裝在目鏡鏡面上，再旋上目鏡的上透鏡。2. 將鏡臺測微尺有刻度一面朝上放在載物臺上夾好，使測微尺刻度位于視野中央。調焦至看清鏡臺測微尺的刻度。3. 小心移動鏡臺測微尺和目鏡測微尺(如目鏡測微尺刻度模糊，可轉動目鏡上透鏡進行調焦)，使兩尺左邊的"0"點一直線重合，然后由左向右找出兩尺另一次重復的直線(圖1-6)。4?記錄兩條重合線間目鏡測微尺和鏡臺測微

8、尺的格數。按下式計算目鏡測微尺每格的長度等于多少m目鏡測微尺每格的長度/ m=鏡臺測微尺的格數/目鏡測微尺的格數(二)花粉細胞的觀察測量1采集剛開放或將要開放的成熟花朵；2.在載玻片滴12滴蒸餾水；3.用接種針將花粉分散于蒸餾水上，蓋上蓋玻片；4. 用測微尺測量花粉細胞大小，計算平均值。附：雞血細胞的觀察測量將已經制備好的雞血涂片放在染色盤架上，滴數滴瑞氏-吉姆薩染液欲涂片上，靜置染色1分鐘，滴加等量1/15mol/L磷酸緩沖液，用牙簽輕輕攪拌混勻，再靜置染色510分鐘，最后用清水緩緩沖洗1分鐘，傾斜放置，涼干后進行觀察測量。實驗報告用測微尺測量不同材料各種細胞的大小后，制表格表示測量結果。注

9、意事項載物臺上物鏡測微尺刻度是用加拿大樹膠和圓形蓋玻片封合的。當除去松柏油時，不宜使用過多的二甲苯，以避免蓋玻片下的樹膠溶解。取出目鏡測微尺，將目鏡放回鏡筒，用擦鏡紙擦去目鏡測微尺上的油膩和手印思考題分別計算不同物鏡放大倍數下測微尺的單位。實驗三 植物細胞骨架的觀察一、實驗目的1. 掌握考馬斯亮藍R250 對植物細胞骨架染色的方法。2. 通過對洋蔥內皮細胞的處理，掌握植物細胞骨架的制備方法與顯微形態觀察。二、實驗原理細胞骨架(cytoskeleton)，是細胞內以蛋白質纖維為主要成分的網絡結構，根據蛋白質纖維的直徑、組成成分和組裝結構的不同可分為微絲、微管和中等纖維。細胞骨架對于維持細胞的形態

10、結構及細胞運動、物質運輸、能量轉換、信號傳導和細胞分裂等有重要的作用。本試驗采用去垢劑TritonX-100 的緩沖液處理植物材料時，可將細胞的膜結構和大部分蛋白質抽提掉，但細胞骨架系統的蛋白卻被保存下來，后者用考馬斯亮藍R250 染色，在光學顯微鏡下可見一種網狀結構。三、實驗用品(一)材料 洋蔥（二）器材 顯微鏡、載玻片、滴管、擦鏡紙、PH 計（三）試劑1. 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4緩沖液（PB，PH7.3）50ml0.15mol/L NaCl雙蒸餾水加至1000ml2. PB0.2mol/L Na2HPO4 77ml

11、0.2mol/L NaH2PO4 23ml3. M-緩沖液咪唑(PH 6.7) 50mmol/LKCl 50mmol/LMgC120.5mmol/LEGTA 1mmol/LEDTA 0.1mmol/L巰基乙醇 1mmol/L甘油 4mmol/L用1mol/L HCl 調pH 至7.2。4. 1%的Triton X-100/M-緩沖液5. 0.2%考馬斯亮藍R250 染液甲醇 46.5ml冰醋酸 7ml蒸餾水 46.5ml6. 3%戊二醛- PB 溶液（PH7.3）四、實驗操作見圖4-4取洋蔥內皮1cm左右置于含PBS 液的載玻片上濕潤后，吸去PBS加2 滴1%Triton X-100/M-緩沖

12、液，5min吸去緩沖液，加3%戊二醛-PB 溶液，固定30min加PBS 洗2 次，共3min加0.2%考馬斯亮藍R250 染色30min用PBS 洗2 次，共2min，吸干鏡檢并繪圖圖4-4 細胞骨架標本制作過程五、實驗建議1. 用去垢劑TritonX-100 的緩沖液處理材料時，應控制在30min 左右。2. 每一次加液或染色后，應用PBS 洗2 次，并用濾紙吸干。六、實驗報告及作業1. 畫出實驗所觀察到的細胞骨架圖，并注明放大倍數。2. 為什么用TritonX-100 的緩沖液處理材料？實驗四 細胞中多糖和過氧化物酶的定位【實驗目的】掌握顯示細胞中多糖和過氧化物酶反應的原理和方法?！緦嶒?/p>

13、原理】高碘酸雪夫試劑反應，簡稱PAS反應。主要是利用高碘酸作為強氧化劑，這種強氧化劑能打開C-C鍵，使多糖分子中的乙二醇變成乙二醛，氧化所得到的醛基與Schiff試劑反應形成紫紅色化合物。顏色的深淺與糖類的多少有關。細胞內的過氧化物酶能把聯苯胺氧化為藍色或棕色絡合物，根據藍色或棕色的出現來表示過氧化物酶的存在。 PAS反應過程如下：過氧化物酶聯苯胺反應過程如下： 【實驗儀器、材料和試劑】（一）儀器 顯微鏡、鑷子、染色缽、刀片、載玻片、蓋玻片、吸水紙等 （二）材料 馬鈴薯塊莖、洋蔥根尖或洋蔥鱗莖 （三）試劑 1高碘酸溶液： 高碘酸（HIO4·2H2O）0.4g，95%乙醇35ml，M/

14、5醋酸鈉溶液（2.72g醋酸鈉溶于100ml H2O）5ml， 蒸餾水10ml 2Schiff試劑（配法見 Feulgen反應） 3亞硫酸水溶液（配法見 Feulgen反應） 470%乙醇 5聯苯胺溶液： 在0.85%鹽水內加入聯苯胺至飽和為止，臨用前加入20%體積的H2O2 ，每2ml加一滴。 60.1%鉬酸銨溶液： 稱取0.1g鉬酸銨溶于100ml 0.85%鹽水.【方法與步驟】.（一）細胞中多糖的測定：高碘酸雪夫（PAS）反應 1把馬鈴薯塊莖用刀片徒手切成薄片。 2浸于高碘酸溶液515min 。 3移入70%乙醇中浸片刻。 4Schiff試劑染色15min 。 5亞硫酸溶液洗三次，每次1

15、 min。 6蒸餾水洗片刻。 7裝片鏡檢。 鏡檢結果：細胞中多糖部位呈現紫紅色。（二）細胞中過氧化物酶的測定：聯苯胺反應 1把洋蔥根尖徒手切成2040m厚的薄片或用鑷子撕取洋蔥鱗莖內表皮一小塊。 2浸在溶有0.1%鉬酸銨的0.85%鹽水溶液中5min（鉬酸銨的作用是催化劑）。 3浸在聯苯胺溶液內2min至切片出現藍色。結果：細胞中有藍色沉淀出現【作業】1簡述PAS反應及聯苯胺反應的原理。 2繪圖示細胞中多糖及過氧化物酶的分布。實驗五 細胞核與線粒體的分級分離【實驗原理與目的】（1）了解細胞器分級分離的原理。（2）初步掌握細胞核與線粒體的分級分離。（3）熟悉離心機、勻漿器的使用方法?！緦嶒炘怼?/p>

16、細胞組分的分級分離是研究亞細胞組分的化學組成、理化特性及其功能的基本方法。細胞內各種結構的大小、形狀和密度不同，在同一離心場內的沉降速度也不同，因此在密度均一的介質中，在不同大小的離心力場的作用下，組分先后沉降而初步分離。差速離心只能將那些大小有顯著差異的成分分離開，更精細的分離則要采用密度梯度離心。細胞組分的分離是通過組織勻漿、分級離心等步驟完成的(圖)。圖11. 差速離心技術各步驟圖解【實驗用品】1玻璃勻漿器、臺式高速冷凍離心機、普通離心機、EP管、微量進樣器、tip頭、剪刀、鑷子、小燒杯、離心管、載玻片、蓋玻片、滴管、普通光學顯微鏡、濾紙、8層紗布或尼龍網(200目)、冰塊。2材料：小白

17、鼠肝臟。3試劑：勻漿介質(O25molL蔗糖水溶液，含0003molL CaCl2)、甲基綠一派洛寧染液、? 95乙醇、丙酮、生理鹽水、中性紅一詹納斯綠B染液?！驹噭┡渲啤?） 甲基綠-派洛寧染液： 0.2molL醋酸緩沖液(pH48)：冰醋酸12ml，加蒸餾水至100ml；醋酸鈉2.72g溶于100ml蒸餾水中。使用時兩液按2：3比例混合；A液：5派洛寧水溶液4ml、2甲基綠水溶液14ml、蒸餾水16ml；B液：0.2molI。醋酸緩沖液(pH4.8)16ml。使用時臨時將A液與B液混合(52)。2）中性紅-詹納斯綠B染液： 將3滴詹納斯綠B飽和水溶液(溶解度5.18)加到5ml無水乙醇中，

18、然后再加入1ml 1：15000中性紅溶液(中性紅10mg溶于150ml水中)，瓶子用黑紙包好，4冰箱保存；5ml無水乙醇中加入2030滴中性紅飽和水溶液(溶解度5.64)；臨用時將2種溶液等體積混合。3） 0.12 mol/L 草酸銨溶液：? 稱取草酸銨8.527g , 溶解于500ml蒸餾水中3）將燒杯內懸浮組織倒入玻璃勻漿器中，使勻漿器的下端浸入盛有冰塊的器皿中，垂直插入勻漿搗桿，上下轉動研磨數次使肝組織磨碎。用2層紗布(先用少量勻漿介質濕潤)過濾勻漿液至離心管中，離心管內勻漿液約有78ml。然后制備1張濾液涂A，做好標記，自然干燥。4）將裝有勻漿濾液的離心管配平后，在普通離心機中以25

19、00r分鐘離心15分鐘，緩緩吸取上清液，移入EP管中，蓋緊蓋子放在有冰塊的器皿內，待分離線粒體時用。同時制備1 張上清液涂片B，做好標記，自然干燥。5）用lOml勻漿介質懸浮離心后的沉淀物，用吸管混勻，以2500r分鐘離心15分鐘，吸棄上清液，沉降物加入0.30.5ml勻漿介質，用吸管吹打成懸液，制備1張涂片C，做好標記，自然干燥。2.高速離心分離提取線粒體：1）將放在有冰塊的器皿內裝有上清液的EP管取出配平，在臺式高速離心機上以13,000r/min離心20分鐘，緩緩吸去上清液，留取沉淀物。如沉淀的表面有一淺色的疏松層時(主要是一些損傷和腫脹的線粒體)，則應連同上清液一起小心吸去。2）沉淀再

20、加入預冷的勻漿介質懸浮，用tip頭吹打后再以13,000r/min離心20分鐘。3）將上清液吸入另一EP管中，留存沉淀物中加入0.1ml的勻漿介質混勻成懸液（可用牙簽）。EP管同時置于冰浴中，待制片鑒定時用。【內容與方法】1.細胞核。將步驟一中得到的涂片A、B、C浸入95乙醇中5分鐘，晾干，在涂片標本上? 滴加甲基綠-派洛寧染液染色2030分鐘，再以純丙酮分色20秒，蒸餾水漂洗，直立于吸水紙上吸干水分，在高倍鏡下比較觀察A、B、C ?3張涂片各含什么成分。細胞核被染成藍綠色，核仁和細胞碎片染成紅色。2.線粒體。取步驟二中得到的沉淀物懸液和上清液分別均勻地涂布在2張干凈載玻片上制備成涂片D和E，

21、各滴1滴0.02中性紅-詹納斯綠B染液，分別蓋上蓋玻片染色520分鐘。在高倍鏡下觀察已染好色的玻片標本，其中被染成亮綠色的顆粒是線粒體。比較觀察和描述兩張玻片的結果?！咀鳂I與思考題】1.畫出小白鼠肝臟細胞核與線粒體的分級分離的操作程序圖。 2.觀察、描述、鑒定離心分離物涂片的結果。實驗六 線粒體和液泡系的超活染色與觀察一、 實驗目的：1、 觀察動、植物活細胞內線粒體、液泡系的形態、數量與分布。2、 學習一些細胞器的超活染色技術。二、 實驗原理：活體染色是指對生活有機體的細胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細胞內的某些結構，而不影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以

22、致引起細胞的死亡?；钊炯夹g可用來研究生活狀態下的細胞形態結構和生理、病理狀態。根據所用染色劑的性質和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內活染與體外活染兩類。體內活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內，染料的膠粒固定、堆積在細胞內某些特殊結構里，達到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細胞內某些特殊的部位，主要是染料的“電化學”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子的，這樣，它們彼此之間就發

23、生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因為它們具有溶解在類脂質（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細胞吸收。詹納斯綠B（Janus green B）和中性紅（neutral red）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色各有專一性。三、 實驗用品：1、 器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片、10ml量筒、吸管、牙簽、吸水紙（或衛生紙）等。2、 試劑：1） Ringer溶液（裝入滴瓶）氯化鈉 0·85g（變溫動物用0·65g）氯化

24、鉀 0·25g氯化鈣 0·03g蒸餾水 100ml2） 1%、1/3000中性紅溶液（裝入棕色滴瓶）稱取0·5g中性紅溶于50mlRinger液，稍加熱（30-40）使之很快溶解，用濾紙過濾，裝于棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29mlRinger溶液混勻，裝入棕色瓶備用。3） 1%、1/5000詹納斯綠B溶液（裝入棕色滴瓶） 稱取50mg詹納斯綠B溶于5mlRinger溶液中，稍加熱（30-40），使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%原液。取1%原液1ml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液

25、，裝入瓶中備用。最好現用現配，以保持它的充分氧化能力。四、 實驗材料：1、人口腔上皮細胞2、洋蔥鱗莖內表皮細胞3、小麥或黃豆幼根根尖五、 方法步驟：（一）、線粒體的超活染色與觀察：線粒體是細胞進行呼吸作用的場所，其形態和數量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態而發生變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進行超活染色，這是由于線粒體內的細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態（即有色狀態），呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質中，這些染料被還原為無色的色基（即無色狀態）。1、 人口腔黏膜上皮細胞線粒體的超活染色觀察1）、取清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上，滴兩滴1/5000詹納斯綠B染液。2）、實驗者用牙簽寬頭在自己口腔頰黏膜處稍用力刮取上皮細胞，將刮下的黏液狀物放入載玻片的染液滴中，染色1015分鐘（注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。3）、在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細胞，換高倍鏡或油鏡進行觀察。可見扁平狀上皮細胞的核周圍胞質中，分布著一些被染成藍綠色的顆粒狀或短棒狀的結構，即是線粒體。2、 洋蔥鱗莖表