1、土壤中解磷細菌的分離與純化（李其帥、林志軍、王棟棟、周宏、孟海青、紀凱華）生科05級2班摘要：磷細菌是存在于自然界，主要是土壤中的一類溶解(dissolve)磷酸化合物(phosphate compound)能力較強的細菌的總稱。通過磷細菌的作用，可使土壤中不能被植物利用的磷化物轉變成可被利用的可溶性磷化物。故又稱溶磷細菌。主要有兩類，一類稱為有機磷細菌，主要作用是分解有機磷化物如核酸、磷脂等；另一類稱為無機磷細菌，主要作用是分解無機磷化物，如磷酸鈣、磷灰石等。磷細菌主要是通過產生各種酶類或酸類而發揮作用的。可用它制成細菌肥料，實踐證明，對小麥、甘薯、大豆、水稻等多種農作物，以及蘋果、桃等果樹

2、具有一定增產效果。農業上常用的菌有解磷巨大芽孢桿菌（Bacillusmegatherium varphosphaticum），俗稱為“大芽孢”磷細菌，此外，還有其他芽孢桿菌和無色桿菌（Achromobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）等。我們此次試驗目的是從土壤中分離出無機解磷細菌，觀察解磷細菌的細胞形態，并進行生理生化鑒定，進一步熟悉掌握微生物實驗的基本技能。關鍵詞：土壤 解磷細菌 無機磷細菌 含磷培養基 分離提純 生理生化反應實驗目的 1）掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術。2）學習并掌握分離純化無機解磷細菌的基本方法。 3）鞏固和貫通所學的無菌技術、純

3、培養技術、保藏技術、顯微技術、等微生物操作技術。4）學習通過微生物的形態特征、生理生化反應來鑒別解磷細菌與其他微生物的異同。試驗原理1） 菌種來源：由于各種微生物對營養物質需求不同，在不同地方采樣對選取所要的微生物含量和其它雜菌含量的多少直接有關。所以要選擇無機磷含量較高的土壤中采樣。2） 培養基的選取：為了使所要的無機解磷細菌能生長，其它微生物生長受到一定的抑制，要用選擇培養基。還要把解磷菌與其他微生物相區別，還要用鑒別培養基。為了達到即是選擇培養基又是鑒別培養基，選取以磷酸鈣為唯一磷源的培養基。這樣又能起到選擇培養的目的，又能通過有無解磷圈鑒別無機解磷細菌。3）培養及分離純化：通過涂布培養

4、法、平板劃線法等方法達到分離純化的目的。4）保藏：通過分離純化得到的菌種，接種與斜面培養基上，到一定時間后進行傳代培養保藏，使其不死亡、減少突變所引起的生物學性狀的改變。5）通過形態與染色鑒定：由于各種微生物有其特定的菌落形態特征和單細胞形態特征，可通過這些形態進行鑒定。還由于細胞壁組成不同可進行鑒別染色法進行鑒定，也可用產生不產生芽孢進行芽孢染色。通過以上方法可對所分離純化的菌種進行初步的鑒定。6）通過生理生化反應進行鑒定：各種微生物在代謝類型上表現了很大的差異，如表現在對對大分子糖類和蛋白質的分解能力，以及分解代謝的最終產物的不同，反映出他們有不同的酶系。我們在實驗室允許的條件下做了糖類發

5、酵與氧化、是否能產生過氧化氫酶以及是否含有細胞色素氧化酶等生理生化試驗，進行再次鑒定。 用品器材：潔凈試管 培養皿500ml和250ml錐形瓶各一個，玻璃珠 高壓鍋 10ml和100ml量筒 1ml移液槍配槍頭 牛皮紙 玻璃涂棒 接種環顯微鏡 酒精燈 載波片 蓋玻片 擦凈紙 雙層瓶（香波油 二甲苯） 試管架 等無菌水 堿性美蘭 石炭酸復紅染色液 結晶紫 碘液 乙醇 番紅 5%孔雀綠水溶液 1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液。1%-萘酚乙醇溶液。3%過氧化氫水溶液等 無機磷培養基 葡萄糖 5.0克 硫酸銨 0.25克 NaCl 0.15克KCl 0.15克 7水硫酸鎂 0.15克 磷酸鈣 2.5克 4水

6、硫酸錳 0.015克 7水硫酸亞鐵 0.015克 瓊脂 8克 蒸餾水 500ml PH 7.0到7.2 糖酵解培養基 蛋白胨0.2%, 磷酸二氫鉀0.03% 氯化鈉0.5% 糖1% 瓊脂 0.50.7% 溴百里酚0.003%。 PH 7.07.4分離純化1 配置培養基和滅菌根據上述培養基成分，到藥品室找到相應材料，用天平稱量，加到500ml錐形瓶中，玻璃棒攪拌均勻（必要時加熱），塞上棉塞，雙層牛皮紙扎好口；試管塞上棉塞，用牛皮紙7個扎一捆；平皿6個一包，牛皮紙扎好，將它們同移液槍、玻璃珠、玻璃涂棒、量筒、100ml圖錐形瓶放入高壓鍋進行高壓蒸汽滅菌 ：121攝氏度下 20分鐘。待用。2 在點燃

7、的酒精燈附近將培養基倒入平皿，冷卻制成9個平板，待用3 取樣并制備土壤稀釋液 找一處含沙質較多的土壤，靠近植物根部取其表層5cm以下的土適量于塑料袋中帶回實驗室。稱出10克于帶有無菌玻璃珠的250ml錐形瓶中，用已滅菌的量筒量取90ml無菌水溶解，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混勻。點燃酒精燈在火焰附近，用無菌移液槍從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml 無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌移液槍從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 不同稀釋度的土壤溶液4 涂布。將上述 9個平板分別貼上標簽10-

8、4、10-5、10-6各三個，然后用無菌移液槍分別由10-4、10-5、10-6 三管土壤稀釋液中各吸取0.1ml對號放入已寫好稀釋度的平板中 ，用無菌玻璃涂棒在培養基表面輕輕的涂布均勻，室溫下靜置5到10分鐘，使菌液吸附進培養基5培養。30攝氏度恒溫室中培養3天6 觀察并進一步分離純化。 觀察菌落特征，并記錄。再倒兩個平板。點燃的酒精燈附近，從稀釋度合適的培養平板上挑取帶有溶磷圈的菌落，在新制的平板上劃線分離，30攝氏度恒溫室中培養3天7斜面培養放置斜面。挑取單個菌落接種到3個斜面上培養。置于2830恒溫箱中培養h.與此同時，用單菌落進行以下鑒定試驗簡單染色1.1  涂片

9、 取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴蒸溜水于玻片中央，用接種環以無菌操作，分別從菌種，菌種斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。1.2固定與干燥將涂片在火焰較高處快速通過幾次，使菌體固定在載玻片上后自然干燥。1.3 染色 將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液12滴。呂氏堿性美藍于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。染色12min， 。1.4 水洗 傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。1.5 。干燥 甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體） 1.5 。 

10、鏡檢 涂片干后鏡檢。采用油鏡觀察革蘭氏染色  1.1 涂片 常規涂片法 1.2 初染 滴加結晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)于涂片上，染色12min ，傾去染色液，細水沖洗至洗出液為無色。 1.3媒染 用碘液媒染約l min ，水洗。 1.4  脫色     用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗，終止脫色，干燥。   1.5  復染 在涂片上滴加番紅液復染約

11、23min ，水洗，然后用吸水紙吸干。1.6 鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應性。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。1.7 清潔顯微鏡。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。芽孢染色1）將培養的菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加35滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約45分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約

12、76）染10分鐘。（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。（5）用番紅水溶液復染1分鐘，水洗。（6）待干燥后，置油鏡觀察，理化試驗一H2O2酶實驗試驗方法挑取固體培養基上菌落一接種環置于兩片干凈的玻片上，滴加3%過氧化氫溶液2mL于菌種上，觀察結果，若半分鐘內發生氣泡者為陽性，不發生氣泡者為陰性。二糖發酵實驗酸的產生可以利用指示劑來斷定。在配制培養基時預先加入溴甲酚紫Ph5.2(黃色)6.8（紫色），當發酵產酸時，可使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明1.配培養基：滅菌 110°C 20分鐘 甘油采用121°C 20分

13、鐘滅菌。2、編號，寫標簽。接種3、將上述以接種的淀粉，葡萄糖、蔗糖，密封于未密封的試管和對照管置于37溫室中培養24小時。三 細胞色素氧化酶試驗試劑1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液。1%-萘酚乙醇溶液。試驗方法取37(或低于37)培養20h的斜面培養物一支，將兩種試劑各23滴，從斜面上端滴下，并將斜面略加傾斜，使試劑混合液流經斜面上的培養物。如系平板培養物，則可用試劑混合液滴在菌落上。于2min內呈現藍色者為陽性。陽性培養物大多數于半分鐘內出現強陽性反應，2min以后出現微弱或可疑反應均作為陰性結果。 實驗結果（一）菌落特征；實驗取10-4、10-5、10-6稀釋度。其中菌落數分別為165、53、1

14、2個。最后一個稀釋度只有一個培養基發現透明圈，其他培養基均發現有透明圈。其中有兩種菌落有明顯透明圈,特征為：1、 菌株一（暫命名為JP1）：菌落大小：13mm，形狀：圓形，表面：光滑，有光澤、邊緣整齊、半透明，顏色：淡黃色，低凸面。2、 菌株二（暫命名為JP2）：菌落大小：1mm，形狀：圓形，表面：光滑，有光澤、邊緣整齊、不透明，顏色：白色，凸面。選擇其中JP1做為研究菌株（二）鏡檢結果：1、革蘭氏染色：陽性。菌株一2、芽孢染色：有芽孢、形狀為卵圓形。3、菌形：桿狀。（三）生理生化特征：實驗類型糖酵解H2O2 酶分解細胞色素C結果產酸不產氣陽性結果分析： 先有鏡檢結果得知該菌為革蘭氏陽性產芽孢

15、桿菌，由此查伯杰氏手冊的第十五部分：芽孢桿菌和球菌的芽孢桿菌科芽孢桿菌屬。確定為臘狀芽孢桿菌屬，拉丁名為：B.cereus。 伯杰氏手冊中的描述為：實驗總結時間通過實驗，再次熟悉了微生物實驗的有關操作。并且作為第一次系統的實驗步驟，了解了完成一個實驗的步驟流程，總結了一些經驗。學會了使用伯杰氏手冊。能夠根據目的菌落選擇適當的方法及培養基進行篩選，并為下一步實驗保存了菌種。現對試驗中的經驗及改進方案總結如下：(一)：經驗1、大家集體分工協作的方法及注意事項，利用公共郵箱共享資料。2、實驗時間安排注意微生物生長時間，一般細菌三到五天即可，不同均根據情況調整，使微生物長勢最好（二）：改進 1、計劃要盡量詳細，避免出現混亂的狀況。 2、培養基現用現倒，培養基存放過長影響培養。參考文獻：華北農學報 Acta Agriculturae Boreali-Sinica生態學雜志 Chinese Journal Of Ecology河南農業科學 Journal Of Henna Agricultural Sciences 現代微生物學與實驗技術作者：林稚蘭，黃秀梨主編微生物學實驗指導 致謝詞：本文是在龐昕老師精心指