1、免疫介導(dǎo)型再生障礙性貧血小鼠間充質(zhì)干細胞成骨及成脂潛能改變(1)                 作者：高瑞蘭 尹利明 錢煦岱 林筱潔 陳小紅 王瀟【摘要】  目的探討免疫介導(dǎo)型再生障礙性貧血小鼠間充質(zhì)干細胞（msenchymal stem cell，MSC）向成骨及成脂肪細胞分化潛能的改變。方法采用免疫介導(dǎo)法進行再障造模，Babl/c小鼠經(jīng)60Co射線亞致死劑量照射后，自尾靜脈輸入DBA/2小鼠的淋巴細胞建立免疫介

2、導(dǎo)型再生障礙性貧血小鼠模型；造模15天后進行再生障礙性貧血小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)，并檢測骨髓成纖維細胞集落形成單位（CFUF）數(shù)量變化，觀察模型小鼠骨髓病理改變；茜素紅和油紅O分別檢測模型小鼠MSC鈣結(jié)節(jié)數(shù)和脂肪細胞形成率。結(jié)果再障模型小鼠CFUF數(shù)明顯減少；骨髓病理切片顯示，造血組織減少，并脂肪化；再障小鼠MSC鈣結(jié)節(jié)數(shù)量減少，脂肪細胞分化率顯著增加。結(jié)論免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠MSC成骨潛能減弱，成脂潛能明顯增強。 【關(guān)鍵詞】  再生障礙性貧血；骨髓間充質(zhì)干細胞；成骨潛能；成脂潛能骨髓間充質(zhì)干細胞是造血微環(huán)境的重要組成細胞，其生物特性的改變將影響骨髓造血，有研究表明再生障礙性

3、貧血患兒MSC增殖能力弱于正常患兒1，但至今尚未見MSC與再生障礙性貧血發(fā)病機理的相關(guān)報道。因此，本研究通過探討再生障礙性貧血模型小鼠骨髓MSC向成骨細胞以及脂肪細胞分化潛能的改變，期望為進一步闡明再生障礙性貧血的發(fā)病機理提供一定的理論基礎(chǔ)。1  材料1.1  動物  Babl/c小鼠（1822g，雌雄不限）50只，作為再生障礙性貧血模型（aplastic anemia ，AA）載體。DBA/2小鼠（1822g，雌雄不限）5只，作為再障模型免疫活性細胞供體（均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供）。1.2  主要試劑  熒光素標記大鼠抗小鼠抗體：CD2

4、9PE，CD44PE，CD45FITC及相關(guān)同型對照抗體購于eBioscience公司（美國）。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程公司。茜素紅、油紅O均購自Sigma（美國）。2  方法2.1  骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)  頸椎脫臼處死Babl/c小鼠，用75%的乙醇浸泡10min，無菌條件下取出雙側(cè)下肢骨，DMEM培養(yǎng)液沖骨髓，過4、6號針頭制成單細胞懸液，1500轉(zhuǎn)/分離心洗滌兩次后，計數(shù)調(diào)整細胞濃度，用含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100U/ml的LDMEM培養(yǎng)液重懸，按照1×107細胞/cm2接種于培養(yǎng)皿中，并置于于37、5%CO2及飽和濕

5、度的恒溫箱中進行培養(yǎng)，72h首次換液，以后3至4天換液一次，當(dāng)達到80%融合時用0.25%胰酶消化進行傳代，根據(jù)所到細胞數(shù)按11或12進行傳代純化培養(yǎng)。以下實驗均采用純化的第4代貼壁細胞。2.2  MSC表面抗原鑒定  胰蛋白酶消化法收集上述貼壁細胞，分別與抗小鼠的CD29PE、CD44PE和CD45FITC抗體及相關(guān)同型對照室抗體溫孵育15min后，PBS洗滌1次，流式細胞術(shù)檢測貼壁細胞表面分子表達情況。實驗重復(fù)3次，以確立骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)體系。2.3  免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血模型建立  按照本研究室建立的方法2。先制備供體的胸腺和淋巴細胞懸液：D

6、BA/2小鼠，頸椎脫臼處死，無菌取出胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝及腸系膜等處的淋巴結(jié)。置200目的不銹鋼過濾網(wǎng)上，輕輕搗碎研磨，生理鹽水沖洗，收集單細胞懸液。計數(shù)后，胎盤藍拒染，活細胞>95%，調(diào)整細胞濃度至5×106/L。Babl/c小鼠經(jīng)60Co射線（1.0Gy，5min）全身均勻照射后，于4h內(nèi)自尾靜脈輸入供鼠的淋巴細胞106/只。2.4  成骨細胞培養(yǎng)及鑒定  取第4代MSC，接種于六孔板，2×105細胞/孔，當(dāng)細胞貼壁生長達6070融合時，吸去孔中培養(yǎng)液，加入成骨細胞誘導(dǎo)液（含LDMEM、10%FBS、10-8M/L地塞米松、10-2M

7、/L甘油磷酸鈉、50mg/L抗壞血酸），每3d換一次液。培養(yǎng)23周后。去除培養(yǎng)液，PBS洗兩次，95%乙醇固定10min，蒸餾水洗3次，加入0.1%茜素紅，37染色30min，去除染液，蒸餾水沖洗后，即在顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)。2.5  成脂肪細胞培養(yǎng)及鑒定  取第4代MSC，接種于六孔板，4×105細胞/孔，當(dāng)細胞貼壁生長達80融合時，吸去孔中培養(yǎng)液，加入成脂肪細胞誘導(dǎo)液（含LDMEM、10%FBS、0.25×10-6M/L地塞米松、50×10-6M/L吲哚美辛、0.5×10-3M/L 3異丁基1甲基黃嘌呤、10×10-3g/

8、L胰島素）進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3d換1次液。培養(yǎng)23周后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，用10%甲醛固定細胞10min，蒸餾水漂洗，然后2%油紅O染液室溫染色20-30min，去除染液，PBS洗2次，蘇木素復(fù)染后，顯微鏡下觀察3個不同視野并計數(shù)200個細胞，統(tǒng)計脂肪細胞分化率。2.6  成纖維細胞集落形成單位（CFUF）培養(yǎng)  骨髓單個核細胞重懸于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，1ml/孔，置于37、5%CO2飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)7天后，PBS洗兩遍，瑞士-吉姆薩染色，顯微鏡下觀察，以大于10個成纖維細胞的

9、聚合為一個集落，并計數(shù)每孔的集落數(shù)。2.7  骨髓病理切片  取小鼠雙側(cè)下肢骨，置于苦味酸-多聚甲醛固定液中，固定2448h后，稀鹽酸中脫鈣46h后，進行脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓造血組織增生情況。2.8  統(tǒng)計學(xué)處理  利用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)來表示，組間比較用t檢驗。本篇論文由網(wǎng)友投稿，3COME文檔只給大家提供一個交流平臺，請大家參考，如有版權(quán)問題請聯(lián)系我們盡快處理。3  結(jié)果3.1  骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)及鑒定  正常

10、Babl/c小鼠骨髓單個核細胞種入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)3d后，倒置顯微鏡觀察，可見集落樣生長的貼壁細胞，細胞形態(tài)不均一，7天左右即可融合為單層。傳代細胞形態(tài)均一，以梭形為主，經(jīng)34次傳代后貼壁細胞可以獲得純化。流式細胞儀測定第4代MSC細胞免疫表型，結(jié)果顯示CD44表達為（99.6±4.3）%，CD29±表達為（98.8±8.9）%；CD45陰性表達（見圖1）。     A.CD29PEB.CD44PEC.CD45FITC圖1  Babl/c小鼠第4代MSC表面抗原流式細胞術(shù)分析（略）3.2  免疫介導(dǎo)再

11、生障礙性貧血小鼠模型的建立  按照本研究室方法建立的模型，均于造模后4天出現(xiàn)貧血癥狀。正常小鼠骨髓造血結(jié)構(gòu)完整，造血組織豐富；模型小鼠骨髓造血結(jié)構(gòu)破壞，造血細胞減少，脂肪化（見圖2）。    A，正常小鼠造血組織結(jié)構(gòu)完整，造血細胞分布均勻，造血細胞增殖旺盛；B，模型小鼠造血結(jié)構(gòu)破壞，造血細胞減少，造血組織被大量的脂肪組織代替。圖2  正常小鼠和模型小鼠骨髓病理（略）3.3  成骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)及茜素紅染色鑒定  第4代MSC在成骨細胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)條件下，連續(xù)培養(yǎng)5天可見細胞復(fù)層生長，局部增厚，細胞集落中心出現(xiàn)沉積物，繼續(xù)培養(yǎng)出現(xiàn)

12、肉眼可見的結(jié)節(jié)，14天后茜素紅染色，沉積物被茜素紅染為深紅色，即為鈣鹽特征性染色（見圖3）。再障模型小鼠MSC細胞復(fù)層生長緩慢，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量少于正常小鼠（見表1）。  A.正常小鼠MSC分化的鈣結(jié)節(jié)；B模型小鼠MSC分化的鈣結(jié)節(jié)。圖3  MSC成骨潛能改變（×100）（略）MSC經(jīng)成骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)14天后，茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)數(shù)量。3.4  成脂細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)及油紅“O”染色鑒定  正常小鼠和再障小鼠第4代MSC分別用脂肪細胞培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，再障小鼠誘導(dǎo)形成的脂肪滴出現(xiàn)時間（7天）早于正常小鼠（10天），繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，脂肪滴明顯增大并發(fā)生

13、融合。誘導(dǎo)21天后，油紅O染色，融合的脂肪滴被油紅O染色為明亮的紅色（見圖4），蘇木素復(fù)染細胞核染成藍色，在正直顯微鏡下選擇3個不同視野計數(shù)200個細胞，計算脂肪細胞誘導(dǎo)率，再障小鼠MSC向脂肪細胞誘導(dǎo)分化率明顯高于正常小鼠MSC（見表1）。    A.正常小鼠MSC分化的脂肪細胞；B.模型小鼠MSC分化的脂肪細胞。圖4  MSC成脂肪細胞分化潛能改變（×400）（略）MSC經(jīng)成脂肪細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，油紅O染色后蘇木素復(fù)染，觀察脂肪細胞分化率。3.5  CFUF培養(yǎng)  體外CFUF培養(yǎng)可以直接反應(yīng)體內(nèi)MSC數(shù)量

14、，再生障礙性貧血小鼠CFUF數(shù)量明顯低于正常小鼠（見表1）。表1  正常小鼠與再障模型小鼠CFUF數(shù)量和分化能力的比較（略）與正常小鼠比較，*P0.014  討論    近年來對間充質(zhì)干細胞的研究已經(jīng)比較深入，并且對于間充質(zhì)干細胞的特性改變是否參與疾病的發(fā)生也在積極的討論中，并取得了一些結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)模擬再生障礙性貧血的模型小鼠CFUF數(shù)量減少，成骨能力降低，成脂能力增強。    CFUF可以反應(yīng)體內(nèi)MSC的數(shù)量3，因此可以作為MSC數(shù)量的檢測方法。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫再障小鼠CFUF數(shù)量低于正常小鼠，表明免疫再障小

15、鼠MSC數(shù)量較少，但是是否是再障發(fā)生的始動因素還需進一步研究。    間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能，在不同誘導(dǎo)條件下，可以誘導(dǎo)形成成骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞等其他類型的細胞。成骨細胞不僅是骨骼系統(tǒng)重要組成細胞而且是造血“壁龕”重要組成細胞4，因此成骨細胞的質(zhì)和量直接影響骨骼系統(tǒng)和造血系統(tǒng)。本研究發(fā)現(xiàn)再障模型小鼠間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化障礙，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量減少，可以推斷再障模型小鼠骨髓成骨細胞數(shù)量減少，造血“壁龕”數(shù)量減少，從而造血干、祖細胞增殖分化的場所減少，導(dǎo)致骨髓組織中造血細胞減少。再障小鼠骨髓病理切片顯示：造血組織減少，脂肪化。骨髓的脂肪細胞由間充質(zhì)干細胞分化而來，模型小鼠MSC向脂肪細胞分化能力增強，導(dǎo)致骨髓脂肪化。關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細胞分化能力改變的始動因素仍需進一步研究。【參考文獻】  1 陳靜，王茜，施英唐，等.再生障礙性貧血患兒骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特點M.中國實驗血液學(xué)雜志,2005，13（5）：832838.2 蓋云，高瑞蘭，牛泱平，等.三七皂苷對免疫介導(dǎo)型再生障礙性貧血小鼠造血祖細胞的增殖作用M.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,200