1、單克隆抗體的制備、純化及鑒定一、實驗目的：單克隆抗體制備是細胞免疫學的一個重要里程碑，它涵蓋了細胞培養、細胞融合、 免疫動物和抗體效價檢測等各個方面內容。二、實驗原理：骨髓瘤細胞在體外培養能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；而抗原免 疫的B淋巴細胞能產生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫脾細胞與 骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞， 繼承了兩個親代細胞的特性，既具有骨髓 瘤細胞能無限制增殖的特性，又具有免疫 B細胞合成和分泌特異性抗體的能力。 經在HAT培養基含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）中進行選 擇性培養，未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡； 未融合的骨髓

2、瘤細胞 合成DNA的主要途徑被培養基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶（HGPRT），不能利用培養基中的次黃嘌呤完成 DNA的合成過 程而死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，因此能在HAT培養基中存活和增殖。經過克隆選擇，可篩選出能產 生特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞， 在體內或體外培養，即可無限制地大量制備 單克隆抗體。三、試劑與器材：細胞培養板、解剖器械、平皿、酶標儀、加樣器、細胞計數板、C02培養箱、倒置顯微鏡等。四、操作方法：1、抗原制備；一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強的抗原。A 可溶性抗原（蛋白質）以1

3、mg/ml5mg/ ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點小鼠皮下注射，總量為 0.3ml0.6ml，間隔35周再同樣注 射一次，10天后，斷尾取血一滴，測抗體效價，選滴度高的小鼠做融合試驗。 一個月后可以經靜脈（尾靜脈）給予無佐劑抗原 0.2ml0.4ml,34天后，殺 死小鼠取脾做融合用。B. 顆粒性抗原 如抗原來源方便， 可以不加佐劑而增加免疫次數， 縮短間隔 時間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以1%濃度每只皮下注射0.2 ml，每周2次，共免疫58次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人認為最后一次免疫劑 量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫動物；目前應用最廣的是小白鼠和大白鼠，

4、尤以小白鼠為好。品系以Balb/c小白鼠應用最廣，因為所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導出來。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以 812周齡為宜。免疫程序、劑量和方法關系到能否得到所需要的單克隆抗體的關鍵之一。 正常小鼠脾臟含有能產生各種不同抗體的 B 淋巴細胞，一只純種小白鼠能 產生1.0X1075.0X107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細胞與小鼠 骨髓瘤融合， 只能有千萬分之一的機會獲得某一種特定抗體。 所以為了提高得到 某種雜交瘤的機會，必須加強免疫，使產生特異性抗體的 B 淋巴細胞大量增加。B 淋巴細胞的不同發育階段對獲得陽性雜交瘤也有很大影響。 有

5、人認為處在 轉化時期的 B 淋巴細胞可能更易于融合，而免疫以后 78 天，雖然是抗體產生 的高峰時期， 但形成有活力的雜交瘤細胞的可能反而減少。 故一般認為加強免疫 后的第三天應殺鼠取脾做細胞融合。3、免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備；脾細胞制備 免疫過的血清抗體滴度高的 Balb/c鼠，拉頸或用C02處死小白鼠。(2) 將小鼠放于 70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾。把脾放入5ml含有2.5% FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。(4) 用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細胞懸液，用毛細管將懸液移入小試管中。(5) 直立小試管3min，使大塊的結締組織下沉，把細胞懸液移入

6、離心管中。 以2.5%FCS1640充滿離心管，并以400g離心7min10min (與此同時應 開始制備骨髓細胞)。(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養液再懸浮。(8) 重復、步驟。(9) 計算細胞，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細胞數應高于80%為合格。骨髓瘤細胞制備骨髓瘤細胞能產生并分泌大量的免疫球蛋白， 這樣的瘤細胞融合后， 可能影 響或降低所分泌抗體的滴度， 所以 必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤 細胞。選擇骨髓瘤細胞的條件： 該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品 系，以便兩者的組織相容性抗原一致； 骨髓瘤細胞必須是靜息狀態，不產生丫 球蛋白或不分泌到細胞外；骨髓瘤細

7、胞生長需要一個較高的細胞密度，最好106個細胞/ml;生長速度快，繁殖時間短。目前常用的Balb/c小鼠產生的骨髓瘤細胞株有：S194/5XXO BU1; SP2/ 0 Ag14 （簡稱 SP2）; P2 X ? Ag8 6 5 3 （簡稱 653）; FO 以653最為常用，它是由礦物油4甲基一15烷（Pristane,降植烷）誘發出來 的一種漿細胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經過培育形成一株 8- 氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系。骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入，保存于-195C液氮罐中，試驗時復蘇、 增殖、傳代即可。由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態，很容易脫落，

8、因此不需要胰酶 處理。為了防止出現返祖現象，在融合前，可將培養基內加入15卩g/ml 8-氮鳥 嘌呤。取約1X 1076X107對數生長期（即培養15h20h）的骨髓瘤細胞，在 室溫離心（400g） 10min，沉淀以2.5% FCS1640液再懸浮并計數。 飼養細胞在體外的細胞培養中， 單個的或數量很少的細胞不易生存與繁殖， 必須加入 其它活的細胞才能使其生長繁殖，加入的細胞稱之為飼養細胞（ Feeder cell）。 在細胞融合和單克隆的選擇過程中， 就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長 繁殖成群體， 因此在這一過程中必須使用飼養細胞。 許多種類的動物細胞都可以 做飼養細胞，如正常的脾細

9、胞、胸腺細胞、腹腔滲出細胞等，常選用腹腔滲出細 胞，其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞。 應用腹腔滲出細胞的好處是： 一方面做飼 養細胞，另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片， 為融合細胞的生長 造成良好的環境。 腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠。 也可以是其他種 類的小鼠，女口 C57鼠，昆明小白鼠等。(1) 拉頸處死小鼠。(2) 70%酒精浸泡消毒10min。(3) 用手術剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔。(4) 用注射器將4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉 1min仍用該 注射器回抽腹腔液體，加入離心管。(5) 1 000ry min 離心 10min。(6

10、) 取上清，以HAT選擇培養液將細胞制成懸液。臺盼藍染色計數活細胞， 使每毫升含40萬個活細胞。(7) 以1ml吸管將細胞種入微量培養皿，每孔 0.05ml，含2萬個細胞，放 入CO2培養箱培養，即可供細胞融合和克隆化之用。如果在融合后發現在培養 孔中飼養細胞數量少，則可以在細胞換液時再加入一些。4、細胞融合；小鼠骨髓瘤可以在體外培養液中生存并大量繁殖。 經過用某種抗原免疫的小 鼠及淋巴細胞能分泌某種抗體，但小鼠的 B淋巴細胞在一般培養某中不易存活。 如將小鼠的骨髓瘤細胞與分泌霜種抗體的B淋巴細胞在融合因子(聚乙二醇，PEG)作用下產生融合，則融合的細胞既具有腫瘤細胞易分裂增殖的特性，又具 有

11、B淋巴細胞分泌特異性抗體的能力，在 HAT選擇培養基中可以選擇得到雜交 細胞。這種融合的被稱為淋巴細胞雜交瘤的細胞可以在體外培養液中大量繁殖生 長，從培養液上清中可以收集到大量某 B淋巴細胞產物一一單克隆抗體。(1) 取末次免疫后的第3天小鼠脾細胞懸液，將108小鼠脾細胞與1-5X107SO 2/O小鼠骨髓瘤細胞混合于50毫升刻度離心管中，經1000轉/分離心7分鐘；(2) 棄上清液，盡可能除得干凈，用手指輕叩離心管底部，使沉淀混勻如糊狀， 離心管置37r水中進行水浴(一小燒杯中)，準備融合；(3) 將37C水浴中保溫的50%PEG1.0毫升(實際應用0.7毫升)用滴管緩慢滴 入離心管中，在6

12、0秒鐘內滴完，在37E水浴中邊滴邊搖邊離心管，使細胞保存 在混勻狀態；(4) 加完PEG后，將細胞懸液放在37C水浴中靜置90秒鐘，立即在2 4分 鐘內加入15毫升無血清的RPMI-1640培養基(37C)，開始要一滴一滴地加， 由于稀釋使PEG停止作用。注意盡可能不攪動細胞；(5) 再經100轉/分離心10分鐘。棄去上清液，加25毫升HAT培養液，輕輕 混勻，將混懸液分裝已有巨噬細胞的兩個 24孔培養板中，每孔 0.5毫升；(6) 將培養板放在水蒸汽飽和 C02孵箱中，37 C孵育。C02含量為5%;(7) 每 2-3天換一次 HAT 培養液，連續 2周觀察雜交瘤細胞是否出現。 2周后 使用

13、 HT 培養基。5、單克隆抗體檢測 用檢測抗體的方法從雜交細胞中篩選出生產指定抗體的雜交株是很重要的。 檢測 抗體的方法很多， 從沉淀反應到放射免疫測定。 由于細胞培養液中的抗體濃度通 常是很低的， 而且傳統的檢測方法多是以多價抗原與多克隆抗血清相反應。 雜交 瘤產生的抗體則是單克隆的， 所以并不是每項方法都能適用。 一定要選擇敏感的、 快速的、一次又能檢測多份樣品的方法。如：膜熒光檢測法(1) 材料：培養液HEM或RPMI 1640;熒光試劑：異硫氰酸熒光素(FI TC)標記的抗小鼠免疫球蛋白；50%甘油緩沖液：1份甘油加1份體積0.05 Mol/L pH 7.2 PBS液混合即成；熒光顯微

14、鏡、載玻片、蓋玻片、吸管等。(2) 操作方法：用培養液洗滌二次細胞，懸浮成 2.0X107/ml :50 pl細胞 懸液加50 p l培養上清液混合，置4C30min,用培養液洗滌3次，1 000r/min 離心；以50PFITC 抗小鼠免疫球蛋白重新懸浮壓積細胞，水浴30min60m in :用冷培養液洗3次細胞，重新懸浮；取一滴細胞懸液滴在玻片上，復蓋 片，用甘油緩沖液封固，置熒光顯微鏡下觀察。著色細胞也可以在固定后觀察， 一滴細胞懸液，涂片、風干，用 95%酒精固定10min，固定后的載玻片用PBS 洗滌，蓋上蓋玻片，進行觀察。免疫球蛋白和亞類球蛋白的檢測 以瓊脂雙擴散試驗法進行，此法簡

15、單易操作， 特異性好。注意必須將培養液濃縮 1 0 50倍，否則做雙向瓊擴不出現沉淀線。 其檢測方法為：(1) 制備各種兔抗小鼠lgG14、 lgM12、lgA12和K、入抗血清,也可直接 購買。( 2)取 5ml 培養物的上清液緩慢加入 0.5ml 的飽和硫酸銨溶液， 混勻，靜置 3h， 離心沉淀，去上清，沉淀加 0.05ml 蒸餾水溶解。(3) 制成1 %瓊脂糖凝膠板，打孔。中間孔加 20卩l濃縮上清液，周圍孔加20卩I特異性抗血清，以10卩l正常小鼠血清作對照。也可以采用酶聯免疫吸附試驗 ELISA、間接血凝試驗以及放射免疫等方法檢測。6、克隆化經過抗體測定的陽性孔， 可以擴大培養， 進

16、行克隆， 以得到單個細胞的后代分泌 單克隆抗體。 克隆的時間一般說來越早越好。 因為在這個時期各種雜交瘤細胞同 時旺盛生長， 互相爭奪營養和空間， 而產生指定抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可 能。但克隆時間也不宜太早，太早細胞性狀不穩定，數量少也易丟失。克隆化的 陽性雜交瘤細胞， 經過一段時期培養之后， 也還會因為細胞突變或特定染色體的 丟失，使部分細胞喪失產生抗體的能力， 所以需要再次或多次克隆化培養。 克隆 化次數的多少由分泌能力強弱和抗原的免疫性強弱而決定。 一般說，免疫性強的 抗原克隆次數可少一些，但至少要 35次克隆才能穩定。克隆化的方法很多， 包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及

17、熒光激活分離法等。有限稀釋法1 材料(1) 微量培養盤，盤內各孔于克隆化前一天培養小鼠腹腔細胞(即飼養細胞) 每孔 2 萬 4 萬。( 2) HT 培養基2操作方法(1)取出抗體陽性孔細胞，用 HT 培養液制成細胞懸液。并取樣進行臺盼蘭染 色，計數。(2) 用HT培養液將細胞稀釋成200個/ml、40個/ml、20個/ml和10的懸液。(3) 用吸管將細胞懸液分別種入微量培養盤，每孔 0.05ml，細胞含量分別為10 個/孔、 2個/孔、 1個/孔和0.5個/孔。(4) 5% CO2飽和濕度，37C培養。( 5)每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況，選擇只有一個集落生長的孔，棄掉 兩個以上和沒有細

18、胞生長的孔。( 6)克隆大量繁殖后，布滿孔底的 1/3 1/2 時，測培養液抗體。(7)抗體陽性孔細胞，移到有飼養層的組織培養瓶中，并傳24代就可以脫離飼養細胞，建成克隆株7、雜交瘤細胞的大量繁殖 克隆化的細胞可以在體外進行大量培養， 收集上清液而獲得大量的單一的克隆化 抗體。不過體外培養法得到的單克隆抗體有限， 其不能超過特定的細胞濃度， 且 每天要換培養液。 而體內雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。 雜交瘤細胞具有從 親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。 如接種到組織相容性的同系小鼠或不 能排斥雜交瘤的小鼠(無胸腺的裸鼠)，雜交瘤細胞就開始無限地繁殖，直至宿 主死亡。產生腫瘤細胞的小鼠腹水

19、和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌的單克隆 抗體，這種抗體的效價往往高于培養細胞上清液的 1001 000倍。利用免疫抑制 劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細胞血清等，可以加速和促進腫瘤的生長。 1材料(1)經高壓滅菌的降植烷。 ( 2) Balb/c 鼠：58 周齡。( 3)雜交瘤細胞：取對數生長期的細胞。( 4) RPMI1640 培養液( 5)新生牛血清2操作方法 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后19周內種植細胞。 收取對數生長期的雜交瘤細胞，用5% FCS1640液洗滌一次，1 000r/mi n 離心 10min。 取樣，用臺盼蘭染色，計活細胞數，重新用5% FCS1640液配成1

20、.0 X 107 細胞/ml的懸液。(4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細胞，每只腹腔注射1ml (含1.0X 107個細胞/ml )。(5) 接種后 10天左右時間腫瘤體積最大，此時可由腹腔抽取腹水，每隔13天取 1 次，可取 10 次。血清可由腋下動脈或心臟采血后分離。8、單克隆抗體的提純1 材料(1) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl 緩沖液， 20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 緩沖液， 40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 緩沖液， 80 mMol/L NaCl(4

21、) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 緩沖液(5) 飽和硫酸銨液(6) DEAE- 纖維素柱 2操作方法(1) 小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00X105轉離心30min，去沉淀。(2) 在4C于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使溶液最終為50% 硫酸銨濃度。(3) 此溶液置冰中30min60min，然后5 000r/min離心10min，去上清。(4) 將沉淀溶于Tris HCI緩沖液(40mMol/L NaCI)中(溶液可能混濁)。(5) 裝入透析袋于Tris HCl緩沖液(20 mMol/L NaCl)中透析除鹽。( 6)離心去沉淀。( 7)溶液稀釋( 1:100 或更高倍稀釋)后，于 280nm 測蛋白含量。1A 280unit=0.8mg 蛋白質。一般每 ml 腹水中，含有總蛋白約 25mg36mg。(8) 過DEAE 纖維素柱：纖維素柱高 40cm,以20mMol/L NaCl Tris緩沖液 平衡。透析樣品以 Tris 緩沖液等量稀釋。樣品進入柱床速度為 1ml2ml/min ，以 NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫, 也有極少例外的單克隆抗體于 120 mMol/L 150 mMol/L NaCl洗脫。測