1、實驗六實驗六 葉綠體的分離與觀察葉綠體的分離與觀察 葉綠體是植物細胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細胞器，光合作用就是在葉綠體中進行的。 實實 驗驗 目目 的的 1. 通過植物細胞葉綠體的分離通過植物細胞葉綠體的分離, 了解細胞了解細胞器分離的一般原理和方法。器分離的一般原理和方法。 2. 觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光, 并并了解熒光顯微鏡的使用方法。了解熒光顯微鏡的使用方法。 實驗原理實驗原理 組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心，組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心，是分離細胞器的常用方法。是分離細胞器的常用方法。 一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大一個顆粒在

2、離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞組分。分批收集即可獲得各種亞細胞組分。 Low speedHigh speedDifferential centrif

3、ugation 試劑與器械試劑與器械 1. 器材器材 : 普通離心機、組織搗碎機、粗普通離心機、組織搗碎機、粗天平、熒光顯微鏡。燒杯天平、熒光顯微鏡。燒杯2個個, 250ml量筒量筒1個個, 滴管滴管20支支, 10ml刻度離心管刻度離心管20支支, 試試管架管架5個，紗布若干，載片和蓋片各個，紗布若干，載片和蓋片各4片。片。 2. 試劑試劑: 0.35mol/L氯化鈉溶液，氯化鈉溶液，0.01%吖吖啶橙啶橙(acridine orange)。三三. .實驗步驟實驗步驟（一葉綠體的分離與觀察（一葉綠體的分離與觀察 1.1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干

4、后去除葉梗脈，稱30g30g于于150ml 150ml 0.35mol/L NaCl 0.35mol/L NaCl溶液中，裝入組織搗碎機。溶液中，裝入組織搗碎機。 2. 2. 利用組織搗碎機低速利用組織搗碎機低速(5000r/min)(5000r/min)勻槳勻槳3-5min3-5min。 3. 3. 將勻漿用將勻漿用6 6層紗布過濾于層紗布過濾于500ml500ml燒杯中。燒杯中。 4. 4. 取濾液取濾液4ml4ml在在1000r/min1000r/min下離心下離心2min2min，棄去沉淀。，棄去沉淀。 5. 5. 將上清液在將上清液在3000r/min3000r/min下離心下離心5

5、min5min。棄去上清液，沉淀即是葉綠體。棄去上清液，沉淀即是葉綠體 ( (混有部分細胞核混有部分細胞核) )。 6. 6. 將沉淀用將沉淀用0.35mol/LNaCl0.35mol/LNaCl溶液懸浮。溶液懸浮。 7. 7. 取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。 （二菠菜葉手切片觀察（二菠菜葉手切片觀察 新鮮菠菜葉新鮮菠菜葉 刀片切出一斜面置于載玻片上刀片切出一斜面置于載玻片上 滴加滴加12d12d氯化鈉溶液氯化鈉溶液 蓋上蓋片顯微鏡下觀察蓋上蓋片顯微鏡下觀察 實實 驗驗 結(jié)結(jié) 果果 （一葉綠體的分離和觀察

6、（一葉綠體的分離和觀察 1. 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。粒，即基粒。 2. 以以O(shè)lympus熒光顯微鏡為例，在先用熒光顯微鏡為例，在先用B(bule)激激發(fā)濾片、發(fā)濾片、B雙色鏡和雙色鏡和O530(orange)陰斷濾片的條陰斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。 3. 加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細胞核則發(fā)綠色熒光。而其中混有的細胞核則發(fā)綠色熒光。

7、 （二菠菜葉手切片觀察（二菠菜葉手切片觀察 1. 在普通光鏡下可以看到三種細胞在普通光鏡下可以看到三種細胞 (1)表皮表皮細胞細胞: 為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細胞為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細胞; (2)保衛(wèi)保衛(wèi)細胞細胞: 為構(gòu)成氣孔的成對存在的腎形細胞；為構(gòu)成氣孔的成對存在的腎形細胞；(3)葉肉細胞葉肉細胞: 為排列成柵狀的長形和橢圓形為排列成柵狀的長形和橢圓形細胞。葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還細胞。葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。可以看到綠色的基粒。 2. 在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強度要比游離葉綠體弱, 氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞

8、氣孔排列成一圈。表皮細胞內(nèi)的葉綠體數(shù)量要比葉肉細胞少。 3. 用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細胞核可發(fā)出綠色熒光, 氣孔仍為綠色。 3. 用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細胞核可發(fā)出綠色熒光, 氣孔仍為綠色。 作作 業(yè)業(yè) 1. 根據(jù)熒光觀察結(jié)果，繪制菠菜葉氣孔根據(jù)熒光觀察結(jié)果，繪制菠菜葉氣孔的結(jié)構(gòu)模式圖。的結(jié)構(gòu)模式圖。 思考題：思考題： 1. 葉綠體分離的實驗原理是什么？在分葉綠體分離的實驗原理是什么？在分離葉綠體時應(yīng)注意些什么問題？離葉綠體時應(yīng)注意些什么問題？ 五五. . 實驗結(jié)果實驗結(jié)果1. 1. 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。2. 2. 用目微尺和臺微尺測量一下葉綠體的長軸和短軸，分別測量用目微尺和臺微尺測