1、    陰溝腸桿菌質粒介導耐喹諾酮類藥物的機制研究(1)    】 目的 了解深圳地區陰溝腸桿菌中qnrA基因的流行情況、基因定位及其介導喹諾酮耐藥性產生的機制。方法 收集臨床分離的陰溝腸桿菌45株，采用PCR法結合測序的技術篩查qnrA基因，大質粒提取技術、Southern雜交和接合傳遞試驗進行質粒定位，瓊脂對倍稀釋法進行藥物敏感性檢測。結果 45株陰溝腸桿菌中，7株PCR法及測序證實為qnrA基因。7株菌中6株菌所攜質粒被成功提取并進行Southern雜交，qnrA基因定位于80200kb大小的低拷貝數天然質粒

2、上。4株菌成功進行接合傳遞試驗，使接合子對環丙沙星的MIC值提高了3264倍。結論 質粒介導的喹諾酮耐藥基因qnrA在深圳地區陰溝腸桿菌中具有較高的流行率，可能是導致陰溝腸桿菌對喹諾酮類抗菌藥獲得性耐藥的重原因。 【關鍵詞】 qnrA基因 陰溝腸桿菌 喹諾酮 耐藥 質粒    Plasmidmediated quinolone resistance in clinical isolates    ABSTRACT Objective To investigate the prevalence and locatio

3、n of qnrA gene in clinical isolates of Enterobacter cloacae and its function in the development of quinolone resistance. Method Fortyfive Enterobacter cloacae were screened for the qnrA gene by PCR and then conformed with direct sequencing. Large plasmid extraction and Southern hybridization were do

4、ne to determine the location of qnrA. Conjugation experiments were done to determine the transferability and its effects in the development of quinolone resistance. Results qnrA were detected in 7 (15.6%) of 45 strains. The qnrA sequence matched that of NCBI GenBank with 100%. Plasmid extraction and

5、 Southern hybridization were succeed in 6 stains. The qnrA were located in plasmids in size of 80200kb. Conjugation experiments were done in 4 strains. Transconjugants had 3264fold increases in the MIC of ciprofloxacin relative that of the recipient but were still susceptible to ciprofloxacin accord

6、ing to CLSI stardard. Conclusion Transferable plasmidmediated quinolone resistance associated with qnrA were high prevalent in clinical isolates of Enterobacter cloacae from Shenzhen city and may contribute to the quinolone resistance of thiese bacteria.    KEY WORDS qnrA; Entero

7、bacter cloacae; Quinolone; Drug resistance; Plasmid    1998年，Martinez等首次證實肺炎克雷伯菌對喹諾酮類抗菌藥存在質粒介導的耐藥機制，并將該耐藥基因命名為qnr(現命名為qnrA)1。之后我國學者王明貴等研究發現qnrA基因在耐喹諾酮類抗菌藥大腸埃希菌中的檢出率高達7.7%，提示qnrA基因在介導腸桿菌科細菌耐藥機制方面可能發揮著重作用，引起廣泛關注2。    目前陰溝腸桿菌已成為醫院內感染的重病原菌，且對喹諾酮類抗菌藥的耐藥性迅速上升，給臨床抗感染

8、治療帶來嚴峻挑戰3，4。為了解qnrA基因在介導陰溝腸桿菌耐藥性播散方面的作用，本研究采用PCR技術對20042005年我院臨床分離的陰溝腸桿菌進行了qnrA基因攜帶率的篩查，DNA測序證實并與已報道的qnrA序列進行比較，并通過Southern雜交及接合傳遞試驗對qnrA基因進行了質粒定位，現報道如下。    1 材料和方法    1.1 菌株來源及鑒定    20032004年我院及深圳市人民醫院臨床分離的非重復陰溝腸桿菌45株。采用法國BioMerieux公司API 2

9、0E系統進行種屬鑒定。研究用菌株為E.coli J53/pMG252作為qnrA基因PCR檢測和Southern雜交檢測的陽性質控株，E.coli J53 Azr(耐疊氮鈉)作為接合傳遞實驗受體菌及MICs參照株，均由美國Jacoby教授提供。    1.2 抗菌藥物敏感性檢測    采用瓊脂稀釋法檢測臨床分離菌及接合子對環丙沙星的MICs值，其它抗菌藥物的敏感性采用KB法檢測。MH培養基和藥敏紙片均為Oxoid公司產品。結果按照美國臨床和實驗室標準委員會(CLSI)2005年版推薦的標準進行解釋。質控菌株為大腸埃

10、希菌ATCC25922和陰溝腸桿菌ATCC13047。    1.3 qnrA擴增和測序    采用PCR法并結合測序進行PCR引物參照文獻4委托上海英駿生物有限公司合成。上游引物5TCAGCAAGAGGATTTCTCA3，下游引物5GGCAGCACTATTACTCCCA3，增片段為627bp。PCR循環參數為：94預變性5min，95 30s，45 60s，72 60s，循環35次，最后72延伸5min。PCR產物送上海英駿生物有限公司純化后直接進行雙向測序。陽性對照菌株為E.coli J53 pMG252。&#

11、160;   1.4 qnrA序列比較    所測序列用DNAstar軟件進行序列拼接、校正后，采用美國國家信息中心(NCBI)在線分析工具Blastn(/)程序進行分析，以確定耐藥基因型或基因變異情況。qnrA基因參比序列號為AY070235及AY259086。    1.5 質粒分析及qnrA基因Southern雜交檢測    QIAfilter Plasmid Maxi Kit(QiaGe

12、n，德國)提取質粒，0.7%瓊脂糖電泳，采用LabImage軟件分析與E.coli V517及E.coli J53/pMG252所攜質粒比較的結果，以確定其分子量大小。電泳結果拍照后，用毛細管轉移法將質粒DNA轉移至硝酸纖維素濾膜上。以切膠純化的qnrA基因PCR產物為模板制備其檢測探針，按地高辛隨機引物標記和檢測試劑盒(博士德公司，武漢)說明書進行操作。    1.6 接合傳遞試驗    供體菌為臨床分離的qnrA陽性株，受體菌為E.coli J53 Azr。將供體菌、受體菌分別接種于LB平板上，35過夜培養。挑

13、取單個菌落分別接種于4ml的LB肉湯中，37>220r/min搖菌培養812。各取0.5ml供、受體菌于4ml的LB肉湯中，37靜止過夜培養。接合子以胰大豆瓊脂平皿篩選，平皿中含疊氮鈉(250g/ml)及氯霉素(30g/ml)、慶大霉素(20g/ml)或四環素(20g/ml)中的一種。在篩選平皿上生長的菌落同時接種至含及不含環丙沙星(0.06g/ml)的胰大豆瓊脂平皿上，以了解喹諾酮耐藥性是否同時轉移。此外，以PCR法對篩選出的接合子進行qnrA基因檢測，陽性者重新進行菌種鑒定，鑒定為大腸埃希菌者表明攜qnrA基因耐藥質粒接合轉移成功。    &#

14、160;       作者：吳創鴻 陸堅 鄧啟文 張扣興 【摘】目的 了解深圳地區陰溝腸桿菌中qnrA基因的流行情況、基因定位及其介         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。    2 結果    2.1 q

15、nrA基因的檢測    采用PCR方法對臨床分離的45株陰溝腸桿菌進行qnrA基因的篩查，7株(15.6%)得到了陽性擴增條帶(Fig.1)。對全部PCR產物進行測序，所得序列采用Blastn程序進行分析，結果顯示7個樣本的序列均為qnrA基因，與上海王明貴報道的qnrA基因吻合率為100%。qnrA陽性的菌株對環丙沙星的MIC值分別為0.5mg/L 3株、2mg/L 2株、4mg/L 1株，按CLSI折點判斷標準分別為敏感、中介和耐藥。    2.2 質粒提取和qnrA基因Southern雜交定位 &#

16、160;  7個qnrA基因陽性株中成功提取了6株菌的質粒進行質粒譜分析和Southern雜交檢測。質粒譜分析顯示各分別攜帶了24個天然質粒(Fig.2A)。以qnrA基因為模板制備探針進行Southern雜交檢測顯示，qnrA基因大約存在于在80200kb大小的低拷貝數天然質粒上(Fig.2B)，其中Ec28攜qnrA的質粒大于180kb，其它菌株攜qnrA的質粒大、小基本相同，小于180kb。    2.3 質粒接合傳遞試驗及藥敏分析    以7株qnrA陽性的臨床分離菌為供體菌、耐疊氮化鈉

17、的大腸埃希菌J53為受體菌進行接合傳遞試驗，其中4株菌攜qnrA的質粒成功轉移。接合子獲得質粒后對環丙沙星的MIC從0.008mg/L上升至0.250.5mg/L，提高3264倍。接合子對環丙沙星MIC與臨床分離株比較尚有28倍差距。按CLSI標準接合子對環丙沙星仍在敏感范圍。    3 討論    陰溝腸桿菌在自然環境中廣泛分布，也是人和動物腸道的正常菌群，目前已成為醫院內感染的重病原菌之一，常引起呼吸道、泌尿道、血液、傷口和燒傷部位感染。近年來的研究多注重于陰溝腸桿菌產AmpC酶及ESBLs使之對頭孢菌素類抗生

18、素耐藥；而耐藥監測結果顯示我國臨床分離的陰溝腸桿菌對喹諾酮類抗菌藥的耐藥率近年來迅速上升，目前已高達23.5%40.6%3，4。因此，準確闡述其耐藥性迅速產生的分子機制，對合理制定臨床防治措施及新藥研發具有重意義。    現有的研究結果表明，藥物作用靶位的改變和外膜通透性下降是陰溝腸桿菌耐喹諾酮的重機制5；qnrA在肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的發現使人們對喹諾酮耐藥機制有了新的認識1，6。qnrA基因定位在質粒上，所編碼的蛋白由218個氨基酸殘基組成，屬五肽重復序列家族，可以保護大腸埃希菌DNA回旋酶免受喹諾酮類抗菌藥的干擾而產生耐藥性7，8。本研究接合傳

19、遞試驗的結果也證實，qnrA基因定位在質粒上，可能是導致其耐藥性在臨床分離中株中水平傳播的主原因。本研究還發現深圳地區陰溝腸桿菌qnrA基因有較高的流行率(15.6%)，同期檢測的184株大腸埃希菌中沒有發現qnrA的流行，91株肺炎克雷伯菌中也只有4株qnrA陽性。最近Corkill等報道，英國利物浦16株對頭孢塞肟和環丙沙星耐藥的陰溝腸桿菌中有9株(56.3%)qnrA陽性9；Robicsek等報道，美國各州頭孢他啶耐藥的71株腸桿菌屬細菌中12株(17%)qnrA陽性10，提示陰溝腸桿菌中qnrA有較高的流行率是普遍現象。    值得注意的是qnr

20、A基因的檢出并不代表qnrA位于質粒上。Poirel等報道弧菌科細菌的染色體上存在與qnrA基因高度同源性的序列11；另外，對qnrA的基因環境研究發現，qnrA存在于I類整合子中，也提示qnrA可能會在染色體和質粒之間水平移動。本研究采用Southern雜交技術及接合傳遞試驗進行qnrA基因的定位。結果7株菌中6株菌攜qnrA基因的質粒被成功提取，Southern雜交檢測證實qnrA基因定位于80200kb大小的低拷貝數天然質粒上，其中4株菌的qnrA基因被證實具有跨菌種水平傳播能力。以往報道qnrA多存在于耐環丙沙星的臨床分離株中，本研究卻顯示無論耐藥、中介還是敏感的細菌均可存在qnrA，

21、接合子對環丙沙星也敏感，說明qnrA只介導低水平耐藥；臨床耐藥菌株中可能存在其它耐藥機制。我們正在對攜qnrA的臨床分離株進行深入研究，初步結果顯示該類細菌常攜帶多種耐藥基因，多種耐藥機制并存從而表現為多重耐藥。雖然qnrA只介導低水平的喹諾酮的耐藥性，但由于qnrA既可以放大由DNA旋轉酶、拓撲異構酶IV、外排泵過度表達或膜通透性下降所致的喹諾酮耐藥性，又可以增加DNA旋轉酶、拓撲異構酶IV基因變異的選擇性7，10。因此在細菌耐藥性的發展中具有重意義，需進行深入研究如何防治該耐藥性的傳播和流行。    【參考文獻】Plasmidmediated qui

22、nolone resistance in clinical isolatesof Enterobacter cloacaeWu Chuanghong1, Lu Jian2, Deng Qiwen1, Zhang Kouxing1,Zhang Guoliang2 and Pan WeiGuang1(1 Department of Infectious Diseases, The Sixth Peoples Hospital, Shenzhen 518052;ABSTRACT Objective To investigate the prevalence and location of qnrA

23、gene in clinical isolates of Enterobacter cloacae and its function in the development of quinolone resistance. Method Fortyfive Enterobacter cloacae were screened for the qnrA gene by PCR and then conformed with direct sequencing. Large plasmid extraction and Southern hybridization were done to dete

24、rmine the location of qnrA. Conjugation experiments were done to determine the transferability and its effects in the development of quinolone resistance. Results qnrA were detected in 7 (15.6%) of 45 strains. The qnrA sequence matched that of NCBI GenBank with 100%. Plasmid extraction and Southern

25、hybridization were succeed in 6 stains. The qnrA were located in plasmids in size of 80200kb. Conjugation experiments were done in 4 strains. Transconjugants had 3264fold increases in the MIC of ciprofloxacin relative that of the recipient but were still susceptible to ciprofloxacin according to CLS

26、I stardard. Conclusion Transferable plasmidmediated quinolone resistance associated with qnrA were high prevalent in clinical isolates of Enterobacter cloacae from Shenzhen city and may contribute to the quinolone resistance of thiese bacteria.KEY WORDS qnrA; Enterobacter cloacae; Quinolone; Drug re

27、sistance; Plasmid1998年，Martinez等首次證實肺炎克雷伯菌對喹諾酮類抗菌藥存在質粒介導的耐藥機制，并將該耐藥基因命名為qnr(現命名為qnrA)1。之后我國學者王明貴等研究發現qnrA基因在耐喹諾酮類抗菌藥大腸埃希菌中的檢出率高達7.7%，提示qnrA基因在介導腸桿菌科細菌耐藥機制方面可能發揮著重作用，引起廣泛關注2。            作者：吳創鴻 陸堅 鄧啟文 張扣興 【摘】目的 了解深圳地區陰溝腸桿菌中qnrA基因的流行情況、基因定位及其介

28、         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。目前陰溝腸桿菌已成為醫院內感染的重病原菌，且對喹諾酮類抗菌藥的耐藥性迅速上升，給臨床抗感染治療帶來嚴峻挑戰3，4。為了解qnrA基因在介導陰溝腸桿菌耐藥性播散方面的作用，本研究采用PCR技術對20042005年我院臨床分離的陰溝腸桿菌進行了qnrA基因攜帶率的篩查，DNA測序證實并與已報道的qnrA序列進行比較，并

29、通過Southern雜交及接合傳遞試驗對qnrA基因進行了質粒定位，現報道如下。1 材料和方法1.1 菌株來源及鑒定20032004年我院及深圳市人民醫院臨床分離的非重復陰溝腸桿菌45株。采用法國BioMerieux公司API 20E系統進行種屬鑒定。研究用菌株為E.coli J53/pMG252作為qnrA基因PCR檢測和Southern雜交檢測的陽性質控株，E.coli J53 Azr(耐疊氮鈉)作為接合傳遞實驗受體菌及MICs參照株，均由美國Jacoby教授提供。1.2 抗菌藥物敏感性檢測采用瓊脂稀釋法檢測臨床分離菌及接合子對環丙沙星的MICs值，其它抗菌藥物的敏感性采用KB法檢測。MH

30、培養基和藥敏紙片均為Oxoid公司產品。結果按照美國臨床和實驗室標準委員會(CLSI)2005年版推薦的標準進行解釋。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和陰溝腸桿菌ATCC13047。1.3 qnrA擴增和測序采用PCR法并結合測序進行PCR引物參照文獻4委托上海英駿生物有限公司合成。上游引物5TCAGCAAGAGGATTTCTCA3，下游引物5GGCAGCACTATTACTCCCA3，增片段為627bp。PCR循環參數為：94預變性5min，95 30s，45 60s，72 60s，循環35次，最后72延伸5min。PCR產物送上海英駿生物有限公司純化后直接進行雙向測序。陽性對照菌株為E

31、.coli J53 pMG252。1.4 qnrA序列比較所測序列用DNAstar軟件進行序列拼接、校正后，采用美國國家信息中心(NCBI)在線分析工具Blastn(/)程序進行分析，以確定耐藥基因型或基因變異情況。qnrA基因參比序列號為AY070235及AY259086。1.5 質粒分析及qnrA基因Southern雜交檢測QIAfilter Plasmid Maxi Kit(QiaGen，德國)提取質粒，0.7%瓊脂糖電泳，采用LabImage軟件分析與E.coli V517及E.coli J53/pMG252所攜質粒比較的結果，以確定

32、其分子量大小。電泳結果拍照后，用毛細管轉移法將質粒DNA轉移至硝酸纖維素濾膜上。以切膠純化的qnrA基因PCR產物為模板制備其檢測探針，按地高辛隨機引物標記和檢測試劑盒(博士德公司，武漢)說明書進行操作。1.6 接合傳遞試驗供體菌為臨床分離的qnrA陽性株，受體菌為E.coli J53 Azr。將供體菌、受體菌分別接種于LB平板上，35過夜培養。挑取單個菌落分別接種于4ml的LB肉湯中，37>220r/min搖菌培養812。各取0.5ml供、受體菌于4ml的LB肉湯中，37靜止過夜培養。接合子以胰大豆瓊脂平皿篩選，平皿中含疊氮鈉(250g/ml)及氯霉素(30g/ml)、慶大霉素(20g

33、/ml)或四環素(20g/ml)中的一種。在篩選平皿上生長的菌落同時接種至含及不含環丙沙星(0.06g/ml)的胰大豆瓊脂平皿上，以了解喹諾酮耐藥性是否同時轉移。此外，以PCR法對篩選出的接合子進行qnrA基因檢測，陽性者重新進行菌種鑒定，鑒定為大腸埃希菌者表明攜qnrA基因耐藥質粒接合轉移成功。2 結果2.1 qnrA基因的檢測采用PCR方法對臨床分離的45株陰溝腸桿菌進行qnrA基因的篩查，7株(15.6%)得到了陽性擴增條帶(Fig.1)。對全部PCR產物進行測序，所得序列采用Blastn程序進行分析，結果顯示7個樣本的序列均為qnrA基因，與上海王明貴報道的qnrA基因吻合率為100%

34、。qnrA陽性的菌株對環丙沙星的MIC值分別為0.5mg/L 3株、2mg/L 2株、4mg/L 1株，按CLSI折點判斷標準分別為敏感、中介和耐藥。2.2 質粒提取和qnrA基因Southern雜交定位7個qnrA基因陽性株中成功提取了6株菌的質粒進行質粒譜分析和Southern雜交檢測。質粒譜分析顯示各分別攜帶了24個天然質粒(Fig.2A)。以qnrA基因為模板制備探針進行Southern雜交檢測顯示，qnrA基因大約存在于在80200kb大小的低拷貝數天然質粒上(Fig.2B)，其中Ec28攜qnrA的質粒大于180kb，其它菌株攜qnrA的質粒大、小基本相同，小于180kb。2.3

35、質粒接合傳遞試驗及藥敏分析以7株qnrA陽性的臨床分離菌為供體菌、耐疊氮化鈉的大腸埃希菌J53為受體菌進行接合傳遞試驗，其中4株菌攜qnrA的質粒成功轉移。接合子獲得質粒后對環丙沙星的MIC從0.008mg/L上升至0.250.5mg/L，提高3264倍。接合子對環丙沙星MIC與臨床分離株比較尚有28倍差距。按CLSI標準接合子對環丙沙星仍在敏感范圍。3 討論陰溝腸桿菌在自然環境中廣泛分布，也是人和動物腸道的正常菌群，目前已成為醫院內感染的重病原菌之一，常引起呼吸道、泌尿道、血液、傷口和燒傷部位感染。近年來的研究多注重于陰溝腸桿菌產AmpC酶及ESBLs使之對頭孢菌素類抗生素耐藥；而耐藥監測結果顯示我國臨床分離的陰溝腸桿菌對喹諾酮類抗菌藥的耐藥率近年來迅速上升，目前已高達23.5%40.6%3，4。因此，準確闡述其耐藥性迅速產生的分子機制，對合理制定臨床防治措施及新藥研發具有重意義。現有的研究結果表明，藥物作用靶位的改變和外膜通透性下降是陰溝腸桿菌耐喹諾酮的重機制5；qnrA在肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的發現使人們對喹諾酮耐藥機制有了新的認識1，6。qnrA基因定位在質粒上，所編碼的