1、磷脂酶A2抑制劑對急性胰腺炎腸黏膜損傷的保護研究    【摘要】  目的 探討應用磷脂酶A2(PLA2)抑制劑對大鼠重癥急性胰腺炎(SAP) 時腸黏膜損傷的保護作用及其機制。方法 雄性Wistar大鼠36只，隨機分為3組(n=12)：假手術組(SO組)、SAP組、PLA2抑制劑治療組(抑制劑組)。胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉誘導SAP模型，治療組在造模后30min腹腔注射PLA2抑制劑S5920/LY315920Na(0.5mg/100g)。各組于術后12h點處死大鼠，觀察胰腺和腸黏膜組織病理學變化，檢測血清淀粉酶(AMY)、血清和腸黏膜組織中

2、sPLA2活性的變化，RT?PCR法檢測腸黏膜組織sPLA2 mRNA表達。結果 SAP組胰腺和腸黏膜組織病理改變明顯，血清AMY水平、IL?1含量、血清和腸組織sPLA2活性、sPLA2 mRNA表達水平均明顯高于SO組(P<0.05)。PLA2抑制劑治療組胰腺和腸黏膜組織病理損害程度較輕，上述指標均明顯低于SAP組(P<0.05)，但仍高于SO組(P<0.05)。結論 PLA2抑制劑可通過降低血清IL?1、抑制sPLA2 mRNA表達和下調血清及腸組織PLA2的活性等減輕SAP大鼠腸黏膜損傷。 【關鍵詞】  急性胰腺炎;磷脂酶A2抑制劑;腸黏膜損傷ABSTRAC

3、T：Objective To investigate the protective effects of phospholipase A2 inhibitor on severe acute pancreatitis(SAP)?associated intestinal mucosal injury in rats and its mechanism.Methods Thiry?six male Wistar rats were randomly divided into sham operation group (SO group),SAP group and phospholipase A

4、2 inhibitor treatment group (inhibitor group).SAP model was induced by retrograde infusion of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct,and the inhibitor group was injected intraperitoneally with phospholipid A2 inhibitor S5920/LY315920Na(0.5mg/100g) 30min afte SAP model.Rats in all group

5、s were executed at 12h after induction,the pathological changes of pancreas and intestinal mucosa were observed, and serum amylase,IL?1 contents and sPLA2 activity as well as sPLA2 activity in intestinal tissue were determined.The expression of sPLA2 mRNA in intestinal tissue was measured.Results In

6、 SAP group,the pathological changes of pancreas and intestinal mucosa were obvious,amylase,IL?1 contents in serum,sPLA2 activity in serum and intestinal tissue,and the expression of sPLA2 mRNA were significantly higher than those in SO group.The corresponding values in inhibitor group were lower tha

7、n SAP group(P<0.01), but were higher than SO group (P<0.01). Conclusion Phospholipase A2 inhibitor has protective effect on intestinal mucosal injury in SAP rats through down?regulating the expression of sPLA2 mRNA and decreasing IL?1 level and sPLA2 activity in serum and intestinal tissue.KEY

8、 WORDS：Acute pancreatitis;PhospholipaseA2 inhibitor;Intestinal mucosal injury 重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是臨床內科較為常見和棘手的一種危重疾病。SAP時常伴有腸道細菌移位、內毒素血癥和多系統器官功能不全(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，主要與腸壁組織的循環灌流不足和炎癥介質釋放所致的腸黏膜屏障功能受損有關1。磷脂酶A2(PLA2)是炎癥反應中的重要致傷因子，sPLA2作為PLA2最主要的亞型，能水解生物膜上的卵磷脂

9、而引起一系列炎癥介質的釋放26。本研究旨在探討sPLA2激活在?；悄懰徕c(STC)誘導大鼠SAP模型腸黏膜損傷中的致傷機制，并觀察PLA2抑制劑對其的保護作用。1 材料與方法1.1 材料與試劑STC購自美國Sigma公司，使用前無菌生理鹽水配置。特異性PLA2抑制劑(S5920/LY315920Na)購自Promega公司。sPLA2活性分析試劑盒檢測購自美國Cayman公司。白介素?1(IL?1) ELISA試劑盒購自武漢博士德公司。PCR和cDNA逆轉錄試劑盒購自MBI公司，TRIzol RNA抽提試劑、sPLA2、?actin引物均購自Invitrogen公司。1.2 方法1.2.1 實

10、驗分組和模型制備雄性Wistar大鼠36只，體質量200250g(咸寧學院實驗動物中心提供)，隨機分為3組(每組12只)：假手術組(SO組)、重癥急性胰腺炎組(SAP組)、PLA2抑制劑治療組(抑制劑組)。實驗前12h禁食不禁飲。SO組：以1%戊巴比妥鈉(0.6ml/100g)麻醉，嚴格無菌操作下行上腹正中切口，開腹后僅翻動十二指腸和胰腺即關腹;SAP組：5%STC溶液(0.1ml/100g)沿胰膽管逆行恒速(0.1ml/min)注射造模。抑制劑組：造模后30min，腹腔注射抑制劑S5920/LY315920Na 5mg/kg(液體總量為0.2ml/100g)。術后各組每只大鼠均皮下補液(2m

11、l/100g)。1.2.2 標本采集各組動物術后12h分批剖殺，下腔靜脈采血測定血清淀粉酶、IL?1含量和sPLA2活性。切取胰腺頭部和距回腸末端5cm處腸管組織約2cm，再切分為三部分，分別以10%甲醛固定用于組織病理學觀察，組織勻漿取上清液待測腸組織sPLA2活性，置于-80凍存待測sPLA2 mRNA表達。1.3 檢測指標1.3.1 血清指標檢測淀粉酶(AMY)采用本院檢驗科臨床使用的全自動生化分析儀測定;IL?1含量采用ELISA法測定，嚴格按照說明書規定步驟操作。1.3.2 sPLA2活性測定血清和腸組織勻漿上清液sPLA2活性測定嚴格按照sPLA2活性分析試劑盒說明進行，采用比色法

12、檢測。1.3.3 組織病理學觀察光鏡下觀察胰頭部胰腺組織和腸組織病理改變。腸黏膜損傷參照Chiu3分級標準，病理改變由輕到重分為0級到級。1.3.4 腸組織sPLA2 mRNA表達取100mg腸組織，異硫氰酸胍一步法抽提總RNA，按試劑盒說明合成第一鏈cDNA;取1l cDNA為模板用PCR試劑盒進行擴增。引物序列如下，sPLA2(309bp)上游：5'?GCTTCTACGGTTGCCATTGT?3'下游5'?AACTGGGCGTCTTCCCTTT ?3'?actin(207bp)上游5'?CCAACTGGGACGATATGGAG?3'，下游5&

13、#39;?CAGAG?GCATACAGGGACAAC?3' (Invitrogen公司設計合成)。反應條件：sPLA2為94變性30s，54退火30s，72延伸1min，共35個循環。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以sPLA2與?actin條帶光度的比值表示sPLA2 mRNA的表達水平。1.4 統計學處理采用SPSS13.0統計軟件進行分析處理， 數據以±s表示，多組間進行單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。2 結 果2.1 血清AMY和IL?1含量測定SAP組AMY和IL?1含量較SO組升高(P<0.05);抑制劑組治療后上述指標較SAP組降低(P&

14、lt;0.05)，但仍高于SO組(P<0.05)。(表1)2.2 血清和腸組織sPLA2活性測定SAP組血清和腸組織sPLA2活性較SO組升高，差異有顯著性(P<0.05);抑制劑組治療后血清和腸組織sPLA2活性較SAP組降低(P<0.05)，但仍高于SO組(P<0.05)。(表2)表1 3組大鼠血清AMY、IL?1含量比較與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，P<0.05表2 血清和腸組織sPLA2活性nmol/(min?L)、sPLA2 mRNA表達比較 與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，P<0.052.3 胰腺和腸黏膜

15、組織病理學檢查SO組胰腺和腸黏膜組織未見明顯病理改變。SAP組胰腺結構被破壞，腺泡水腫、出血、壞死明顯，大量炎癥細胞浸潤，病理改變明顯，抑制劑治療后上述病理損傷程度較SAP組明顯減輕。SAP組腸黏膜Gruenhagens腔形成，毛細血管充血、擴張、出血，固有層絨毛脫落甚至消失，腺體明顯受損，抑制劑組腸黏膜病理損傷情況明顯減輕。(表3)表3 各組腸黏膜損傷情況2.4 肺組織sPLA2 mRNA表達sPLA2 mRNA在SO組呈輕度表達;SAP組表達水平明顯升高，與SO組比較差異有統計學意義(P<0.05)。抑制劑組sPLA2 mRNA表達較SAP組降低(P<0.05)，但仍高于SO組

16、(P<0.05)。(表2)3 討 論質膜、細胞器的PLA2一般分為3種類型：分泌型(sPLA2)、胞質型(cPLA2)和Ca2+非依賴型，其中sPLA2是最主要的亞型。PLA2作為一種在細胞信號傳導中起“扳機”樣作用調控脂類介質產生、釋放的關鍵酶，其異常表達及血循環中的過度釋放可造成大量炎癥介質釋放與膜功能變化5, 6。PLA2及其代謝產物如前列腺素(PGI2)和血栓素(TXA2)均具有強烈的生物活性，廣泛參與各種細胞活動如信號轉導、炎癥過程等7。IL?1是一種強烈的炎癥細胞因子，除調節T細胞和B細胞介導的免疫功能外，還作用于中性粒細胞和血管內皮細胞并激活其他炎癥介質6,7。Mchowa

17、t等8研究認為炎癥反應過程產生的多種細胞因子如IL?1、TNF?撥戀瓤紗偈?PLA2激活，PLA2激活可誘導IL?1的產生，而IL?1又可刺激組織細胞內PLA2基因表達，兩者相互促進、關聯，從而導致細胞、組織損傷。本實驗表明，在SAP大鼠，胰腺和腸黏膜病理損傷較SO組明顯加重，血清AMY、IL?1和PLA2活性明顯升高，腸組織sPLA2活性和sPLA2 mRNA表達水平亦升高。因此，我們推測，SAP時IL?1等細胞因子促進sPLA2活化增加，并與其代謝物PGI2和TXA2等脂質介質發揮作用，產生氧自由基及脂質過氧化，導致組織血液動力學紊亂和微循環障礙，引起腸黏膜組織損傷，屏障功能降低。sPLA

18、2激活對腸黏膜細胞的損傷作用可能與以下因素2,4,9有關：可能通過代謝途徑產生大量脂類介質，加重腸黏膜微循環障礙;可能通過破壞細胞的脂質膜使細胞壞死而損傷組織;腸道黏膜屏障損傷導致細菌移位和內毒素血癥，進而使炎性細胞廣泛浸潤，促進IL?1、TNF?撥戀認赴?因子和一些粘附分子如ICAM?1等的過度表達，引發“瀑布樣級聯反應”。我們的實驗表明，應用特異性PLA2抑制劑S5920/LY315920Na能明顯下調SAP時血清IL?1含量、腸組織sPLA2 mRNA表達水平和sPLA2活性，并減輕胰腺和腸黏膜的病理損傷，達到了改善SAP腸黏膜損傷的目的。綜上所述，sPLA2激活和組織局部sPLA2含量

19、增加參與了STC誘導的SAP腸黏膜損傷的過程，IL?1在其中亦發揮了重要作用。但具體的作用機制還需更深入的研究。應用PLA2抑制劑對胰腺炎及其并發的腸黏膜損傷起到了保護作用，這為臨床治療急性胰腺炎腸黏膜損傷及改善預后提供了理論支持。【參考文獻】  1張建新,翟建國,程國祚,等.急性壞死性胰腺炎模型大鼠腸血流量及血清磷脂酶A2、白介素?1的變化J.基礎醫學與臨床,2003，23(5):5562Tariq M,Elfaki I,Khan HA,et al.Bromophenacyl bromide,a phospholipase A2 inhibitor attenuates chemi

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