1、廣佛手rDNA ITS序列測定及特點的初步分析(1)作者：高曉霞，陳曉穎，羅源生【關鍵詞】 佛手；,香櫞；,rDNA,ITS序列摘要：目的分析廣佛手及其近緣種香櫞的rDNA ITS序列及其規律。方法采用PCR直接測序技術測定廣佛手和香櫞rDNA ITS序列并作序列變異分析。結果4個植物樣品rDNA ITS序列長度為644672 bp。其中5.8S rDNA 長度為165 bp，編碼區較保守。廣佛手和香櫞的ITS1和ITS2序列平均遺傳距離分別為0.009 5和0.014 2。結論rDNA ITS序列可為鑒定佛手提供分子參照系統。 關鍵詞：佛手； 香櫞； rDNA ITS序列Abstract:O

2、bjectiveThe ribosomal DNA internao transcribed spacers(ITS)and 5.8S rDNA ITS sequence of Citrus medica L.var.sarcodactylis(Nootc).Swingle and C.medicaL. were sequenced.MethodsThe rDNA ITS gene fragment was amplified by PCR with universal primers of rDNA ITS and sequenced.ResultsThe DNA sequence of I

3、TS ranged from 644 bp to 672 bp and the 5.8S gene of all of the samples was 165 bp in size.Distance values of ITS1 and ITS2 sequence,estimated according to Kimura two-parameter models between Citrus medicaL.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle and its adulterant and C.medica L.,were 0.0095 and 0.0142,res

4、pectively.ConclusionrDNA ITS sequence may be the evidence for the molecular authentication of Citrus medica L.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle.Key words:Citrus medica L.var.sarcodactyis(Noot.) Swingle; C.medica L.; rDNA internal transcribed spacers sequence DNA 分子標記技術進入到中藥材鑒定和品質評價等研究領域，提供了大量的潛在特征，在中藥

5、材近緣屬間，屬內以及種內居群間的差異性研究1中得到了廣泛應用。作為18S26S rDNA 組成部分，rDNA 中的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer ,ITS）序列是中度保守的重復序列，在被子植物較低的分類階元上具長度保守性和核苷酸序列的高度變異性2，這使得這些間隔區的序列可以用rDNA基因的通用引物實現快速擴增、容易排序，而高度變異性可以提供豐富的變異位點和信息位點，在許多被子植物發育和進化研究中已證明是十分有用的分子標記35。佛手是蕓香科柑橘屬植物Citrus medica L.var.sarcodactylis(Noot.) Swingle成熟果實6。其

6、性味辛、苦、酸、溫，具有理氣健胃、鎮嘔祛痰之功，治療胸腹脹滿、消化不良、咳嗽、痞滿等癥，為我國傳統中藥。佛手醇提物對大鼠、兔離體腸管有明顯解痙作用；能顯著增加豚鼠離體心臟的冠脈流量和提高小鼠的耐缺氧能力7。廣佛手主產于廣東德慶、高要、云浮、郁南、化州等地，栽培歷史悠久，為廣東地道藥材“十大廣藥”。在商品流通領域同屬植物香櫞C.medica L.8也混作佛手使用，其品質呈現較大差異。為充分利用佛手這一地道藥材資源，更好地控制其質量，本文測定了廣佛手及其近緣種香櫞的rDNA ITS序列。通過探討上述品種間的DNA序列變異關系及其規律，為佛手基原植物的準確鑒定提供分子依據。1 材料和方法1.1 材料

7、來自廣州市的新鮮植物材料由廣州省中藥研究所華南中藥種質資源庫提供；來自廣東化州地區的新鮮植物材料由本文第三作者采集，并由廣東藥學院中藥鑒定教研室鑒定。見表1。表1 廣佛手和香櫞rDNA ITS序列特征及在EMBL的注冊登記號（略）1.2 試劑CTAB（gene）,ExTag DNA聚合酶（Mg2 ，15 mmol/L）（TaKaRa），瓊脂糖（Promega）,PCR產物純化試劑盒（QIAGEN），10 mM dNTP(Sangon)。1.3 主要儀器臺式高速離心機（Sigma），渦旋混合儀（IKA WORKS），PE480 PCR擴增儀（PE），恒壓恒流電泳儀（Life Technologi

8、es ），凝膠成像儀（Kodak EDAS120），全自動測序儀（Perkin Elmer377）。1.4 總DNA的提取和純化新鮮植物葉片，參照Rodrigues組織培養表面消毒的9方法處理后各0.1 g，加液氮研磨成細粉后，使用改良的CTAB法提取總DNA10，于-20保存備用。1.5 目的基因片斷的PCR擴增、產物純化和測序為了保證測序的準確性，本文設計了3套引物，包括擴增rDNA ITS全長（18Sp48,26Se37）、ITS1（18Sp48,5Sp15r）和ITS2（5Sf31,26Se37）的引物。上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。18Sp48：5AGAAGTCGTAAC

9、AAGGTTTCCGTAGG3;26Se37：5TTCTCCGCTTATTGATATGC3;5Sp15r：5GATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTG3;5Sf31：5GCATCGATGAAGAACGCAGC3;PCR分別擴增上述3個目的片斷，20 l反應體系中含10Buffer 2 l 10 mmol/L dNTP 0.5 l，25 mmol/L Mg2 2.4 l,10 mmol/L正向引物和逆向引物各1 l，DMSO 1 l，ExTaq(5U/l)0.1 l，DNA模板（適宜濃度）2 l，滅菌三蒸水（3 d H2O）10 l。PCR擴增條件為94變性4 min，941 min，5

10、02 min，722 min，循環30次；70延伸10 min，以3 dH2O代替模板DNA作空白對照。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。PCR產物經QIAquick PCR純化試劑合純化后，由英駿廣州測序實驗室（英駿生物技術有限公司）測序。為保證測序的準確性，PCR擴增獲得的3個目的片斷分別采用正向和反向測序，用MegAlign程序進行序列的拼接。1.6 序列分析所得序列用CLUSTAL X（Version 1.8）進行多重比對11，編輯和校正多重比對結果用BioEdit(Version 5.0.9)12;ITS1和ITS2的位置參照其二級結構,EMBL和GenBank上的參考序列。采用PAUP4.0（版本4.0b8）程序13，使用Kimura two-parameter（K2P）14模型構建序列距離矩陣，將序列鑒定結果與形態鑒定結果核對，確認后在EMBL登記注冊，其注冊登記號見表1。2 結果本研究共測得廣佛手和香櫞的片段包括ITS1，5.8S和ITS2全長序列以及18S，26S部分序列，長度為676700 bp。根據蕓香科植物Murraya paniculata已報道的序列資料（GenBank AJ879085）確定rDNA內轉錄間隔區ITS1和ITS2與3個編碼區18S，5.8S和26S的界限。從圖1中可見，5.8S全長為165 bp，編碼區