1、    新的腎上腺腦白質營養不良基因突變1例的鑒定(1)    】 目的： 對1例腎上腺腦白質營養不良（ALD）患者及其家系成員的ALD基因的突變類型進行鑒定. 方法： 以外周血RNA為模板，采用長鏈RTPCR技術，分4個片段擴增ALD基因mRNA的編碼序列，對4個PCR產物進行直接測序，篩查整個基因編碼區. 通過限制性內切酶酶切分析患者及其家系成員基因組ALD基因片段，以進一步確證所發現的基因突變. 結果： 位于患者ALD基因第6外顯子的第508位密碼子存在一個新的錯義突變CCCCTC (P508L)，患者母親為

2、突變攜帶者，患者父親和妹妹不存在此突變. 結論： 發現中國ALD患者一個新的ALD基因突變，即P508L突變.【關鍵詞】 腎上腺白質營養不良；ALD基因；突變，誤義；ALD蛋白0引言腎上腺腦白質營養不良(ALD, adrenoleukodystrophy)是最常見的一種遺傳性中樞神經髓鞘合成病變1. 致病基因（ALD基因）位于X染色體，編碼一個有745個氨基酸殘基的過氧化物酶體膜蛋白，即ALD蛋白（ALD protein, ALDP）. 我們對1例腎上腺腦白質營養不良患兒及其家庭成員的ALD基因突變進行了分析.1對象和方法11對象男，7歲，漢族，福建省周寧縣人，因進行性視力下降、步態不穩1 a

3、余入院. 檢查：神志清楚，對答尚切題，言語含糊，不配合，雙眼視力光感，吞咽困難，飲水嗆咳. 心、肺、肝、脾未見異常. 腦電圖中度異常，體感誘發電位異常. 顱腦MRI示枕頂部蝶形長T1和長T2信號的病灶. 氣相色譜查患者血漿24碳飽和脂肪酸（C240）濃度：13.48 mgL-1, 22碳飽和脂肪酸（C220）濃度：9.05 mgL-1，兩個濃度比（C240/C220）等于1.49(正常范圍0.939左右). 患者非近親婚配所生，另有一妹妹，無家族史. 臨床診斷：腎上腺腦白質營養不良（兒童腦型）.12方法ALD基因的mRNA長3.7 kb，其中編碼區為2238 bp. 本研究合成4對引物2，即：

4、PIF和RT1, PF和RT2, PF和RT3, PF和RT4，分4段（自5端依次為ALD1, ALD2, ALD3, ALD4）對ALD基因編碼區進行擴增，預期大小分別是722, 700, 723和646 bp，其中ALD1的3端和ALD2的5端部分重疊，ALD2的3端和ALD3的5端部分重疊，ALD3的3端和ALD4的5端部分重疊. 若以PIF和RT4為引物對擴增ALD基因cDNA， 預期片段大小是2440 bp. 引物委托上海生工（Sangon）生物工程公司合成.121長鏈RTPCR及測序從患者取新鮮抗凝血1.53 mL，按Qiagen產品（RNeasy Mini Kit）說明書提取總R

5、NA. 長鏈RTPCR按TaKaRa試劑盒（RNA LA PCRTM Kit）說明書進行. 先進行反轉錄，然后在PE2400型熱循環儀上進行PCR反應：94變性2 min后，按94 30 s, 60 30 s, 72 2 min循環30次. 最后一個循環結束后繼續在72延伸8 min. 將上述PCR混合物1020 L上樣于15 gL-1的瓊脂糖凝膠電泳，切下含預期片段（2440 bp）的膠塊，利用Qiagen的DNA凝膠回收試劑盒（QIAquick Gel Extraction kit）從膠塊中回收DNA. 以此DNA為模板，組配4個2次PCR反應：反應體積50 L，含模板1 ng, 引物各2

6、5 pmol, 4種dNTP各0.2 mmolL-1, Taq酶（BioAsia）2.5 U, MgCl2 1.5 mmolL-1，分別擴增ALD1, ALD2, ALD3, ALD4，擴增條件統一為：94預變性2 min后，按94 30 s, 50 30 s, 72 60 s進行1015個循環，最后一個循環結束后繼續在72延伸9 min. 用Qiagen的PCR產物純化試劑盒（QIAquick PCR Purification Kit）直接從PCR混合液中純化PCR產物. 將純化的4個片段連同相應PCR引物，寄上海博亞生物技術有限公司進行序列測定.122基因組DNA片段擴增和限制性內切酶分析

7、患者及其家庭成員的外周血基因組DNA使用Qiagen的DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit）提取. 根據突變所在部位，用Omiga 2.0軟件設計針對外顯子6全長序列的PCR引物，上游引物(PA5F)序列為：5CTGCGCTCTCTGGCGTCA3，下游引物（PA5R）序列為：5CACAGCCCGTCTCTGGCT3，預期擴增片段長330 bp. 擴增條件：95預變性4 min后，按94 30 s, 55 30 s, 72 30 s進行30個循環. 用Qiagen的PCR產物純化試劑盒（QIAquick PCR Purification Kit）從PCR混合液中

8、純化PCR產物. 根據突變的性質，用限制性內切酶BspLI（MBI Fermentas）對純化的PCR產物進行酶切, 于100 gL-1聚丙烯酰胺凝膠上電泳, 溴化乙啶染色后用美國BioRad公司的FluorS型凝膠成像儀采集電泳結果.    2結果21ALD基因mRNA的RTPCR擴增及測序用長鏈RTPCR試劑盒對患者外周血ALD基因mRNA的整個編碼區進行擴增，可獲得預期的擴增片段（2440 bp），也可見一些非特異性片段. 為提高特異性，并獲得足夠的PCR產物，先從凝膠中回收上述覆蓋整個編碼區的擴增產物，然后分4段（ALD1, ALD2, ALD3

9、, ALD4）進行第2輪PCR反應. 2次PCR產物的瓊脂糖凝膠（15 gL-1）電泳結果(Fig 1)，14依次是ALD4, ALD3, ALD2和ALD1，4個片段均獲得特異性擴增，其大小與預期完全相符. 直接用Qiagen試劑盒從2次PCR混合物中純化ALD1, ALD2, ALD3, ALD4 4個片段后，用美國ABI公司的BigDye系統（在377型測序儀上）分別對其進行序列測定. 正常對照(Fig 2A)和患者(Fig 2B)ALD3片段部分序列， 序列下劃線處示發生突變的密碼子部位. 結果顯示，患者ALD基因mRNA僅有一個堿基發生改變（1523CT），即第508個密碼子（位于A

10、LD3片段上）發生了CCCCTC的改變，使正常的脯氨酸被亮氨酸替換. 正、反向測序結果一致.            作者：蘭風華楊渤生盧愛薇黃梁滸朱忠勇 【關鍵詞】腎上腺白質營養不良Identification of a novel mutation         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業用途或者抄襲，僅供參考學習之用

11、，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。圖1-圖2 (略)22限制性內切酶分析以患者及其家庭成員的基因組DNA為模板，擴增突變所在的ALD基因第6外顯子，擴增片段330 bp. 正常情況下，該片段內含有2個BspLI酶切位點（GGNNCC），酶切后產生72, 34和224 bp 3個片段. 患者第508密碼子的CCCCTC突變導致72與34 bp片段之間的酶切位點消失，酶切結果產生106和224 bp 2個片段. 酶切后的電泳結果(Fig 3)，可以看出：患者父親和妹妹的酶切模式為正常人模式（含72, 34和224 bp 3個片段），患者的酶切模式與預期相符（含106和224 b

12、p兩個片段），患者母親的酶切圖譜中既有106和224 bp兩個片段，也有72和34 bp兩個片段，為雜合子（攜帶者）. 以上結果還經過對330 bp片段的直接序列測定證實.圖3患者及其家庭成員ALD基因外顯子6擴增產物的酶切分析(略)    3討論本患者6歲起病，以進行性視力下降等中樞神經系統癥狀為主，病程進展迅速（1 a內發展成雙目失明），頭部MRI查出典型的大腦頂枕部長T1和長T2信號病灶，血漿極長鏈飽和脂肪酸濃度升高（C240/C220比值超出參考范圍），符合兒童大腦型ALD的臨床診斷1.ALD表現出高度的遺傳異質性. 根據有關國際權威數據庫（ww

13、w.xald.nl）統計，目前在全球ALD患者中已鑒定出500多個ALD基因突變（其中有一部分未發表，僅在互聯網上公布）， 其中有一半以上僅見于單一家系. 本病在臨床表現方面（表現型）也是高度異質的，同一家族的不同患者在起病時間和臨床癥狀上也往往不盡相同3. 表現型的異質性說明開展臨床基因診斷的必性，但遺傳的高度異質性又使臨床基因診斷的開展面臨較大困難.我們曾報道在中國ALD患者發現的第1個基因突變2,4，本例P508L突變是在中國人群發現的第2個ALD基因突變. 查閱國內外文獻，尚未見有關此突變的報道. 以下幾點支持該突變是病理性突變的觀點： 患者的ALD基因的整個編碼區只存在一個堿基改變（

14、1523CT），其余部分與正常對照的序列和GenBank參考序列（NM000033）一致； 患者父親和妹妹的ALD基因不存在該突變，其母親為攜帶者，與ALD作為X染色體隱性遺傳病的特點符合； 突變使ALDP的第508位氨基酸由Pro變成另一個與之性質差別較大的Leu； 突變所改變的氨基酸位于ALDP功能區ATP結合區保守序列內5； 1999年Takano等曾報道在緊鄰的第507位氨基酸發生的一個突變，即G507V3. 該突變具體如何影響ALDP的結構和功能，有待進一步研究.以往ALD基因的突變分析在技術上大多采用常規RTPCR方法：先合成cDNA，然后分段對cDNA進行擴增6. 我們將新開發的

15、長鏈RTPCR技術引入ALD基因的突變分析中：先擴增ALD基因mRNA編碼區全長，然后分段進行2次PCR擴增. 該技術途徑簡化了操作，提高了重復性，減少了引物數. 該技術途徑在本研究的成功應用，將為今后其他患者的基因診斷帶來便利.【參考文獻】1 Tang BS, Li HY. Progress in the study of Xlinked adrenoleukodystrophy J. Guowai Yixue Shenjingbingxue Shenjingwaikexue Fence (Foreign Med Sci Sect Neurol Neurosur), 2001;28(3):1

16、85-188.2 Wu YB, Wu YS, Yang BS, Lan FH. Mutational analysis of a Chinese patient with Xlinked adrenoleukodystrophy J. Shanghai Yixue Jianyan Zazhi (Shanghai J Med Lab Sci), 2002; 18(2):69-72.3 Takano H, Koike R, Onodera O, Sasaki R, Tsuji S. Mutational analysis and genotypephenotype correlation of 2

17、9 unrelated Japanese patients with Xlinked adrenoleukodystrophy J. Arch Neurol, 1999; 56 (3): 295-300.4 Lan FH. Molecular diagnostics in China J. Clin Chem Lab Med, 2001; 39(12):1190-1194.5 Roerig P, Mayerhofer P, Holzinger A, Gürtner J. Characterization and functional analysis of the nucleotide binding fold in human peroxisomal ATP bindi