1、白藜蘆醇對肝癌Bel擬7404細胞增殖、凋亡及侵襲的影響（作者：單位：郵編：）【摘要】 目的研究白藜蘆醇對肝癌Bel擬7404細胞增殖、凋亡及侵 襲的影響。方法MTT法和增殖細胞核抗原（PCNA測定法檢測白藜蘆醇 對Bel擬7404細胞增殖的影響；流式細胞術和TdT酶介導的dUTP缺 口末端標記法檢測白藜蘆醇對 Bel擬7404細胞凋亡的影響；黏附實 驗、運動實驗和侵襲實驗檢測白藜蘆醇對Bel擬.7404細胞侵襲能力的影響。結果白藜蘆醇濃度25卩mol/L可抑制肝癌細胞Bel擬7404 增殖,并誘導凋亡（P0.01）;濃度100卩mol/L正常肝細胞L02的增殖 也受到抑制，并產生凋亡（P0.

2、01）。25,50卩mol/L的白藜蘆醇可抑制 Bel擬7404細胞黏附細胞外基質纖連蛋白（FN）及降解基質的能力 （P0.01）,對該細胞的運動能力無明顯抑制作用。結論一定濃度的白藜蘆醇可抑制肝癌Bel擬7404細胞增殖，誘導其凋亡，并可能通過抑制 Bel擬7404細胞與細胞外基質FN的黏附及對基質的降解來抑制 Bel 擬7404細胞的侵襲能力；在較高濃度下（ 100卩mol/L）,白藜蘆醇 對正常肝細胞株也產生抑制增殖和誘導凋亡的毒性作用。【關鍵詞】藜蘆生物堿類癌肝細胞肝腫瘤細胞增殖細胞凋亡 腫瘤侵潤自從葡萄酒中發現白藜蘆醇以來，人們陸續發現它具有保護心 肌細胞、改善微循環、抑制血小板聚集

3、、抗內毒素休克、降血脂、抗 脂質過氧化、鎮咳、平喘、抗病原微生物及抗老年癡呆等眾多生理功 能。近年來又發現白藜蘆醇具有抗腫瘤功能，表現為對某些腫瘤的起 始、促進、進展3個階段均有抑制作用1。白藜蘆醇并非對所有腫 瘤都有抑制作用，而且其抗腫瘤機制目前尚不明確。肝癌為我國最常 見的惡性腫瘤之一，是重要的抗腫瘤研究對象。筆者從腫瘤細胞增殖、 凋亡及侵襲方面探討白藜蘆醇的抗肝癌細胞株機制，以及對正常肝細 胞的毒性作用。1材料與方法1.1材料肝癌細胞Bel擬7404及正常肝細胞L02均由福建省肝膽外 科研究所提供；白藜蘆醇由福建師范大學生物工程學院提純生產（純 度約99.8%）;RPMI 1640和DM

4、EM培養基（美國Gibco公司）;噻唑藍 （thiazolylblue,MTT）、胰蛋白酶（北京華美生物科技有限公司）;PCNA 試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）;TUNEL試劑盒（美國Premega公司）;Transwell 小室（美國Corning公司）;纖連蛋白（FN） 和基底膜基質凝膠Matrigel（美國BD公司）。1.2細胞培養肝癌細胞 Bel擬7404在含10%、牛血清的RPMI 1640 中、L02在含10%、牛血清的DMEM中培養，當細胞生長達到80%融和 時,取處于對數生長期的細胞用于實驗。實驗均分為2組;對照組不加 白藜蘆醇,處理組中加入不同濃度的白藜蘆醇。1.3細

5、胞增殖測定（1）用0.25%胰蛋白酶將細胞消化制成 2X 105 mL 擬1單細胞懸液，按每孔100卩L接種于96孔板,處理組白藜蘆醇終 濃度分別為 12.5,25,50,100,200卩 mol/L,分別在 12,24,48 h 各取 1塊板,換不含血清的培養液每孔100卩L,各孔中加 MTT 10卩L（5mg/mL），孵育 4 h,加入 MTT裂解液（10%SDS,5異丁醇,0.012 mmol/L HCL）100卩L,37 C孵育18 h后，酶標儀（Bio擬Rad 550型，美國Bio 擬Rad公司）測取D（550 nm）的光密度值，取4孔平均值。該值反映活 細胞數目，即細胞增殖程度。（

6、2）制備2X 105 mL擬1單細胞懸液，接 種于置于6孔板中的玻片上，處理組白藜蘆醇終濃度分別為 12.5,25,50,100,200 卩mol/L。選擇48 h作為終止時間,按試劑盒說 明書進行。以已知PCNA陽性的乳腺癌細胞作為陽性對照，以PBS代替 一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察，計算PCNA標記指數，即計數1 000 個腫瘤細胞中PCNA陽性細胞的百分率。1.4細胞凋亡測定（1）細胞經過同步化后，即無血清培養24 h,再加入 10%血清及不同濃度白藜蘆醇（12.5,25,50,100,200 卩mol/L）培養48 h。收集懸浮細胞及貼壁細胞，經2 000 r/min 離心5 min

7、,沉淀重懸 于PBS 1 mL,400目篩網過濾，取細胞懸（COULTER EPICS XI型,美國 Beckman Coulter公司）488 nm激發,605 nm檢測，每次檢測104個細 胞。用MultyCycle軟件進行DNA含量和細胞凋亡率分析，DNA含量低 于G1期二倍體DNA勺細胞為亞二倍體細胞。（2）按PCNA僉測方法接 種細胞，選擇3個濃度白藜蘆醇（25,50,100卩mol/L）作用細胞48 h。 按TUNE試劑盒說明書進行，以DNasel處理腫瘤細胞作為陽性對照。 顯微鏡下隨機計數200個細胞,計算陽性細胞比率。1.5細胞侵襲檢測1.5.1 細胞黏附試驗（MTT法）取96

8、孔培養板，每孔加入FN 20卩 L（100 mg/L）,風干后置4 C備用，用PBS洗 2次重新水化。2X 105 mL 擬1濃度的Bel擬7404細胞懸液加入96孔細胞培養板上，每孔100卩 L,處理組白藜蘆醇終濃度分別為12.5,25,50卩mol/L,每組復3孔。 置37 C、體積分數為0.05的CO2培養箱內，分別于30,60,90 min 后，棄去上清液,PBS沖洗2次除去未黏附細胞。黏附細胞用 MTT法在 酶標儀上測定D（550 nm）值,并計算黏附抑制率：黏附抑制率=（對照組黏附細胞D值擬處理組黏附細胞D值）/對照組 黏附細胞D值1.5.2細胞運動實驗在Tran swell小室濾

9、膜的下室面鋪上FN 10卩 L（0.2 mg/mL）,超凈工作臺中風干備用。取 1X 106 mL-1 BeI擬7404 細胞懸液（培養基為0.1% BSA的RPMI 1640）,處理組Transwell小室 的上室中加入白藜蘆醇（終濃度分別為12.5,25,50卩mol/L的細胞 懸液100卩L）,下室分別加入用上述培養基制成白藜蘆醇溶液600卩L,終濃度與上室相同，各組均復3孔。37 C、體積分數為0.05的 CO2中培養12 h后取出濾膜，甲醇固定,棉簽拭去上室面的細胞，常規 蘇木精擬伊紅（H擬E）染色。隨機于顯微鏡下取上、下、左、右、中 心5個視野,計數穿膜細胞數。以該細胞數目表示腫瘤

10、細胞的運動能 力。1.5.3體外侵襲實驗使用運動實驗中的 Tran swell小室,濾膜的下室 面鋪上FN并風干后，在小室上室面均勻鋪上1 : 3 RPMI 1640稀釋的 Matrigel,置37 C培養箱30 min使之凝固，其他步驟同1.5.2，以計 數穿膜細胞數目來反映腫瘤細胞降解 Matrigel的能力。1.6統計學處理數據采用SPSS 11.5統計軟件包進行分析，各組間比 較采用雙側t檢驗。2結果2.1對細胞增殖的影響2.1.1MTT法作用48 h后,25卩mol/L白藜蘆醇可抑制 Bel擬7404細胞增殖（P0.01）,且對Bel擬,7404細胞的抑制程度隨時間延長、齊 量增加呈

11、加大趨勢，白藜蘆醇達到較高濃度（100卩mol/L和200卩 mol/L）時，正常肝細胞L02和Bel擬7404細胞的生長均受到抑制 （P0.01,表 1）。2.1.2PCNA法計數結果與MTT法檢測結果基本吻合（表2）。白藜蘆醇濃度25卩mol/L時,可抑制Bel擬7404細胞的增殖（P0.01）;濃度100 卩mol/L時,正常肝細胞L02亦受到抑制（P0.01,圖1）。2.2對細胞凋亡的影響2.2.1流式細胞術50卩mol/L白藜蘆醇作用下，Bel擬7404細胞出現明顯的亞二倍體峰（圖2）,L02細胞則沒有。而100,200卩mol/L處 理組,2種細胞均出現了明顯的亞二倍體峰。2.2.

12、2TUNEL法在50卩mol/L白藜蘆醇作用下，Bel擬7404細胞數目 減少，出現凋亡細胞（P0.01）;100 卩mol/L時丄02細胞也出現凋亡 （P0.01,圖3）,計數結果見表3。表1白藜蘆醇不同作用時間對Bel擬 7404細胞和L02細胞增殖的影響表中數據為 MTT法檢測的不同時間 段增殖細胞的D（550 nm）值.與對照組比較，:P0.05 ,:P0.01.表中數據為計數1 000個Bel擬7404細胞中PCNAB性細胞的百分率 （%）.與對照組比較，:P0.05 , :P0.01.2.3對肝癌Bel擬7404細胞侵襲的影響黏附試驗：隨作用時間的延 長,25,50卩mol/L的白

13、藜蘆醇表3TUNEL法檢測白藜蘆醇對 L02及 Bel擬7404細胞凋亡的影響表中數據為 TUNEL法檢測的陽性細胞百 分比（%）.與對照組比較，:P0.01.對Bel擬.7404細胞的黏附細胞外基質FN能力均有明顯的抑制（P0.05,表4）,且抑制程度隨濃度增大而遞增；12.5卩mol/L無明顯 抑制作用（P0.05）。運動試驗：各種濃度的白藜蘆醇處理12 h對Bel 擬7404細胞的運動能力均無明顯的抑制作用（表5）。侵襲試驗:25,50 卩mol/L白藜蘆醇對Bel擬,7404細胞的降解細胞外基質的能力均有 明顯的抑制（P0.05,表5）,12.5卩mol/L的白藜蘆醇無明顯抑制作用 （

14、P0.05）。3討論白藜蘆醇是一種來源于虎杖、葡萄等常見植物、具有眾多生理藥理功能的天然藥物。近年來的研究表明，白藜蘆醇通過多種途徑對多種 腫瘤細胞（包括肝癌）有顯著抑制作用2。本研究顯示，一定濃度的白 藜蘆醇可抑制肝癌Bel擬7404細胞增殖、誘導細胞凋亡，從而顯著抑 制Bel擬7404細胞的生長。有報道稱，白藜蘆醇可明顯抑制HL擬,60白血病細胞生長，而不影響 正常外周血液淋巴細胞3。小鼠口服較高劑量的白藜蘆醇,4周后檢 測各項血液生化指標，表4白藜蘆醇對Bel擬7404細胞黏附纖連蛋 白能力的影響表中數據為 MTT法檢測的不同時間段黏附細胞的 D(550 nm)值.與對照組比較，:P0.

15、05, :P0.01.表5白藜蘆醇對 Bel 擬7404運動能力及侵襲能力的影響表中數據為運動實驗及侵襲實驗 中穿膜細胞數目.與對照組比較，:P0.01均未發現異常改變4。國內研究顯示，白藜蘆醇能誘導膽囊癌 GBC 細胞凋亡而抑制其生長與增殖，但對正常成纖維細胞3T3細胞無此作 用5，提示白藜蘆醇可能對腫瘤細胞有選擇性抑制作用，而對正常細 胞無影響。本實驗發現，當白藜蘆醇濃度較高時，不僅對肝癌細胞有顯 著的抑制增殖和誘導凋亡作用，對正常肝細胞也產生類似的作用，特 別在200卩mol/L白藜蘆醇的作用下，肺癌細胞株和正常肝細胞株均 受到顯著抑制，生長極為緩慢，顯微鏡下可見大量漂浮細胞和凋亡細 胞

16、。當濃度較低時，白藜蘆醇對正常細胞無影響，對肝癌細胞仍有抑制 生長作用。因此可認為，在一定濃度范圍內，白藜蘆醇是一種低毒的肝 癌細胞抑制藥物；而超過這個濃度后，它對正常細胞也表現為抑制增 殖、誘導凋亡的毒性作用，并非如前述國內外研究所認為的對正常細 胞沒有影響3,6。腫瘤的侵襲和轉移極為復雜，從分子水平可大致分成3個過程:腫瘤細胞通過受體結合與胞外基質中的FN和層黏連蛋白（LN）相黏附;腫瘤細胞沿著趨化劑的濃度梯度遷移；腫瘤細胞釋放各種水解酶類，溶 解、破壞其黏附部位的組織,使腫瘤細胞得以通過缺損游出而向遠處 轉移5。通過設置前述的黏附、運動、侵襲3項實驗，可以在體外模 擬這幾個過程，觀察腫瘤

17、細胞的侵襲能力。本研究發現，濃度較高的白 藜蘆醇（100卩mol/L）作用于肝癌細胞時,12 h即可抑制細胞生長，而 50卩mol/L白藜蘆醇至少需作用24 h才具有抑制瘤細胞增殖的作用， 筆者在對白藜蘆醇抑制肝癌細胞侵襲的研究中采用12.5,25,50卩mol/L 3種較低濃度的白藜蘆醇，作用肝癌細胞12 h,旨在反映白藜蘆 醇在不抑制細胞增殖的低濃度情況下是否具有抗侵襲作用。結果表明, 白藜蘆醇能顯著抑制肝癌細胞與細胞外基質FN的黏附及對細胞外基質降解的能力，而對肝癌細胞的運動能力無明顯抑制作用，提示白藜 蘆醇可能通過抑制腫瘤細胞與細胞外基質FN的黏附及降解基質能力兩個環節發揮其抗腫瘤侵襲

18、的作用。有文獻報道，白藜蘆醇可通過抑制MM擬9 mRNA勺表達抑制MM擬9的活性，而MM朝9正是一種具 有降解基底膜基質功能的酶，與腫瘤的侵襲密切相關7。本研究中白 藜蘆醇所顯示的抑制肝癌細胞降解基質的作用是否與mM、9有關，尚待進一步探討。【參考文獻】1Jang M,Cai L,Udeani GO,et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol,a n atural product derived from grapesJ. Scienee, 1997,275（5297）:218 擬 220.2Notas G,Nifli A P,Kampa M,et al. Resveratrol exertsits antiproliferativeeffect on HepG2hepatocellular careinomacells,by in due ing cell cycle arrest,a nd NOS activati onJ.Biochim Biophys Acta, 2006,1760(11):1657 擬 1666.3ClementM V,Hirpara J L,Chawdhury S H,et al.