1、放射性核素在生物和醫學中的應用 第一節 放射自顯影技術 第二節 放射免疫測定法 第三節 放射性示蹤技術 第四節 放射性探針的合成 第五節 分子雜交 第一節 放射自顯影技術 放射自顯影技術是利用放射性核素衰變時發射的射線對乳膠的感光作用，在乳膠底片上現出影像，以顯示標本或樣品中的放射性物質的分布、定位和定量的方法。 分子克隆圖放射自顯影技術的優缺點： 1、 能準確示蹤定位。顯示形態與功能的定位關系。 2、 能在整體平面上同時比較，注入體內后的標記物質在各個臟器內的分布與代謝狀態，分析在各臟器中的攝取量，在不同時期的吸收、分布、轉運與排泄途徑等動態關系。 3、 是細胞內物質代謝研究的有力工具。 、

2、 缺點是對某一位置上的放射性一般只能相對定量。 用于放射自顯影的感光材料（是由鹵化銀和明膠所組成的乳膠 ） 感光材料特點 鹵素離子與銀離子按一定規律、一定距離排列，形成一立方形的晶體點陣。 具有理想晶體結構的鹵化銀晶體對光線和核射線的作用不靈敏 。 采用不同配方和制作工藝，使鹵化銀晶體出現晶體缺陷（不是完全規則的六面體立方結晶，而呈如三角形、圓形等）。 導致晶體內部的電荷不平衡 。電荷不平衡之處對相反的電荷形成陷阱（亦稱敏化中心）。陷阱對提高乳膠的靈敏度，起著重要的作用。 主要采用的感光材料有： 原子核乳膠：原子核乳膠是自顯影中較理想的感光材料。它的銀鹽顆粒直徑在0.20.5m，密度大（101

3、3銀顆粒/平方厘米），分辨率高。主要用于微觀放射自顯影。 X光片：X光片兩面都涂有保護層，防止乳膠層被劃傷，其乳膠銀顆粒較大，平均直徑為2.53m，密度較?。?109銀顆粒/立方厘米）。 氚片：氚片銀粒的平均直徑是1m，單面沒有保護層，因為保護層將吸收90%以上的發射的粒子。其余性能與X光片類似。 選擇乳膠一般從敏感度和分辨率兩方面來考慮。 質量好的乳膠，顆粒細、密度大、敏感度低，則分辨力高。 反之銀鹽的顆粒愈大，敏感度愈大，分辨力也愈差。 劑量與曝光 ： 放射性劑量給予的大小、曝光時間的長短與放射自顯影乳膠底片影像效果好壞有很大關系。 在一個實驗中如何選取兩者的大小，人們在實際實驗中有很多經

4、驗。如：分不同的時間取片等。也有人推薦下面公式：設： L 為單位面積上衰變的放射性強度 為單位時間上開始曝光時的放射性強度(Ci/cm2) t為單位時間上終了曝光時的放射性強度(Ci/cm2) t 為曝光時間, T 為半衰期 tAAL0則TeAAtt693. 0,0因為LAATt00ln693. 0所以乳膠感光原理 （1） （2） （3） （4） （1）核射線 與乳膠作用時，電離產生的電子； （2）電子向敏化中心移動，形成一陰電層； （3）銀離子向陰電層聚集，與此同時銀離子被還原成銀原子； （4）銀原子在敏化中心周圍集中而形成潛影。 這些潛影將在顯影過程中起著重要地催化作用。因而也稱為“顯影中

5、心”。 注意： 已經建立起來的潛影，在水、氧作用下會消退（這個現象的實質是溴化銀晶體中所產生的極少量的銀原子又退變成離子返回晶格），而失去原來的催化作用。 所以在“曝光”期間應注意干燥、低溫和隔氧。 顯影、停影和定影 顯影和顯影液 （顯影劑、促進劑、保護劑和抑制劑組成 停影和停影液 定影和定影液 （定影液一般包括：定影劑、保護劑、停顯劑和堅膜劑 ） 水洗和干燥 光膠片顯影液配方水（50）（ml）800米圖爾（g）2.2無水亞硫酸鈉（g）72海得爾（g）8.8無水碳酸鈉（g）48溴化鉀（g）4加水至總量（ml）1000常用停影液配方是：醋酸，加水至。 酸性堅膜定影液的配方溶液一 海波（硫代硫酸鈉

6、）240g蒸餾水（）500ml溶液二蒸餾水（）150ml無水亞硫酸鈉15g醋酸（冰醋酸份，加水份）48ml鉀明礬15g 加水總量至： 1000ml按上面試劑的順序分別配置溶液一、二，然后把溶液二加到溶液一中，并劇烈攪拌。 自顯影的閱讀與相對定量 （1）光密度法（根據自顯影中影像的黑化程度來確定組織中放射性核素相對量的方法） 同時制備一套已知放射性強度標準樣品和待測樣品在完全相同的情況下進行放射自顯影。用光密度計測量出標準和待測樣品的黑化強度，再比較定出相對含量。 （）顆粒數量計算法（也稱：微尺目數法） 它是利用目鏡微尺在顯微鏡視野下圈定一定范圍（如50平方微米），進行射線顆粒數量計數。推算出單

7、位面積或細胞、細胞核的相對標記強度。 （）徑跡數量計算法 這是計算由射線粒子在膠片上所形成的徑跡的數量來測定組織和細胞中放射性核素相對含量的方法。計數方法與上述的顆粒計數法相同。求出單位面積內的徑跡數。 第二節 放射免疫測定法 這是一種超微量分析技術，具有靈敏度高和特異性強的突出優點。 這類方法名稱繁多，常見的名稱有：放射免疫測定法、免疫放射測定法、競爭性蛋白質結合測定法、放射受體測定法、放射酶測定法、體外放射分析法等。 此方法的建立和發展，給醫學生物學的一個重要分支內分泌學帶來了革命。 本方法的創始人榮獲了1977年諾貝爾生理學和醫學獎。 基本原理 利用放射性標記抗原(Ag*)、待測抗原(A

8、g)與特異性的抗體(Ab)競爭結合。 在一個放免實驗里(Ag*)和(Ab)的量需保持恒定，Ag與Ag*之和大于Ab上有效結合位點數目。 此時，Ag與Ag*-Ag間存在著函數關系 AgAgAg *AbAgAg*Ag 抗原抗體BFB/FB/B+F 4/2=24/6=67% 3/3=13/6=50% 2/4=0.52/6=33% 1/5=0.21/6=17% 游離的Ag*結合的Ag*-Ag-2024681012141618200.10.20.30.40.50.60.7B%Content of Standard antigen標準競爭抑制曲線基本步驟： 放射免疫分析目的：檢測待測樣品中抗原（Ag）的量

9、。 如上圖加樣。是標準樣品；管；是非特異性管；待測管可是若干個待測樣品。 室溫放置或保溫一定時間 。 加入二抗（管不加，室溫放置或保溫，使二抗與抗原-抗體復合物充分結合成分子量很大的復合物； 3500-5000轉/分離心（ T管不離心），去上清（抗原抗體的復合物沉淀，）； 探測器測cpm值。利用公式計算B%： 標準管 0 1 2 3 4 5 6 Ag* 1ul 1ul 1ul 1ul 1ul 1ul 1ul Ag 0 10 20 40 80 160 200 Ab 1 1 1 1 1 1 1待測管 1ul ?血清 1 NSB1ul 1ul 0 40 0 0）本底（）（）（標準管cpmdpmTcp

10、mcpmB)(%以已知的標準抗原含量（ng/ml）為橫坐標，B%為縱坐標做標準曲線。-2024681012141618200.10.20.30.40.50.60.7B%Content of Standard antigen標準競爭抑制曲線待測樣品的測量，先與標準樣品一樣，計算出B%，再在標準曲線上查出待測樣品的抗原含量。 對于抗原、抗體的制備，劉兢老師的免疫學課中會做介紹。 在這不作介紹了。第三節 放射性示蹤技術 示蹤即為在研究對象中引入一標記物作為探針，通過觀察探針的去向，了解其分布、運動及轉化的情況。 放射性示蹤的基本依據是：（1）可測性，因為放射性核素總是自發發射各種射線。（2）放射性核

11、素與其同種非放射性核素理化性質基本相同，一般生物體不區別對待它們。 放射性示蹤的特點：靈敏度高、操作簡便、合乎生理條件、可解決其他方法不能解決的難題、準確定位。標記化合物來源少、技術操作要求高、輕元素的同位素效應、放射效應。例：檸檬酸HOCCOOHH2CC*OOHH2CCOOH 酶 2HCC*OOHHCH H2CCOOHO酮戊二酸 KMnO4COHH2CCOOHHCH O+ C*O2 琥珀酸檸檬酸脫羧機制的確定 示蹤實驗的設計及步驟： 1、根據實驗目的和實驗周期長短，選擇合適的放射性核素及其標記化合物。 (1) 合適放射性核素的選擇, (2) 合適標記化合物的選擇： 2、示蹤劑的用量，根據實驗

12、周期長短，示蹤劑的給予方式的不同（如：喂養、靜脈注射、呼吸等）,被示蹤生物對示蹤劑的利用率和在體內分布及排泄情況，確定。 3、選擇合適的輻射防護條件和廢物處理方法, 對于操作復雜的實驗，需先做空白實驗。 4、根據實驗的要求及示蹤劑射線類型，選擇合適的樣品測量方法。 （包括：定量測量、定位測量、定性測量 5、對放射性測量結果進行數據處理，并根據實驗要求計算、書寫出一定的數據形式。 放射性核素稀釋分析法（放射性核素稀釋法又稱為載體法或俘獲技術）。 此分析法的特點：可以對含有多種性質相近成分的混合物中某一化合物進行定量分析。 正稀釋法：分析計算混合物中某一化合物的含量（）。 具體方法如下：（1）在混

13、合物中加入一定量（）的已知放射性比活度（）的與待測化合物相同的放射性核素或標記化合物；（2）充分均勻混合；（3）分離純化待測化合物，直至恒定比活度（）； 根據放射性被加入混合物前后，雖比活度發生了變化，但放射性總強度沒變 ，可由下列方程式成立。 反稀釋法：分析計算混合物中某一放射性標記化合物的含量（）。 具體方法如下：（1）取一定量的待測混合物進行分離純化，直至恒定放射性比活度，探測器測得該活度為；（2）在混合物中加入大量的與待測標記化合物相同的非標記化合物，已知加入量為；（3）充分混合，并分離純化，直至恒定放射性比活度，探測器測得該活度為； 同理，有下列方程成立。SWWSWx000100SS

14、WWxxxWWSWS0000WSSSWx放射性探針的制備 雙鏈探針的合成法: 單鏈探針的合成法:切口平移法用隨機寡核苷酸引物合成均一標記的DNA探針合成可與克隆于噬菌體或M13噬菌體載體上的序列互補的放射性標記DNA。將克隆于特定載體上的靶序列轉錄成放射性的RNA，在此載體上帶有可被噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶識別的sp6啟動子。切口平移法 混合下列成分:10切口平移緩沖液 2.5ul；模板 0.5ug；未標記的三種20nmol/L 的dNTP各 ul ；一種 dNTP ul；加水至終體積為21.5ul，使混合液驟冷至。 加入2.5ul胰酶(10mg/ml，用1切口平移緩沖液配制，振蕩均勻

15、。 加入E.coil DNA聚合酶 2.5單位 16 溫育60min 加入25ul 100mmol/L EDTA 終止反應。 將反應混合物上柱（Sephadex G50)，用緩沖液洗脫，分管收集，測cpm值，合并第一個cpm峰（探針，第二個cpm峰為dNTP 。 標記水平的計算：32P-dNTP利用率*DNA(dpm/g)=DNA重量第一個峰總計數(cpm)本底探測器的探測效率第一個峰總計數本底(cpm)第一,第二峰總計數（cpm)100%3，OH缺口（胰DNA酶I作用） 缺口向3，端移動大腸桿菌DNA聚合酶I5，-3，聚合酶活性用隨機寡核苷酸引物合成均一標記的DNA探針 首先需要純化所需制備

16、探針的目的DNA（200ug）并與過量的隨機引物（75ug）混合 將混合液沒入沸水中煮3min。 到時取出后，迅速沒入冰水中1 min。 取出，并移入已配置好的（如下）混合液中。（20mmol/L DTT1ul;dGTP,dCTP,dTTP的混合液，濃度各5mmol/L 1ul ; 10RP 緩沖液 0.67ul; -32P-dATP（比活度3000Ci/mmol）3ul;H2O 1ul) 加5各單位（約1ul）的大腸桿菌聚合酶I Klenow片段，混合 室溫下溫育至少3小時。 在反應液中加入10ul A 緩沖液。 隨機引物可由以下三種途徑得到：1、用DNA酶I消化小牛胸腺DNA或鮭精DNA產

17、生大量長為612核苷酸的單鏈DNA。2、直接從一些廠家購買用小牛胸腺DNA制備的隨機引物。3、在自動DNA合成儀上合成，這種合成引物也可在公司買到。單鏈探針的制備 由DNA模板體外制備單鏈探針有以下兩種方法： （1）合成可與克隆于噬菌體或M13噬菌體載體上的靶序列互補的放射性標記DNA。 （2）將克隆于特定載體上的靶序列轉錄成放射性的RNA，在此載體上帶有可被噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶識別的啟動子。 這兩種方法都可以產生比活度極高且長度固定的探針。但第一種方法需用物理手段把新合成的放射性標記DNA與互補的未標記模板分開（例如：根據片段大小選用變性聚丙烯酰胺凝膠或堿性瓊脂糖凝膠電泳、堿性柱

18、層吸等）。而第二種方法中，DNA模板更容易用不含RNA酶的DNA酶I除去。 也可以以RNA為模板制備單鏈探針。這時合成cDNA的引物可以用寡脫氧胸苷酸（oligo(dT)）或隨機序列的寡核苷酸。 cDNA探針合成的主要思路：1、選擇適當的引物。2、選擇適當的RNA模板。3、在有dNTP（其中一種是放射性dNTP*）存在下，利用依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）催化合成cDNA*放射性探針。以寡核苷酸作為引物合成與單鏈RNA互補的總cDNA探針為例 在1無菌的EP管中+3ul（無RNA酶）水+1ugRNA模板，混勻。 70加熱5分鐘，并馬上放在冰上驟冷。 加入：胎盤RNA酶抑制物 20單位；

19、 引物（2.5mg/ml）（隨機序列的八核苷酸）5ul。10隨機引物緩沖液 2.5ul；dGTP, dTTP, dATP各 20mmol/L的混合液1ul； 120umol/L. 120umol/L.dCTP-32P(比活度3000Ci/mmol) 10ul；Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶（200000單位/毫升）0.5ul；加水至25ul,輕搖混勻。 37溫育1小時。 加入0.5mol/L NaOH,68溫育30min,水解RNA。 待溶液溫度降到室溫后，加入10ul 1mol/L Tris.Cl(PH7.4),再加入3ul 2 mol/L HCl。 通過酚氯仿抽提純化cDNA* 分離c

20、DNA* 和dCTP*（可用Sephadex G50,也可用乙醇選擇性沉淀）。 cDNA*產率的測定：取三張Whatman圓濾紙，剪成能放進液閃瓶大小。 CA、B 用5%三氯醋酸，0.5% 焦磷酸鈉抽洗兩次，再用95%乙醇10ml抽洗，涼干。（為了除去dCTP*）。將A、B、吹干，測計數。A、空白對照（本底）B、cDNA*計數（cpm/ul）C、cDNA*+ dCTP*計數（cpm/ul） AA在中心滴1ul反應前溶液BB在中心滴1ul反應后溶液C在中心滴1ul反應后溶液cDNA* 合成量（ug）=（B-A）/CdNTP(四種）質量(ng) 電 泳帶 電物質在電場中向其相反電極泳動的現象稱為電泳。 DNA的泳動率與MW的關系 分子雜交 分子雜交是基因工程和分子生物學的重要技術之一。是鑒別陽性重組子、篩選基因、確定的同源性、研究基因定