1、第 15 講基因工程及克隆技術考試要求1.工具酶的發現和基因工程的誕生(/a)。2.基因工程的原理和技術(/b)。3. 基因工程的應用(/a)。4.提出生活中的疑難問題， 設計用基因工程技術解決的方案(/c)o5. 植物的克隆(/b)o6.動物的克隆(/a)o|真題感悟|1.(2018 浙江 4 月選考)回答與基因工程和植物克隆有關的問題：(1) 將含某抗蟲基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體PBI121 均用限制性核酸內切酶EcoRI酶切，在切口處形成 _。選取含抗蟲基因的DNA 片段與切割后的 pBI121用 DNA 連接酶連接，在兩個片段相鄰處形成 _，獲得重組質粒。(2) 已知用 Ca

2、CL 處理細菌，會改變其某些生理狀態。取CaCL 處理過的農桿菌與重組質粒在離心管內進行混合等操作，使重組質粒進入農桿菌，完成_ 實驗。在離心管中加入液體培養基，置于搖床慢速培養一段時間，其目的是從而表達卡那霉素抗性基因，并大量增殖。(3)_取田間不同品種水稻的幼胚，先進行，然后接種到培養基中培養，幼胚發生_形成愈傷組織，并進行繼代培養。用含重組質粒的農桿菌侵染愈傷組織，再培養愈 傷組織，以便獲得抗蟲的轉基因水稻。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有：培養條件如光溫、培養基配方如植物激素配比、以及躬勺(答出 2 點即可)。解析(1)構建重組質粒時限制性核酸內切酶EcoRI剪切得到的是粘性末端

3、，DNA 連接酶連接兩個 DNA 片段之間形成的是磷酸二酯鍵。目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法。用 Ca2+處理細菌以增加細菌細胞壁的通透性，讓其處于感受態細胞，以利于重組質粒導入。(3)不同種類植物或同種植物的不同基因型個體之間存在遺傳的差異，細胞全能性的表達程度大小不同，小麥水稻等作物在多次繼代培養后，會喪失細胞全能性的表達能力。2答案(1)粘性末端磷酸二酯鍵轉化 使 CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態(3)消毒脫分化水稻的基因型、愈傷組織繼代的次數2.(2017 浙江 11 月選考)回答與植物克隆和動物克隆有關的問題：(1)利用植物愈傷組織獲得再生植株主要有兩條途徑：一是由愈

4、傷組織的細胞先分化產生芽和根后再形成一個完整植株的 _途徑，二是由愈傷組織細胞產生胚狀體后再萌發形成完整植株的胚胎發生途徑。另外也可不通過愈傷組織階段而直接采用帶腋芽的莖段培養成叢 狀苗，再誘導生根獲得再生植株，其原因是腋芽中存在利用植物克隆培育新品種，一方面可利用帶有目的基因的 _ 侵染植株，或將目的基因通過_ 的方法導入植物細胞、組織或器官獲得轉基因植株，另一方面利用異源植株的_ 進行融合產生雜種植株， 或利用異源植物在試管內進行 _ ，對其產生的胚進行培養產生雜種植株。(3)下列屬于植物克隆和動物克隆共有的培養方法是 _。A.懸浮培養、器官培養B.貼壁培養、傳代培養C.器官培養、愈傷組織

5、培養D.原生質體培養、傳代培養解析(1)外植體經脫分化后形成愈傷組織，由愈傷組織形成再生植株主要有兩條途徑：一 是由愈傷組織的細胞先分化產生芽和根后再形成一個完整植株是植物組織培養的器官發生 途徑， 二是由愈傷組織的細胞產生胚狀體后再萌發成完整植株是植物組織培養的胚胎發生途 徑。 不通過愈傷組織階段而直接采用帶腋芽的莖段培養成叢狀苗，這說明腋芽中含有分生組織，而分生組織中含較高的細胞分裂素，細胞分裂素與生長素之比較高可促進芽的生長。(2) 將目的基因導入植物細胞，可以用含有目的基因的農桿菌直接侵染，或者用顯微注射法7導入；用異源植物可以利用植物體細胞雜交技術或者受精之后的胚胎進行培養，也可以獲

6、得雜種植株。(3) 貼壁生長是動物細胞培養時的特性；愈傷組織是指植物細胞在組織培養過程中形成的一種排列疏松而無規則的無定形狀態、高度液泡化的薄壁細胞，動物細胞無愈傷組織培養；傳代培養應用于動物細胞培養過程中。答案(1)器官發生分生組織(2)農桿菌顯微注射原生質體受精(3)A33.(2016 浙江 10 月選考節選)某小組欲進行煙草原生質體分離與培養的研究。請回答：(1)原生質體的分離： 在無菌條件下，取煙草無菌苗的葉片，放入含有0.5mol/L 甘露醇(維持較高滲透壓)的_ 混合液處理，經過離心純化后獲得原生質體。(2) 原生質體的培養：將原生質體進行培養，重新長出細胞壁，形成胚性細胞。此時，

7、應該培養基中甘露醇濃度， 以利于胚性細胞繼續培養形成細胞團， 然后經兩條途徑形成 再生植株。途徑一：細胞團經球形胚、 _ 和胚狀體，最后發育成植株。途徑二：細胞團增殖為愈傷組織， 然后在發芽培養基上誘導出芽， 切割芽經過生根后形成完整植株。 上述 發芽培養基中含量相對較高的激素是 _，胚性細胞的主要特點是 _(A. 液泡小、細胞核小B.液泡大，細胞核大C.液泡大，細胞核小D.液泡小、細胞核大)。(3) 為了對煙草的某些性狀進行改良，分離兩種煙草的原生質體后，通過 _ 方法將他們的遺傳物質組合在一起，經培養獲得具有新性狀的再生植株。提取再生植株的DNA，采用 _擴增相關基因，來鑒定遺傳物質是否成

8、功重組。解析 (1) 去除植物細胞壁，獲得植物細胞的原生質體，常用的方法是利用纖維素酶和果膠 酶處理植物細胞。 (2) 在獲取原生質體時甘露醇是作為維持細胞膜內外滲透壓平衡的穩定劑 使用的。其具體作用是提高滲透壓， 防止水分滲入細胞內部， 造成細胞破裂。在原生質體形 成新細胞壁后，有細胞壁支持與保護作用，所以要稀釋甘露醇的濃度；從胚性細胞T細胞團T球形胚T心形胚T胚狀體，然后再生出完整的小植株；為快速誘導芽的分化， 培養基中往往添加細胞分裂素；胚性細胞的特點是液泡小、細胞核大。(4) 植物細胞工程中，利用原生質體融合的方法獲得雜種細胞；體外擴增DNA 技術常用的是多聚酶鏈式反應，即PCR 技術

9、。答案 (1) 纖維素酶和果膠酶 (2) 稀釋 ( 降低 ) 心形胚 細胞分裂素 D (3) 原生質體融 合 PCR4.(2016 浙江 4 月選考節選)兔肝細胞中的基因 E 編碼代謝甲醛的酶，擬利用基因工程技術 將基因E 轉入矮牽牛中，以提高矮牽牛對甲醛的代謝能力。請回答：(1) 從兔肝細胞中提取 mRNA 在_酶的作用下形成互補的 DNA 然后以此 DNA 為模板擴增得到基因 E。在相關酶的作用下，將基因 E 與 Ti 質粒連接在一起，形成 _，再導入用氯化鈣處理的 _ ，浸染矮牽牛葉片。 將被浸染的葉片除菌后進行培養， 最終得到轉基因矮牽牛。其中培養過程正確的是 _ (A. 葉片在含合適

10、濃度生長素的培養基上分化形成愈傷組織 B. 愈傷組織在含細胞分裂素和生長素配比較高的培養基上形成芽4C.再生的芽在細胞分裂素含量高的培養基上生根D.愈傷組織在含合適濃度植物生長調節劑的培養基上脫分化形成再生植株 )。(2) 取轉基因矮牽牛葉片，放入含 MS 夜體培養基和適量濃度甲醛且密封的試管中。將試管置于_ 上，進行液體懸浮培養。一段時間后測定培養基中甲醛的含量，以判斷基因E5是否在轉基因矮牽牛中正常表達。培養過程中液體培養基的作用：一是提供營養；二是_，從而使葉片保持正常的形態。解析（1）以 mRNA 為模板合成 DNA 勺過程為逆轉錄過程，這一過程需要在逆轉錄酶的催化下 進行。獲得目的基

11、因后，需在限制性核酸內切酶和 DNA 連接酶的作用下， 將目的基因與運載 體（Ti 質粒）連接形成重組質粒（重組 DNA 分子），再將其導入受體細胞。將目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法，先將重組 DNA 導入經氯化鈣處理的農桿菌，再用導入目的基因的農桿菌感染植物細胞， 最終實現將目的基因導入植物細胞內。導入目的基因的植物細胞經組織培養過程形成轉基因植物。 組織培養過程中，葉片在含適宜濃度的生長素的培養基上脫分 化形成愈傷組織，然后在含細胞分裂素和生長素配比較高的培養基上形成芽，繼而在生長素含量高的培養基上生根，最后形成完整的植株，愈傷組織形成植株的過程中發生細胞的分化。（2）植物組織培養過

12、程中，將愈傷組織等細胞置于搖床上，進行液體懸浮培養，形成多個分散的細胞。培養過程中培養液一方面為植物細胞提供營養，另一方面維持一定的滲透壓，從而使葉片保持正常的形態。答案（1）逆轉錄重組 DNA 分子農桿菌 B （2）搖床維持滲透壓2 1.正誤判斷（1）基因工程的載體有質粒、 入噬菌體、動植物病毒，其中物細胞內。（X）構建重組 DNA 分子時必須使用同種限制性核酸內切酶切割目的基因和載體 的基因和載體 DNA 的兩端形成相同的粘性末端。（X）（3）轉入了人胰島素原基因的大腸桿菌，可以合成出具有生物活性的胰島素。（X）（4）轉基因技術育種克服了傳統育種的育種時間長、遠緣親本難以雜交的缺陷。（V）

13、（5）植物克隆的技術基礎是植物的細胞和組織培養，其理論基礎是植物細胞的全能性。（V）動物克隆的技術基礎是動物的細胞和組織培養，其理論基礎是動物細胞的全能性。（X）（7）細胞克隆的要求必須保證分離出來的細胞是一個或多個分離的細胞。（V）（8）細胞系是泛指可傳代的細胞， 細胞株是具有特殊性質的細胞系。（V）入噬菌體可將外源基因載入動DNA 以在目62.讀圖析圖（1）的構建需要_ 酶參與。（2）T過程依據的原理是 _，關鍵步驟包括_ （3）要確定抗蟲基因導入植物細胞后，是否賦予了植物抗蟲特性，在個體水平上還需要做_實驗；若要檢測具有抗蟲基因的棉花是否產生了相應毒蛋白，在分子水平上可利用_方法進行檢測

14、。提示（1）限制性核酸內切酶和 DNA 連接（2）植物細胞的全能性脫分化、再分化（3）抗蟲接種抗原一抗體雜交|考點憲圖：訓考I】找觀吟考點 1 基因工程的工具1.已知一雙鏈 DNA 分子，用限制性核酸內切酶I切割得到長度為40 kb 和 80 kb 兩個片段；同時用限制性核酸內切酶I10 kb、80 kb 和 30 kb 3 個片段。據此分析該雙鏈DNA解析 根據題意，該 DNA 用限制性核酸內切酶I切割后得1 條片段，故為環狀 DNA 根據兩酶的作用結果，可知酶切圖譜為Db答案 D2.某一質粒載體如圖所示， 外源 DNA 插入Amp或Tet中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨 芐青霉素抗性

15、基因，Tetr表示四環素抗性基因）。有人將此質粒載體用BarHI 酶切后，與用BarHl酶切獲得的目的基因混合，加入 DNA 連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化120 kb（kb :千堿基對）片段；用限制性核酸內切酶n切割得到和限制性核酸內切酶n切割時，得到分子結構及酶切位點情況為（I形戰翠E _T】質粒合抗蛀用的DMA7大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化， 有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答下列問題:并且 _和 _的細胞也是不能區分的， 其原因是_A .。在上述篩選的基礎上， 若要篩選含有插入了目的基

16、因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使I用含有的固體培養基。解析未轉化的和僅含環狀目的基因的細胞都不能在含有氨芐青霉素的培養基上生長，故這兩種不可區分。含有質粒載體和含有插入了目的基因的重組質粒的細胞在含有氨芐青霉素的培養基上都能生長， 這兩種也不可區分。 因目的基因插入位點在四環素抗性基因上， 四環素 抗性基因被破壞，在獲得的單個菌落中各挑取少許分別接種到含有四環素的培養基上，不能生長的為要篩選的菌落，即含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。要篩選的菌答案二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均不生長含有質粒載體 含有重組質粒二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均能生長四環素O歸

17、納概括質粒上的抗生素抗性基因的作用用作基因工程載體的質粒一般含有一些抗生素抗性基因（如青霉素抗性基因、四環素抗性基因等），供重組 DNA 分子的鑒定和篩選。通常情況下，受體細胞自身沒有抵抗相關抗生素的能力，當含有抗生素抗性基因的質粒與目的基因構建形成的重組DNA 分子導入受體細胞后，如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選,在上述四種大腸桿菌細胞中,環狀目的基因的細胞是不能區分的未被轉化的和僅含其原/iffmH I昆副莊點8抗生素抗性基因在受體細胞中表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，從而在受體細胞的培養基中加入該種抗生素，就可以淘汰未導入重組DNA 分子的受體細胞，保留導入了重組DNA9分子的受

18、體細胞。考點 2 基因工程的原理、技術和應用3.（2018 嘉興 3 月選考測試）絲素蛋白是家蠶的一種分泌性復合蛋白，由絲素蛋白重鏈（FibH）、絲素蛋白輕鏈（Fibl）和 P25 糖蛋白組成。將 Fibl 基因導入大腸桿菌（不含質粒 A）并實現表達的過程如圖所示。（i）構建重組質粒時要用到的工具酶是 _（2）導入時，為了增加大腸桿菌的通透性，常用 _ 處理大腸桿菌。接種在含氨芐青霉素培養基上的大腸桿菌，有的不能形成菌落，原因是（4）影印接種就是用絲絨做成與平板大小相近的印章，然后把長有菌落的母平板倒置在絲絨印章上，輕輕印一下，再把此印章在新的培養基平板上輕輕印一下。經培養后，比較新平板上長出

19、的菌落與母平板上的菌落位置，推測可能導入了重組質粒的菌落是_ （用字母表示）。（5）_ 目的基因成功表達的標志是 _ 。解析 重組質粒的構建過程：通常先用相同的限制性核酸內切酶分別切割目的基因和質粒，然后用 DNA 連接酶將目的基因和質粒連接。將重組質粒導入大腸桿菌時，因成功率問題，大腸桿菌有四種可能：導入了重組質粒（可在含氨芐青霉素培養基上生長，但不能在含四環素培養基上生長）、導入了質粒（既能在含氨芐青霉素培養基上生長，也能在含四環素培養基上生長）、導入了環狀目的基因或未轉化（既不能在含氨芐青霉素培養基上生長，也不能在含四環素培養基上生長）。答案（1）限制性核酸內切酶和DNA 連接酶（2）氯

20、化鈣（3）沒有導入質粒或重組質粒（4）b、c （5）大腸桿菌合成絲素蛋白輕鏈（Fibl）MX業tu碗村含虬*當毒*培禪早匕住舍兇環#皓捍卑上生眩購歯帶.護蠟一丄程曲104.人血清蛋白（HSA）具有重要的醫用價值。下圖是以基因工程技術獲取重組HSA（rHSA）的兩條途徑。（1）如果 HSA 基因序列未知，可以采用 _ 的方法獲取該目的基因，為了使目11的基因能夠在宿主細胞中復制和穩定保存，通常要先構建 _后才能導入宿主細胞。(2)方框中的“？” 一般選用的生物是 _，為了提高n過程的導入成功率，通常用_處理大腸桿菌。(3)人體合成的初始 HSA 多肽，需要經過膜系統加工形成正確的空間結構才能有活

21、性，所以選擇_ 途徑(填I或n)獲取 rHSA 更有優勢。(4)為了鑒定宿主細胞中是否產生rHSA,可以用_方法來進行檢驗。A.檢驗 HSA 基因是否導入B.檢驗細胞中是否產生相應的 mRNAC.抗原一抗體雜交D.檢測是否有標記基因解析 若目的基因序列已知，可用化學方法合成目的基因或用PCR 技術擴增目的基因；若目的基因序列未知， 可從基因文庫中獲取。 目的基因不能夠直接導入受體細胞，而是必須與載體構建重組 DNA 分子后再導入，以使目的基因能夠在宿主細胞中復制和穩定保存。(2)如果受體細胞是植物細胞，一般選用農桿菌轉化法導入目的基因；為增加大腸桿菌細胞壁的通透性，利于目的基因導入，需用氯化鈣

22、處理大腸桿菌。(3)大腸桿菌屬于原核生物，細胞(一內缺少內質網、高爾基體，無法對合成的初始 HSA 多肽進行加工。(4)rHSA 是一種抗原蛋白,可以利用相應的抗體進行檢測。答案從基因文庫中提取DNA 分子農桿菌氯化鈣(3)I(4)C。歸納槪括 ,基因工程操作的“五步曲”TL(1)獲取目的基因若目的基因的序列已知，可用化學方法合成或用PCR 擴增；若目的基因的序列未知,可從基因文庫中分離。(2)形成重組 DNA 分子通常是用相同的限制性核酸內切酶分別切割目的基因和載體DNA 形成相同粘性末端，然后用 DNA 連接酶將目的基因和載體 DNA 連接形成重組 DNA 分子(如下圖)。但在實際操作中，

23、 可形成 3 種不同的連接物：目的基因一載體連接物、 載體一載體連接物、 目的基因一目的基因連接物。1213因為同種限制性核酸內切酶切割目的基因和載體DNA 所得粘性末端全部相同，在 DNA1 接用兩種不同的限制性核酸內切酶切割目的基因和質粒(如下圖)。(3)將重組 DNA 分子導入受體細胞受體細胞植物細胞動物細胞或原生質體微生物常用方法農桿菌轉化法顯微注射技術CaCb 處理法轉化過程目的基因插入 Ti 質粒的 TDNA 上T導入農桿菌T侵染植物細胞T目的 基因穩定維持和表達將重組 DNA 分子提純T顯微注射入受體細胞T培養、發育T獲得具有新 性狀的生物CaCb 處理增大細胞壁通 透性T重組

24、DNA 分子與 處理后的受體細胞混合T重組 DNA分子進入受 體細胞篩選含有目的基因的受體細胞篩選原因：并不是所有的細胞都接納了重組DNA 分子，還有部分細胞接納了載體一載體連接物、目的基因一目的基因連接物，甚至有的細胞既沒有接納重組 DNA 分子，也沒有接納載體一載體連接物、目的基因一目的基因連接物。篩選方法：主要是利用載體上的抗生素抗性基因的作用借助一定方法(如影印接種)用選擇(5)目的基因的表達酶的作用下，目的基因和載體 DNA 貝 V 可任意連接。 為了使目的基因與質粒能定向連接，可使培養基篩選。14若目的基因成功表達，則轉基因生物細胞中會產生相應的蛋白質（可用抗原一抗體法檢測）,轉基

25、因生物會表現相應的性狀（如可接種病原體觀察轉基因生物的抗性）。考點 3 結合植物的克隆考查科學實踐能力5.下面是關于植物克隆的問題。請回答：（1）為培育能高效吸收和富集重金屬鎘的轉基因植物，將野外采得的某植物幼葉消毒后，用酶混合液處理，獲得了原生質體。酶混合液中含有適宜濃度的甘露醇，其作用是-。（2）_ 將目的基因導入到原生質體，經培養形成愈傷組織，再通過 _ 得到分散的胚性細胞，發育成_，生長發育后獲得轉基因植株。/*（3）愈傷組織繼代次數過多會喪失細胞全能性的表達能力，下列原因錯誤的是_。A. 愈傷組織發生染色體畸變B. 愈傷組織不能分散成單細胞C. 愈傷組織中激素平衡發生改變ID. 愈傷

26、組織對外源激素敏感性發生改變解析（1）甘露醇可以維持溶液的滲透壓，以防止失去細胞壁的原生質體吸水脹破。（2）將愈傷組織放在搖床上，通過液體懸浮培養可以得到分散的單細胞，這些單細胞具有細胞質豐富、液泡小、細胞核大等胚性細胞的特征，胚性細胞發育成胚狀體，進一步形成植株。（3）在長期的培養過程中，愈傷組織可能發生染色體畸變、內部激素平衡改變、對外源激素敏感性改變等變化，而喪失細胞全能性的表達能力。答案（1）維持滲透壓 （2）液體懸浮培養 胚狀體 （3）B6.植物葉肉細胞原生質體的分離和培養的主要過程可用下圖所示圖解簡單表示，請據圖回答下列問題：15純枷勺雌質體I時基中杠更亟胚狀體16（1）_ 培育胚

27、狀體利用了這一項生物技術，胚狀體再繼續培養，則可培育出完整的植株，這體現了植物細胞的 _ 。（2）要獲得植物葉肉細胞的原生質體，_ 需要在_ 溶液環境下，用酶和_酶去除細胞壁。（3）_ 培養基中除了含有一定的營養外， 還必須含有 _ 等植物激素，還需要對培養基進行嚴格的_ 。如果愈傷組織是三七葉肉細胞培養產生的，為了獲得三七的次生代謝產物，則只需要培養到_ 。如果愈傷組織是棉花葉肉細胞培養產生的，通過基因工程要獲取抗蟲棉，重組 DNA 分子導入棉花愈傷組織細胞常用的方法是 _法。（5）從葉片的葉肉細胞到獲得胚狀體的過程中，必須要經過_ （不定項選擇：A.有絲分裂 B.減數分裂C.原生質體融合D

28、.脫分化 E.再分化）。解析（1）離體植物細胞通過脫分化形成愈傷組織，通過再分化形成具有根和芽的胚狀體，再通過細胞分裂、分化發育成一個完整的植株。該技術稱為植物組織培養，其原理為植物細 胞的全能性。（2）制備葉片原生質體的酶混合液中，一般含較高濃度的甘露醇，其目的是避 免制備的原生質體吸水脹破；根據酶的專一性，去除植物細胞壁需用纖維素酶和果膠酶。（3）培養基的成分包括水、無機鹽、維生素、氨基酸、蔗糖、植物激素（生長素和細胞分裂素等）等；培養基要求進行嚴格的滅菌。（4）三七的細胞產物為細胞的代謝產物，將三七葉肉細胞培養到愈傷組織即可；目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法。（5）離體葉肉細胞培養到

29、胚狀體的過程中必須經過脫分化和有絲分裂形成愈傷組織，再分化和有絲分裂形成胚狀體。答案（1）植物組織培養全能性 （2）0.50.6 mol/L 的甘露醇纖維素果膠（3）細胞分裂素、生長素滅菌（4）愈傷組織農桿菌轉化 （5）ADEO 特別提醒植物細胞培養、器官培養和原生質體培養統稱為植物組織培養，最終都能得到完整植株，但由于培養目的不同，有時需對愈傷組織進行特殊處理。它們之間的關系如圖所示：離休細織股井化愈飭細筑！我體耗評培斥1718考點 4 動物的克隆7.（2018 浙江“超級全能生”聯考）如圖表示動物細胞克隆和制備單克隆抗體的相關過程,請回答相關問題:臨唏謚血干細胞、晦肪1-亠細胞.骨細胞等1

30、-甲細胞.-乙緲胞廠單肛隆抗體一兩狐胞（i）過程常應用_方法導入重組誘導基因后得到干細胞；部分干細胞經過誘導可分化成全身的不同組織或器官，說明這些細胞具有 _ 性。該過程利用了甲細胞具有的 _ 能力，甲和乙細胞可經過生物誘導劑 _的作用形成丙細胞。取一個丙細胞，放在含大量失去 _ 的小鼠成纖維細胞的特定培養體系中培養，最后產生大量的細胞群，這種方法為 _ 法。八（3）下列關于經和過程得到單克隆抗體的敘述，錯誤的是（）A. 該過程應用了細胞膜具有流動性的原理A .B. 丙細胞要具有分泌多種抗體的能力C. 該過程應用了動物細胞融合和動物細胞培養技術D. 丙細胞的形成先通過篩選得到雜交瘤細胞，再進行

31、抗體檢驗答案（1）顯微注射發育全能（2）連續增殖（滅活的）仙臺病毒 增殖力克隆培養（3）B8.（2018 金麗衢十二校聯考）生物技術已經滲入到了我們生活的方方面面。請回答下列有關動物細胞培養的相關問題：Ay（1）_動物細胞培養的原理是 _ ，需要將培養瓶放入培養。（2）_培養過程中需要用胰蛋白酶消化組織中的。（3）_傳代培養得到的細胞系往往具有核型。關于細胞系和細胞株下列說法錯誤的是_（A.原代培養得到的細胞也可以是細胞系B.細胞株是特殊的細胞系C連續細胞 系都獲得了不死性D.連續細胞系不一定都發生了轉化）。小凰直纖 扎譜基 1 卅縮母細胞H必病注入小鼠悴內19（4）細胞克隆又稱為克隆培養法，

32、它的最主要用途之一就是從普通細胞系中分離出_的突變細胞系。答案（1）細胞增殖CO 培養箱（2）膠原纖維（3）異倍體 D （4）缺乏特殊基因O歸納概括20(1)原代培養、傳代培養含義兩者的界疋原代培從機體取出后立即進行的細胞、組織培嚴格地說，將細胞從一個培養瓶轉移或養養移植到另一個培養瓶就是傳代培養。有傳代培將原代培養細胞分成若干份，接種到若時為了方便，也將取初的右十次傳代歸養干份培養基中，使其繼續生長、繁殖入原代培養范圍(2)細胞株、細胞系種類來源特點細胞系有限細胞系由二倍體細胞傳代培養建成有接觸抑制；不能連續培養連續細胞系由傳代細胞連續培養建成發生了轉化，多數具有異倍體核型； 有些具有異體致

33、瘤性；有些具有不 死性，但不致癌細胞株有限細胞株通過一定的選擇或純化方法，從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊性質的細胞傳代次數有限一般具有恒定染色 體組型、同功酶類 型、病毒敏感性和生 化特性等連續細胞株可連續多次傳代(3)單克隆抗體制備中的兩次篩選項目第一次篩選第二次篩選篩選原因誘導融合后得到多種雜交細胞，另外還 有未融合的細胞由于小鼠在生活中受到多種抗原的刺激，所以經選擇性培養獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞篩選方法用特定的選擇培養基篩選。其中未融合的細胞和同種細胞融合后形成的細胞(“ BB細胞、“瘤瘤”細胞)都會死亡， 只有融合的雜交瘤細胞(“B瘤”細胞)才能生長用多孔培養皿培

34、養，在每個孔中只有一個 雜交瘤細胞的情況下開始克隆化培養和抗 體檢測，經多次篩選得到能產生特異性抗Cy體的細胞群21篩選結果得到雜交瘤細胞得到能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞隨堂自測1W宀世1.(2018 紹興 3 月選考適應性考試)基于哺乳動物細胞表達的基因工程制藥行業在最近10年發展迅速，其中構建穩定表達細胞株是最重要的環節，常見過程為：獲得目的基因T將目的基因導入宿主細胞T初步篩選T擴增T單克隆化T篩選T馴化T工業生產。回答下列問題：(1)_如果該目的基因的序列是未知的，我們可以建立一個 _ ，然后在這里面尋找到要研究的目的基因。為了實現工廠化生產蛋白質類藥物，常用CHOffl胞(中國倉鼠卵

35、巢的成纖維母細胞)作為哺乳動物表達系統的宿主細胞，這種細胞應該具有 _ 能力，從而可以反復傳代使用。/為了得到 CHC 細胞，可以直接將組織從機體中取出后立即進行細胞、組織培養，當細胞從組JFjto*織塊中遷移出來，形成 _ 并增大后，再傳代培養。(3)利用“裹有重組質粒的脂質體與動物細胞融合”、“病毒侵染細胞”是將目的基因導入動物細胞的兩種常用方法， 前者所用的脂質體結構上由 _ 分子構成，后者不能用噬菌體的原因是_(4)_ 對細胞進行單克隆化培養時，培養基中往往需要添加血清、激素、滋養細胞等，這些措 施的目的是_ 。確定生產用的細胞株后， 需要對細胞馴化使其適應生產規模下的培養條件,工業生

36、產使用的22培養基大多是無血清培養基，這對生物制品的好處有答案（1）基因文庫（2）無限增殖（不死性）生長暈（3）雙層磷脂噬菌體不能侵染動物細胞（4）提高細胞克隆形成率有利于生物制品的純化（提取的基因表達產物純度高）2.（2018 浙江新高考研究聯盟）青蒿素是從黃花蒿莖葉中提取的抗瘧疾藥物。通過組織培養獲得青蒿素的途徑如圖所示。請回答：（1）圖中和分別表示黃花蒿組織培養過程中細胞的 _ 和_ 過程。配制生芽培養基時生長素比細胞分裂素的比值應較 _ （填“高”或“低”）。配制培養基時通常加入凝固劑 _ 。配制后還須用_ 法對培養基進行滅菌。外植體在接種前通常可用體積分數為 _ 的酒精進行消毒。（3

37、）為了得到高產細胞系，通常要用酶解法獲得原生質體，用_酶和_ 酶在0.50.6 mol/L 的_ 溶液環境（較高滲透壓）下去壁。科研人員利用轉基因技術用細菌作為工程菌獲得青蒿素的前體青蒿酸。先將目的基因與含有抗青霉素基因的質粒形成 _,再與細菌菌液混合導入目的基因。 用玻璃刮刀將稀釋后的菌液用 _ 法接種到含 _ 的固體培養基上，經培養形成 _,再進一步篩選和培養。若最終能從細菌中提取到 _ 則說明轉基因成功。答案（1）脫分化再分化 （2）低瓊脂高壓蒸汽滅菌法70% （3）果膠纖維素甘露醇（4）重組質粒（重組 DNA 分子）涂布青霉素單菌落青蒿酸3.（2017 嘉興 9 月選考模擬）下圖表示細

38、胞融合技術的部分過程，請回答:23（1）若甲、乙細胞是植物細胞，在細胞融合時，首先需將_消化除去。獲得的丁細胞24在植物組織培養時通過平衡 _ 配比進行調控，從而實現植物器官、組織的發生和形態建成。（2）若該過程是制備癌胚抗原單克隆抗體的部分過程，實驗中首先將_ 注入小鼠體內，然后從產生免疫反應的小鼠脾臟中獲取經免疫的 _細胞，將其與骨髓瘤細胞融合， 篩選出_細胞。若甲、乙細胞到丙細胞過程是哺乳動物體外受精過程，甲、乙細胞能夠結合的基礎是細胞膜表面有特異性_ 功能的蛋白。若丁細胞為囊胚的外表扁平細胞，由其組成的結構 一稱為_。jifVXu,答案（1）細胞壁植物激素（2）癌胚抗原 B 淋巴雜交瘤

39、（3）識別滋養層猱后限時訓竦限討演給丸加（時間：30 分鐘）一、選擇題1限制性核酸內切酶Muni和限制性核酸內切酶EcoRI 的識別序列及切割位點分別是A .AATT和一&AATTG-。如圖表示四種質粒和目的基因，其中，箭頭所指部位為限制性核酸內切酶的識別位點，質粒的陰影部分表示標記基因。下列質粒適于作為圖示目的基因載體的是（）旦的描因不適合作為載體；質粒和的標記基因上都有限制性核酸內切酶的識別位點。只有質粒上既有標記基因，且 上。答案 A2.如圖是表達新基因用的質粒的示意圖，若要將目的基因插入到質粒上的A 處，則切割基因時可用的是（）Muni的切割點不在標記基因CtTAAGGAA !

40、 1CC.ITAACGAA TIC含目的皐閃的 DN 為片段解析 由圖可知，質粒上無標記基因，25A.Hind 川C.EcoB解析 A 處有BanHI、EcoB、ClaI限制性核酸內切酶的切點，使用AD 中的EcoB 切割時，才能讓目的基因插入到 A 處。答案 C3. 下列有關克隆技術的敘述正確的是（）A. 動物細胞培養時，保留接觸抑制的連續細胞系獲得不死性，但不致癌B. 由于植物細胞具有全能性，水稻等在多次傳代培養后，細胞全能性的表達能力不變C. 從個體中分離出單個組織進行培養是細胞克隆最基本要求D. 原生質體的獲取需在較低滲透壓的環境下進行解析細胞多次傳代培養后，細胞全能性的表達能力降低；

41、從個體中分離出單個細胞或多個 分離的細胞進行培養是細胞克隆最基本要求；原生質體的獲取需在較高滲透壓的環境下進 行。答案 A4. 下列關于動物細胞培養的敘述，正確的是（）A. 培養保留接觸抑制的細胞在培養瓶壁上可形成多層細胞B. 克隆培養法培養過程中多數細胞的基因型會發生改變C. 二倍體細胞的傳代培養次數通常是無限的D. 惡性細胞系的細胞可進行傳代培養解析 動物細胞在培養過程中有接觸抑制現象，細胞在培養瓶中會貼壁生長， 形成一層細胞，相互接觸后停止生長；克隆培養法培養過程中，僅有極少數細胞的基因型會發生改變；二倍體細胞的傳代培養一般傳至10 代后就不易傳下去了；惡性細胞系的細胞具有不死性，可以進

42、行傳代培養。答案 D二、非選擇題5.新一代基因編輯工具由Cas9（ 種限制性核酸內切酶）和向導 RNA構成。該復合體能與DNA 分子上的特定序列結合，并在合適位點切斷DNA 雙鏈（如下圖所示）。DNA 被切斷后,細胞會啟動 DNA 損傷修復機制，在此基礎上如果為細胞提供一個修復模板，細胞就會按照 提供的模板26在修復過程中引入片段插入或定點突變，從而實現基因編輯。7 CasO 向導 RNA HLH 基閔紅 1 DNA切點-請回答：（1）在將編碼 Cas9的基因導入真核細胞的轉基因操作中，若控制合成Cas9 的基因序列已知，可用_方法合成目的基因， 再構建_導入真核細胞，該過程中需要使用的酶是_

43、（A.限制性核酸內切酶B.DNA 連接酶 C.限制性核酸內切酶和 DNA 連接酶 D.DNA 聚合酶）。上述轉基因操作成功的標志是。（2）如圖所示，基因編輯工具發揮作用時，向導RNA 分子的序列與基因組 DNA 中特定堿基序列因為 _所以能結合在一起， 然后由 Cas9 催化_ 鍵斷裂，從而使 DNA分子斷裂。（3）一般來說， 在使用基因編輯工具對不同基因進行編輯時，應使用Cas9 和_（填“相同”或“不同”）的向導 RNA 進行基因的相關編輯。（4）_ 通過上述介紹， 你認為基于 Cas9 系統的基因編輯技術在_ 等方面有廣闊的應用前景。（至少答出兩點）解析 若目的基因序列已知，可用化學方法

44、合成目的基因，再利用限制性核酸內切酶和DNA 連接酶構建含目的基因的重組DNA 分子，然后導入受體細胞。 轉基因操作成功的標志是目的基因成功表達獲得目的基因的表達產物。如題圖所示，Cas9 系統發揮作用時，向導 RNA 分子的序列與基因組 DNA 中特定堿基序列 因為堿基序列互補所以能結合在一起。要使DNA 分子斷裂，需要由 Cas9 催化脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵水解。（3）根據堿基互補配對原則，在使用Cas9 系統對不同基因進行編輯時，應使用Cas9 和不同的向導 RNA 進行基因的相關編輯答案（1）化學 含目的基因的重組DNA 分子 C 控制 Cas9 的基因成功表達（或合成了27Cas

45、9） （2）堿基序列互補磷酸二酯（3）不同（4）基因治療、基因水平進行動植物的育28種、研究基因的功能等（合理即可）6.研究人員將抗蟲基因（SCK 基因）導入水稻培育抗蟲轉基因水稻，在該工程中所用的基因“剪刀”能識別的序列是一 GGATC，切點在 GG 之間。同時卡那霉素抗性基因（ka nr）常作為標記基因，只有含卡那霉素抗性基因的細胞才能在卡那霉素培養基上生長。下面為培育轉 基因水稻過程示意圖，請回答:抗蟲矗闔蟲紐Ti訪粒的磺抨藺開花后水強加人蟻非皋丿篩選培春（1）畫出質粒的切割點被切割后形成的粘性末端的示意圖（2）_ 培養基 2 除含有必要營養物質、激素外，還必須加入 _。（3）某些抗蟲植

46、株體細胞含兩個SCK 基因， 假設這兩個基因在染色體上隨機整合，出現如下圖所示三種情況。屮乙甲圖個體自交，Fi中抗蟲植株和非抗蟲植株之間的比例為 _，乙圖個體自交，子代中抗蟲植株和非抗蟲植株之間的比例為 _，丙圖個體自交，Fi中抗蟲植株和非抗蟲植株之間的比例為_ 。解析 甲圖植株相當于是 SCK 基因純合子，其產生的配子均含有 SCK 基因；乙圖植株相當于 是 SCK基因雜合子，其產生的配子中有 1/2 含有 SCK 基因；丙圖植株相當于是 SCK 基因雜合 子，其產生的配子中有 3/4 含有 SCK 基因。答案GGATC GGATC-CCTAGG CCTAG G29卡那霉素（3）1：03：1

47、15：17.人的血清白蛋白在臨床上需求量很大，通常從人血中提取。由于艾滋病病毒（HIV）等人類感染性病原體造成的威脅與日俱增，使人們對血液制品顧慮重重。如果將人的血清白蛋白基30因導入奶牛細胞中，那么利用牛的乳汁來生產血清白蛋白就成為可能。大致過程如下:a. 將人的血清白蛋白基因導入雌奶牛胚胎細胞，形成重組細胞；b. 取出重組細胞的細胞核，注入牛去核卵細胞中形成重組細胞；c. 電脈沖刺激重組細胞，促使其形成早期胚胎；d. 將胚胎移植到母牛的子宮中，最終發育成轉基因小牛。重組細胞的獲得是利用了 _技術，它實現了奶牛胚胎細胞中的DNA 與_的重組。（2）重組細胞的獲得是利用了克隆技術中的 _ 技術

48、，使重組細胞的細胞核與牛的A ._融合。由圖可知，動物克隆技術的基礎是_ _ （A.動物細胞融合B.動物細胞的全能性C.動物細胞和組織培養D.核移植）。（4）利用轉基因牛乳汁提取藥物工藝簡單，甚至可直接飲用治病。如果將藥物蛋白基因移到 動物（如牛）的膀胱上皮細胞中，利用轉基因牛的尿液生產提取藥物比乳汁提取藥物的更大優關系的是 _ （A.細胞全能性的揭示B.噬菌體的研究C.細胞周期調節控制機理的分析 D.對癌變機理和衰老原因的研究）。解析（1）基因工程可將目的基因一一人的血清白蛋白基因與受體細胞牛胚胎細胞的DNA 進行重組。（2）克隆技術中的細胞核移植技術可將去核的牛卵細胞與含有目的基因的供體細

49、胞核融合構建重組細胞。（4）建立膀胱生物反應器的好處是可以不分動物的性別及不同生長 發育期，越性是：_ 込_（5）重組細胞培養成早期胚胎利用了動物細胞培養技術。下列與動物細胞培養技術無密切31均可產生所需藥物。（5）噬菌體是細菌病毒，無細胞結構， A、C、D 項所述的內容都與細胞培養技術密不可分。答案（1）基因工程人的血清白蛋白基因（2）核移植 去核卵細胞（3）C（4）處于不同發育時期的動物都可生產雌性和雄性動物都可生產（5）B8.鼠源單克隆抗體用于疾病的治療時，易發生不良反應，科學家通過對鼠和人控制抗體產生的基因進行拼接，實現了對鼠源單克隆抗體的改造，生產出對人體不良反應小、效果更好的單克隆

50、抗體。請回答：（1）_ 鼠源單克隆抗體是將經過免疫的小鼠細胞與骨髓瘤細胞融合，然后篩選出_ 的雜交瘤細胞，并通過體內或體外培 養生產的抗體。（2）_ 動物細胞融合常用等物質介導， 細胞融合體現了細胞膜的_。在體外培養雜交瘤細胞時， 為提高細胞克隆形成率， 可采取的措施有（A.添加生長素B.添加甘露醇C.添加胰島素 D.添加胎牛血清）。（3）_ 單抗比一般抗血清優越得多，原因是 _ 基因拼接用到的工具酶有 _ 和_答案（1）B 淋巴 既能無限增殖，又能產生特異抗體（2）滅活的仙臺病毒、聚乙二醇流動性 CD （3） 一般抗血清中的抗體是一群識別不同抗原部位的抗體混合物，而單抗單一，識別抗原部位具有專一性（4）限制性核酸內切酶DNA 連接酶9.下圖為科學家利用轉基因技術培育抗病番茄植株過程的示意圖，請回答以下問題:32（1）_ 圖中所選的 Ti 質粒中往往需含有（A.抗蟲 B.胰島素 C.抗生素抗性 D.抗凍）基因，有利于重組質粒的篩選。 A 過程中常用的酶有 _。（2）B 過程中常用氯化鈣處理，_ 其目的是, C 過程中為篩選含重組質粒的農桿菌，需要對農桿菌進行分離培